Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 och 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 och 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de pesquisa da Universidade de São Paulo), INCT INAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), INCT Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) och CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira och A. A. F. Oliveira erhöll stipendier från FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) och CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior). M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva och A. P. M. Loureiro mottog stipendier från CNPq.
Några siffror och tabeller som finns i detta arbete publicerades ursprungligen i Oliveira A.A.F. et al. genotoxiska och epigenotoxiska effekter hos möss som exponerats för koncentrerade omgivande fina partiklar (PM2,5) från São Paulo City, Brasilien. Partikel-och Fibertoxikologi. 15, 40 (2018).

Fyra veckors gamla manliga A/J-möss, specifik patogen fri, erhölls från avel centrum för försöks djur av Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Rio de Janeiro, Brasilien, och behandlades därefter till etik kommittén för medicinska fakulteten, universitet av São Paulo (protokoll no 1310/09).
1. insamling av möss vävnader
<ol><li>Anesthetize djuret med xylazin och Ketamin. För en mus med 30 g kropps vikt, injicera en lösning (högst 2 mL) som innehåller 2,63 mg Ketamin oc...

Ett stort problem som finns i 8-oxodguo analyser av HPLC metoder är en möjlig induktion av dess bildande under workup förfaranden för DNA-extraktion, DNA hydrolys, och koncentrationen av DNA-hydrolysater22,38. För att minimera problemet med 8-oxodGuo artifaktuella formation, rekommenderas tillsats av Deferoxamin till alla DNA-extraktion, lagring och hydrolys lösningar, användning av natriumjodid chaotropic metod och undvikande av fenol i DNA-extraktion, so...

