Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 y 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 y 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), Redoxoma NAP (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) y CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. f. Oliveira y A. A. F. Oliveira recibieron becas de FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) y CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível superior). M. h. g. Medeiros, P. di Mascio, p. h. n. Saldiva, y A. p. m. Loureiro recibieron becas de CNPq.
Algunas figuras y tablas presentes en esta obra fueron publicadas originalmente en Oliveira A.A.F. et al. efectos genotóxicos y epigenotóxicos en ratones expuestos a partículas finas ambientales concentradas (PM2,5) de la ciudad de São Paulo, Brasil. De partículas y de fibra toxicológica. 15, 40 (2018).

Ratones a/J masculinos de cuatro semanas de edad, libres de patógenos específicos, se obtuvieron del centro de cría de animales de laboratorio de la Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Río de Janeiro, Brasil, y fueron tratados en consecuencia al Comité ético de la Facultad de medicina, Universidad de São Paulo (Protocolo no 1310/09).
1. recolección de los tejidos de ratones
<ol><li>Anestesiar el animal con xilazina y ketamina. Para un ratón con 30 g de peso corporal, inyec...

Un problema importante que se encuentra en los análisis de 8-oxodguo por métodos de HPLC es la posible inducción de su formación durante los procedimientos de trabajo de extracción de ADN, hidrólisis de ADN, y la concentración de ADN hidrolizados22,38. Con el fin de minimizar el problema de la formación artística de 8-oxodGuo, se recomienda la adición de deferoxamina a todas las soluciones de extracción de ADN, almacenamiento e hidrólisis, el uso del ...

Algunas especies reactivas de oxígeno (ROS) son capaces de oxidar enlaces dobles de carbono de bases de ADN y algunos carbonos en la fracción desoxirribosa, generando bases oxidadas y roturas de hebras de ADN1. Como una molécula cargada negativamente rica en átomos de nitrógeno y oxígeno, el ADN es también un objetivo para los grupos electrófilos que reaccionan covalentemente con los sitios nucleófilos (nitrógeno y oxígeno), dando productos que se denominan aductos de ADN2. Por lo tanto, los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos sobre la biotransformación, o inducen el estrés oxidativo1, 2. Aunque las bases de ADN modificadas se pueden eliminar del ADN por la reparación de la escisión de base o nucleótido (BER o NER), la inducción de un desequilibrio entre la generación y la eliminación de las lesiones de ADN en favor de la primera conduce a un aumento neto de sus niveles en el ADN horas extras3 < /C5 >. Los resultados son el aumento de las tasas de mutación del ADN, la reducción de la expresión génica y la disminución de la actividad proteica2,4,5,6,7, efectos estrechamente relacionados con el desarrollo de enfermedades. Las mutaciones de ADN pueden afectar diversas funciones celulares, como la señalización celular, el ciclo celular, la integridad del genoma, la estabilidad del telómero, el epigenoma, la estructura de la cromatina, el empalme de ARN, la homeostasis proteica, el metabolismo, la apoptosis y la diferenciación celular8 ,9. Las estrategias para ralentizar las tasas de mutación celular y el desarrollo de enfermedades crónicas (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas) pasan por el conocimiento de las fuentes de mutación, entre ellas, las lesiones de ADN y sus causas.
Los ROS generados endógenamente en exceso, debido a la exposición a los contaminantes, la inflamación persistente, la fisiopatología de la enfermedad (p. ej., diabetes), etc., son causas importantes del daño de la biomolécula, incluyendo el ADN y el daño lipídico1. Por ejemplo, el radical hidroxilo altamente reactivo (OH) formado a partir de la reducción de H2O2 por iones metálicos de transición (fe2 +, cu+) oxida las bases de ADN, la fracción de azúcar de ADN y los ácidos grasos poliinsaturados en la difusión controlada tarifas10. Entre las 80 nucleobasas oxidadas ya caracterizadas3, el más estudiado es 8-oxo-7, 8-dihydroguanine (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8-oxodGuo, figura 1), una lesión que es capaz de inducir transversiones gt en células de mamíferos10,11. Se forma por la oxidación electrónica mono de guanina, o por el ataque de oxígeno de la guanina a radical hidroxilo o singlete en el ADN1. Los ácidos grasos poliinsaturados son otros objetivos importantes de los oxidantes altamente reactivos, tales como •Oh, que inician el proceso de peroxidación lipídica1,12. Da lugar a hidroperóxidos de ácidos grasos que pueden descomponerse a aldehídos electrófilos y epoxialdehídos, tales como malondialdehído, 4-hidroxi-2-Nonenal, 2,4-Decadienal, 4, 5-epoxi-(2E)-decenal, hexenal, Acrolein, Crotonaldehído, que son puede formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como malondialdehído-, propano-, o los aductos de etheno1,12,13. Los aductos de etheno 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo , figura 1) y 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado, figura 1 ) se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Figura 1. Estructuras químicas de las lesiones de ADN cuantificadas en el presente estudio. dR = 2 ́-desoxiribosa. Esta cifra ha sido modificada de Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los estudios realizados a comienzos de la década de 1980 permitieron la detección sensible de 8-oxodGuo por cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a la detección electroquímica (HPLC-ECD). La cuantificación de 8-oxodguo por HPLC-ECD en varios sistemas biológicos sometidos a condiciones oxidantes condujo al reconocimiento de 8-oxodguo como un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN1,16. Aunque son robustos y permiten la cuantificación de 8-oxodGuo en la gama baja de fmol17, las mediciones de HPLC-ECD se basan en la precisión del tiempo de retención del analito para la identificación del analito y en la resolución de la cromatografía para evitar interferencias de otros componentes de la muestra. Como la detección electroquímica requiere el uso de sal (por ejemplo, fosfato de potasio, acetato de sodio) en la fase móvil, el mantenimiento de condiciones analíticas adecuadas necesita tiempo de limpieza de columna y equipo de rutina.
Alternativamente, el uso de la enzima de reparación de ADN bacteriológico formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) y, después, 8-oxoguanina glucosilasa 1 (hOGG1), para la detección y eliminación de 8-oxogua de ADN, surgió como una manera de la inducción de ADN alcalino lábil Sitios. Los sitios del lábil alcalino se convierten en roturas de la hebra de ADN y permiten la cuantificación indirecta muy alta sensible de 8-oxogua por electroforesis de gel de una sola célula alcalina ("ensayo de cometa"). La alta sensibilidad y la realización de los análisis sin necesidad de extracción de ADN celular son las principales ventajas de este tipo de ensayo. Da los niveles de estado estacionario más bajos de 8-oxoGua en el ADN, típicamente 7-10 veces más bajo que los niveles obtenidos por métodos bioanalíticos basados en HPLC. Sin embargo, es una medida indirecta de 8-oxogua y algunos inconvenientes son la falta de especificidad o la eficiencia desconocida de las enzimas de reparación utilizadas1,16,18.
Los inmunoensayos son otro conjunto de métodos utilizados para la detección de aductos de ADN 8-oxoGua1 y exocíclico, tales como 1,n6-dado y 1,n2-dguo12. A pesar de la sensibilidad, una deficiencia del uso de anticuerpos para la detección de lesiones de ADN es la falta de especificidad debido a la reactividad cruzada a otros componentes de muestras biológicas, incluyendo las bases de ADN normales1,12. Los aductos de ADN exocíclico, incluyendo 1,n6-DAdo y 1,n2-dguo, también pueden ser detectados y cuantificados por los ensayos altamente sensibles de 32P-postetiquetado12. La alta sensibilidad de 32P-el etiquetado posterior permite el uso de cantidades muy pequeñas de ADN (por ejemplo, 10 μg) para la detección de aproximadamente 1 aducto por 1010 bases normales19. Sin embargo, el uso de radioquímicos, la falta de especificidad química y la baja precisión son algunas desventajas19,20.
Una limitación compartida de los métodos citados anteriormente es la baja selectividad o especificidad para la detección de las moléculas deseadas. En este escenario, la HPLC acoplada a la espectrometría de masas tándem de ionización electrospray (HPLC-ESI-MS/MS y HPLC-MS3) evolucionó como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva 1 , 19 , 20. las ventajas de los métodos HPLC-ESI-MS/MS son la sensibilidad (típicamente en la gama baja de fmol) y la alta especificidad proporcionada por i) la separación cromatográfica, II) el patrón característico y conocido de fragmentación molecular dentro de la masa cámara de colisión espectrómetro, y III) la medición precisa de la relación masa a carga seleccionada (m/z) en el modo de monitorización de reacción múltiple1,19. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente1,12,19,20.
Se han utilizado varios métodos basados en HPLC-ESI-MS/MS para la cuantificación de 8-oxodguo, 1, N6-dado y 1,n2-dguo en el ADN extraído de diferentes muestras biológicas12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Las partículas finas (PM2,5) transportan productos químicos orgánicos e inorgánicos, tales como hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), Nitro-PAHS, aldehídos, cetonas, ácidos Carboxilicos, quinolinas, metales y iones solubles en agua, que pueden inducir inflamación y estrés oxidativo, condiciones que favorecen la ocurrencia de daño biomolecular y enfermedad30,31,32,33. Aquí presentamos métodos validados de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo y 1,N2-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de la efectos de la exposición ambiental PM2,5 34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