Vissa reaktiva syreradikaler (ROS) kan oxidera kol dubbel bindningar av DNA-baser och vissa kol atomer i deoxyribose del, generera oxiderade baser och DNA strand raster1. Som en negativt laddad molekyl rik på kväve-och syre atomer är DNA också ett mål för elektrofila grupper som kovalent reagerar med de nukleofila platserna (kväve och syre), vilket ger produkter som kallas DNA-addukter2. Så, DNA addukter och oxiderade DNA baser är exempel på DNA-lesioner som är användbara bio markörer för toxicitet bedömning av ämnen som är elektrofila, generera reaktiva elektrophiles på bio Transformation, eller inducera oxidativ stress1, och 2. Även om de modifierade DNA-baser kan avlägsnas från DNA genom bas eller nukleotid excision reparation (BER eller NER), induktion av en obalans mellan generering och avlägsnande av DNA-lesioner till förmån för de förstnämnda leder till en nettoökning av deras nivåer i DNA övertid3 < /C5 >. Resultat är ökningen av DNA-mutations frekvenser, minskat gen uttryck och minskad protein aktivitet2,4,5,6,7, effekter som är nära relaterade till utveckling av sjukdomar. DNA-mutationer kan påverka olika cellulära funktioner, såsom cellsignalering, cell cykel, genom integritet, telomer stabilitet, epigenomet, kromatin struktur, RNA splitsning, protein homeostas, metabolism, apoptos, och cell differentiering8 ,9. Strategier för att bromsa cell mutations frekvenser och kronisk sjukdoms utveckling (t. ex. cancer, neurodegenerativa sjukdomar) passerar genom kunskapen om mutationskällorna, bland dem, DNA-lesioner och deras orsaker.
ROS genereras endogent i överskott, på grund av förorening exponering, ihållande inflammation, sjukdomspatofysiologi (t. ex., diabetes), etc., är viktiga orsaker till bio molekyl ära skador, inklusive DNA och lipid skador1. Som ett exempel, den mycket reaktiva hydroxylradikal (OH) bildas från H2O2 reduktion av över gång metall joner (Fe2 +, cu+) oxiderar DNA baser, DNA-socker delen och fleromättade fett syror vid diffusions-kontrollerad och räntor10. Bland de 80 redan karakteriserade oxiderade nukleobaser3, den mest studerade en är 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxoGua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodGuo, figur 1), en lesion som kan inducera gt transversioner i däggdjurs celler10,11. Det bildas genom mono elektronisk oxidation av guanin, eller genom hydroxylgrupp radikal eller singlet syre attack av guanin i DNA1. Fleromättade fett syror är andra viktiga mål för mycket reaktiva oxidanter, såsom •Oh, som initierar processen för lipidperoxidation1,12. Det ger upphov till fett syra Hydro per oxider som kan sönderdelas till elektrofila aldehyder och epoxyaldehyder, såsom malondialdehyd, 4-hydroxi-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4,5-epoxi-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyd, som kunna bilda mutagena exocykliska DNA-addukter, såsom malondialdehyd-, Propano-, eller etheno addukter1,12,13. Etheno addukter 1,n2-etheno-2 '-deoxyguanosin (1,n2-εdguo, figur 1) och 1,n6-etheno-2 '-Deoxyadenosin (1,n6-εdado, figur 1 ) har föreslagits som potentiella bio markörer i patofysiologin av inflammation14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> I figur 1. Kemiska strukturerna hos de DNA-lesioner som kvantifierats i den här studien. dR = 2 ́-deoxyribose. Denna siffra har ändrats från Oliveira et al.34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Studier som genomfördes i början av 1980-talet tillät den känsliga upptäckten av 8-oxodGuo av högpresterande vätskekromatografi kopplad till elektrokemisk detektion (HPLC-ECD). Kvantifiering av 8-oxodguo av HPLC-ECD i flera biologiska system utsätts för oxiderande förhållanden ledde till erkännandet av 8-oxodguo som en bio markör av oxidativt inducerad bas skador i DNA1,16. Även om det är robust och gör det möjligt att kvantifiera 8-oxodGuo i det låga fmol-området17, förlitar sig HPLC-ECD-mätningar på noggrannheten hos analytretentions tiden för analytidentifiering och på kromatografiupplösningen för att undvika interferenser av andra prov bestånds delar. Eftersom den elektrokemiska upptäckten kräver användning av salt (t. ex. kalium fosfat, natriumacetat) i den mobila fasen, behöver underhållet av lämpliga analytiska tillstånd rutinmässig kolonn och utrustning rengörings tid.
Alternativt, användning av bakterien DNA reparation enzym formamidopyrimidine DNA glykosylase (FPG) och, efteråt, mänskliga 8-oxoguanin glykosylase 1 (hOGG1), för detektion och avlägsnande av 8-oxogua från DNA, framkom som ett sätt för induktion av DNA alkali labila Platser. De alkalilabila platserna konverteras till DNA-strandbryt och tillåter mycket hög känslig indirekt kvantifiering av 8-oxogua genom alkalisk Single cell gel elektrofores ("kometanalys"). Den höga känsligheten och utförandet av analyserna utan behov av cellulära DNA-extraktion är de främsta fördelarna med denna typ av analys. Det ger den lägsta Steady-State nivåer av 8-oxoGua i DNA, typiskt 7-10 gånger lägre än de nivåer som erhålls genom bio analytiska metoder baserade på HPLC. Det är dock en indirekt mätning av 8-oxogua och vissa nack delar är bristen på specificitet eller den okända effektiviteten i reparera enzymer som används1,16,18.
Immunoassay är andra uppsättning metoder som används för detektion av 8-oxoGua1 och EXOCYKLISKA DNA addukter, såsom 1,n6-Dado och 1,n2-dguo12. Trots känsligheten, en brist på användning av anti kroppar för detektion av DNA-lesioner är bristen på specificitet på grund av korsreaktivitet till andra komponenter i biologiska prover, inklusive de normala DNA-baser1,12. Den exocykliska DNA addukter, inklusive 1,n6-Dado och 1,n2-dguo, kan också upptäckas och kvantifieras av mycket känsliga 32P-postmärkning analyser12. Den höga känsligheten hos 32P-postmärkning gör det möjligt att använda mycket små mängder DNA (t. ex. 10 μg) för detektion av ca 1 ankring per 1010 normal baser19. Emellertid, bruket av Radios ände-kemikalieer, brist av kemisk specificitet och låg exakthet är några missgynnar19,20.
En delad begränsning av de metoder som nämns ovan är den låga selektivitet eller specificitet för detektion av de önskade molekylerna. I det här scenariot utvecklades HPLC kopplat till elektrospray jonisering tandem masspektrometri (HPLC-ESI-MS/MS och HPLC-MS3) som guld standard för kvantifiering av modifierade nukleosidor i biologiska matriser, såsom DNA, urin, plasma och saliv 1 den första , den 19 , 20. fördelar med HPLC-ESI-MS/MS-metoder är känsligheten (vanligt vis i det låga fmol-intervallet) och den höga specificitet som i) den kromatografiska separationen, II) det karakteristiska och kända mönstret av molekylfragmentering i massan spektrometer kollision kammare, och III) exakt mätning av den valda massan att ladda förhållandet (m/z) i flera reaktions övervakning läge1,19. Användningen av isotopiskt märkta interna standarder ger fördelen av korrigeringar för molekyl förluster under DNA hydrolys och analyten anriknings steg, samt för skillnader i analytjonisering mellan proverna. Det hjälper också i identifieringen av den korrekta kromatografiska toppen när mer än en topp är närvarande1,12,19,20.
Flera metoder baserade på HPLC-ESI-MS/MS har använts för kvantifiering av 8-oxodguo, 1,n6-Dado och 1,n2-dguo i DNA som extraherats från olika biologiska prover12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . Fina partiklar (PM2,5) bär organiska och oorganiska kemikalier, såsom polycykliska aromatiska kolväten (PAH), Nitro-PAH, aldehyder, ketoner, karboxylsyror, kinoliner, metaller och vattenlösliga joner, som kan framkalla inflammation och oxidativ stress, förhållanden som gynnar förekomsten av bio molekyl skador och sjukdomar30,31,32,33. Vi presenterar här validerade HPLC-ESI-MS/MS-metoder som framgångs rikt tillämpades för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1,n6-Dado och 1,n2-dguo i lung-, lever-och njure DNA från A/J-möss för bedömning av effekter av ambient PM2,5 exponering34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA-addukter och oxiderade DNA-baser är exempel på DNA-lesioner som är nyttiga bio markörer för toxicitetsbedömningen av substanser som är elektrofila, genererar reaktiva elektrofiler vid bio Transformation eller inducerar oxidativ stress. Bland de oxiderade nukleobaser, den mest studerade en är 8-oxo-7, 8-dihydroguanin (8-oxogua) eller 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodguo), en bio markör av oxidativt inducerad bas skador i DNA. Aldehyder och epoxyaldehyder till följd av lipidperoxidations processen är elektrofila molekyler som kan bilda mutagena exocykliska DNA-addukter, såsom etheno addukter 1,n2-etheno-2 '-deoxyguanosin (1,n2- εdGuo) och 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosin (1,n6-εdado), som har föreslagits som potentiella bio markörer i patofysiologin av inflammation. Selektiva och känsliga metoder för deras kvantifiering i DNA är nödvändiga för att utveckla förebyggande strategier för att bromsa cell mutations frekvenser och kronisk sjukdoms utveckling (t. ex. cancer, neurodegenerativa sjukdomar). Bland de känsliga metoder som finns tillgängliga för deras upptäckt (högpresterande vätskekromatografi kopplad till elektrokemiska eller tandem masspektrometri detektorer, komet analys, immunoassay, 32P-postmärkning), de mest selektiva är de som bygger på hög prestanda vätskekromatografi kopplad till tandem masspektrometri (HPLC-ESI-MS/MS). Selektivitet är en viktig fördel vid analys av komplexa biologiska prover och HPLC-ESI-MS/MS utvecklades som den gyllene standarden för kvantifiering av modifierade nukleosidor i biologiska matriser, såsom DNA, urin, plasma och saliv. Användningen av isotopiskt märkta interna standarder ger fördelen av korrigeringar för molekyl förluster under DNA hydrolys och analyten anriknings steg, samt för skillnader i analytjonisering mellan proverna. Det underlättar också identifieringen av den korrekta kromatografiska toppen när mer än en topp är närvarande.
Vi presenterar här validerade känsliga, exakta och exakta HPLC-ESI-MS/MS-metoder som framgångs rikt tillämpades för kvantifiering av 8-oxodGuo, 1,n6-Dado och 1,n2-dguo i lung-, lever-och njure DNA från A/J-möss för bedömningen av effekterna av den omgivande PM2,5 -exponeringen.