Los aductos de ADN y las bases de ADN oxidado son ejemplos de lesiones de ADN que son biomarcadores útiles para la evaluación de la toxicidad de sustancias que son electrofilicas, generan electrófilos reactivos a la biotransformación o inducen estrés oxidativo. Entre las nucleobasas oxidadas, la más estudiada es la 8-oxo-7,8-dihidroguanina (8-oxoGua) o 8-oxo-7,8-dihydro-2'-desoxyguanosine (8-oxodGuo), un biomarcador de daño base inducido oxidativamente en el ADN. Los aldehídos y los epoxialdehídos resultantes del proceso de peroxidación lipídica son moléculas electrofílicas capaces de formar aductos de ADN exocíclico mutagénico, tales como los aductos de etheno 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2- εdGuo) y 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado), que se han sugerido como biomarcadores potenciales en la fisiopatología de la inflamación. Los métodos selectivos y sensibles para su cuantificación en el ADN son necesarios para el desarrollo de estrategias preventivas que ralentizan las tasas de mutación celular y el desarrollo crónico de la enfermedad (p. ej., cáncer, enfermedades neurodegenerativas). Entre los métodos sensibles disponibles para su detección (cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a detectores de espectrometría de masas en tándem o electroquímico, ensayo de cometas, inmunoensayos, 32P-etiquetado posterior), los más selectivos son los basados en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas tándem (HPLC-ESI-MS/MS). La selectividad es una ventaja esencial al analizar muestras biológicas complejas y HPLC-ESI-MS/MS evolucionada como el estándar de oro para la cuantificación de nucleósidos modificados en matrices biológicas, como el ADN, la orina, el plasma y la saliva. El uso de estándares internos etiquetados isotópicamente añade la ventaja de las correcciones para las pérdidas de moléculas durante la hidrólisis del ADN y los pasos de enriquecimiento del analito, así como para las diferencias de la ionización del analito entre las muestras. También ayuda en la identificación del pico cromatográfico correcto cuando hay más de un pico presente.
Presentamos aquí métodos validados, precisos y precisos de HPLC-ESI-MS/MS que se aplicaron con éxito para la cuantificación de 8-oxodGuo, 1,N6-DAdo y 1,n2-dguo en pulmón, hígado y ADN renal de ratones A/J para la evaluación de los efectos de la exposición ambiental PM2,5 .

Las concentraciones medias de ADN (± SD) obtenidas a partir de ratones hígado (~ 1 g de tejido), pulmón (~ 0,2 g de tejido) y riñón (~ 0,4 g de tejido) fueron, respectivamente, 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 y 3.223 ± 723 μg/mL en el volumen final de 200 μL. En la figura 3se muestra un cromatograma representativo obtenido por HPLC-DAD del ADN purificado. La presencia de los cuatro 2 '-desoxinucleósidos, libre del ARN ribonucleósidos, que eluye inmed...

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Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Cuantificación de tres lesiones de ADN por espectrometría de masas y evaluación de sus niveles en los tejidos de los ratones expuestos a la materia particulada fina ambiental

Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-dado) y 1,n2- etheno-2'-desoxyguanosine (1,N2-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Los métodos presentados aquí permiten la cuantificación de las lesiones del ADN inducidas por el estrés oxidativo, contribuyendo a la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos que pueden ser objetivo para la prevención y el tratamiento de enfermedades. La selectividad y la sensibilidad son las principales ventajas. La selectividad es una ventaja esencial cuando se trabaja con muestras biológicas complejas.HPLC acoplado a espectrometría de masas en tándem evolucionó como el estándar de oro para este tipo de cuantificación con matrices biológicas. El estrés oxidativo es un evento común a diferentes procesos fisiopatológicos. Aumento de los niveles de aductos etheno se han detectado en los tejidos u orina de pacientes con enfermedades inflamatorias.Las lesiones de ADN también proporcionan información sobre eventos endógenos desencadenados por la exposición a contaminantes. Si las lesiones de ADN aumentan, la exposición puede estar en el nivel que aumenta el riesgo de desarrollo del cáncer, por ejemplo. Las lesiones se pueden cuantificar en el ADN de cualquier sistema celular y alternativamente en orina, plasma, medio de cultivo de saliva con adaptaciones en la preparación de la muestra.Para comenzar, usa una placa de cultivo colocada sobre hielo como base para cortar un pedazo de tejido con un bisturí. Pesar un gramo del tejido en cada tubo tapado de 50 mililitros para su uso inmediato. Mantenga el tejido restante sobre hielo seco antes de almacenarlo a menos 80 grados centígrados.A cada tubo, agregue 10 mililitros de la solución de lelisis de células comerciales que contengan deferoxamina de 0,5 milivolares y manténgalo en hielo. Ajuste el homogeneizador de tejido a una velocidad baja, alrededor de 60 a 90 rpm. Homogeneizar los tejidos sobre hielo durante unos minutos hasta que la solución esté sin fragmentos de tejido.A continuación, añadir 150 microlitros de solución de proteinasa K a cada muestra homogeneizada. Agitar los tubos por inversión, y mantenerlos a temperatura ambiente durante la noche. Por la mañana, añadir 40 microlitros de ribonucleasa Una solución, agitar por inversión y mantener los tubos a temperatura ambiente durante dos horas.Añadir cinco mililitros de solución comercial de precipitación proteica, vórtice vigorosamente, y centrifugar a 2.000 veces g, cuatro grados centígrados, durante 10 minutos. Transfiera los sobrenadantes a tubos tapados de 50 mililitros que contengan 10 mililitros de isopropanol frío. Invierta los tubos suavemente varias veces hasta la observación del ADN precipitado.Utilice una pipeta Pasteur cerrada al final para recoger el ADN precipitado. Transfiera el ADN recogido a tubos que contengan cuatro mililitros de tampón Tris de 10 mililitrolares y deferoxamina de un milimolar a pH siete para disolverse. Después de que el ADN se disuelva por completo en los tubos, añada cuatro mililitros de una solución de cloroformo que contenga 4%alcohol isoamilo a cada tubo.Invertir los tubos 10 veces para la homogeneización, centrifugar a 2.000 veces g, cuatro grados Celsius, durante 10 minutos, y transferir las fases superiores a nuevos tubos. Repita el lavado de la fase superior con la solución de cloroformo dos veces más. A continuación, agregue ocho mililitros de etanol absoluto y 0,4 mililitros de una solución de cloruro sódico de cinco molares para precipitar el ADN.Una vez más, recoger el ADN precipitado, y transferirlo a tres mililitros de 70%etanol. Repita el lavado con 70% de etanol una vez más. Deseche la solución de etanol con precaución e invierta los tubos que contienen el ADN precipitado en papel absorbente para eliminar el exceso de solución.Después de preparar muestras de hidrólisis de ADN con estándar isotópico 15N5 de 1, N6-etheno-deoxyadenosina y 15N5 estándar isotópico de 1, N2-etheno-deoxyguanosina según el manuscrito, transferir 10 microlitros de cada muestra en tubos para la cuantificación de desoxnucleósidos normales por HPLC-UV. Somete el volumen residual a la extracción en fase sólida. Para realizar HPLC, primero ele una columna C18 unida a un cartucho C18 SecurityGuard con un gradiente de 0.1% de ácido fórmico y metanol.Configure el programa de gradiente para que se ejecute de cero a 25 minutos con cero a 18%metanol, de 25 a 27 minutos con 18 a 0%metanol, luego de 27 a 37 minutos con 0%metanol a un caudal de un mililitro por minuto y 30 grados Celsius. Después de eso, inyecte un volumen entre dos y seis microlitros para cada muestra reservada para la cuantificación normal de desoxigenósidos. Ajuste el detector DAD en 260 nanómetros para la integración de los picos de desoxiguanosina y desoxianosina.Para realizar la extracción en fase sólida para análisis de 1, N6-etheno-deoxyadenosine y 1, N2-etheno-deoxyguanosine, primero cargue los cartuchos con una serie de soluciones a un volumen de un mililitro. Añadir 100%metanol, agua desionizada, muestra de ADN hidrolizado, agua desionizada, 10%metanol, 15%metanol, y por último 100%metanol para la recolección. A continuación, proceda de acuerdo con el manuscrito.Después de preparar muestras de hidrólisis de ADN 15N5 isotopic estándar de 8-oxo-deoxyguanosina, transferir 80 microlitros de cada muestra a viales para su análisis en el sistema HPLC-ESI-MS/MS. Reservar los 20 microlitros restantes para la cuantificación de la desoxiguanosina en HPLC-UV, como se hizo anteriormente. Para el análisis de 8-oxo-desoxiguanosina en HPLC-ESI-MS/MS, eluía la columna C18 A acoplada a un cartucho C18 SecurityGuard con un gradiente de disolvente A y B a un caudal de 150 microlitros por minuto y 25 grados Celsius.Ejecute la bomba binaria con un cero a 15% del disolvente B durante los primeros 25 minutos, entre el 15 y el 80% del disolvente B de 25 a 28 minutos, el 80% del disolvente B de 28 a 31 minutos, el 80 al 0% del disolvente B de 31 a 33 minutos y el 0% del disolvente B de 33 a 46 minutos. Dirija los primeros 16 minutos de la columna A eluyente a desperdiciar. Condicione la columna B por la bomba isocrática con una solución de 15%metanol en agua que contenga 0,1% de ácido fórmico a un caudal de 150 microlitros por minuto.Después de seis minutos, revise el cromatograma para asegurarse de que el uno estándar 8-oxo-deoxyguanosina de la columna A.Durante el intervalo de 16 a 32 minutos, cambie la válvula a la posición que permita la conexión entre la columna A y la columna B.Cierre la válvula a los 32 minutos para elir 8-oxo-desoxiguanosina de la segunda columna y obtener un pico cromatográfico nítido. Para el análisis de 1, N6-etheno-deoxyadenosina y 1, N2-etheno-deoxyguanosina, ele una columna C18 acoplada a un cartucho C18 SecurityGuard con un gradiente de disolvente A y B a un caudal de 130 microlitros por minuto y 25 grados Celsius. Ejecute la bomba binaria con 0% del disolvente B durante los primeros 10 minutos, cero a 20% del disolvente B durante 10 a 39 minutos, 20 a 75% del disolvente B de 39 a 41 minutos, 75% del disolvente B de 41 a 46 minutos, 75 a 0% del disolvente B de 46 a 47 minutos, y 0% del disolvente B de 47 a 60 minutos.Utilice la válvula de conmutación para dirigir los primeros 35 minutos de eluyente a residuos y la fracción de 35 a 42 minutos a la fuente ESI. Asegúrese de que las normas de aducto se eluden de la columna en el intervalo establecido. Integrar los picos de 8-oxo-deoxyguanosina 15N5 estándar isotópico de 8-oxo-desoxiguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosina, 15N5 isotopic estándar de 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine, y 15N5 isotopic estándar de 1, N2-etheno-deoxyguanosine de los análisis HPLC-ESI-MS/MS.Calcule las relaciones de área para las curvas de calibración y las muestras. Establezca las curvas de calibración y calcule las cantidades de lesiones en cada muestra inyectada. Integrar los picos de desoxiguanosina y desoxianosina a partir de los análisis HPLC-UV.Utilice las áreas para establecer las curvas de calibración y calcular las cantidades de desoxiguanosina y desoxiaadenosina en animales en cada muestra inyectada. Calcular las fracciones molares para 8-oxo-deoxyguanosina sobre desoxiguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosina sobre desoxiaadenosina, y 1, N2-etheno-deoxyguanosina sobre desoxiguanosina, que dan el número de lesiones por un millón de desoxianosina normal o desoxiaadenosina. Un cromatograma representativo del ADN purificado obtenido por HPLC-UV muestra la presencia de los cuatro desoxigenósidos normales, libres de los ribonucleósidos del ARN, demostrando la pureza del ADN.Se muestran cromatogramas representativos de HPLC-ESI-MS/MS de 8-oxo-deoxyguanosina, 1, N6-etheno-deoxyadenosine, y 1, N2-etheno-deoxyguanosina en muestras de ADN de tejido en ratones. El cromatograma obtenido con detección UV muestra los cuatro desoxinucleósidos normales eluidos desde la primera columna hasta unos 10 minutos, con una buena separación de 8-oxo-desoxiguanosina, eliminando las interferencias no deseadas. Una cosa importante a recordar para las cuantificaciones exactas es tener siempre las mismas cantidades de estándares internos en el volumen de inyección en las curvas de calibración y muestras.Los métodos presentados aquí pueden adaptarse para la cuantificación de otros desoxinucleósidos modificados. La ampliación de la banda de desoxnucleósidos modificados permite una mejor comprensión de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Podemos investigar el papel del daño oxidativo en diferentes situaciones como la exposición a xenobióticos, diabetes y transformación maligna celular, ayudando así al desarrollo de estrategias preventivas y de tratamiento.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Asistida por microondas diagnóstico rápido de enfermedades de virus de plantas por microscopía electrónica de transmisión

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Investigación

Inmunología e Infección

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

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Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

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This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

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