De genomsnittliga DNA-koncentrationerna (± SD) som erhållits från möss lever (~ 1 g vävnad), lunga (~ 0,2 g vävnad) och njure (~ 0,4 g vävnad) var respektive 5 068 ± 2 615, 4 369 ± 1 021, och 3 223 ± 723 μg/mL i den slutliga volymen av 200 μL. Ett representativt kromatogram som erhålls genom HPLC-DAD av det renade DNA visas i figur 3. Närvaron av de fyra 2 '-deoxynucleosides, fri från RNA ribonukleosides, som eluera omedelbart före motsvarande...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Kvantifiering av tre DNA-lesioner med masspektrometri och bedömning av deras nivåer i vävnader från möss som utsätts för omgivande fina partiklar

Vi beskriver här metoder för känslig och noggrann kvantifiering av lesioner 8-oxo-7, 8-dihydro-2 '-deoxyguanosin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2 '-deoxyadenosin (1,n6-Dado) och 1,n2- etheno-2 '-deoxyguanosin (1,N2-DGUO) i DNA. Metoderna tillämpades på bedömningen av effekterna av omgivande fina partiklar (PM2,5) i vävnader (lungor, lever och njure) av exponerade A/J-möss.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

De metoder som presenteras här möjliggör kvantifiering av DNA-lesioner som framkallas av oxidativ stress, vilket bidrar till förståelsen av patofysiologiska mekanismer som kan vara mål för förebyggande och behandling av sjukdomar. Selektivitet och känslighet är de främsta fördelarna. Selektivitet är en väsentlig fördel när man arbetar med komplexa biologiska prover.HPLC kopplade till tandem masspektrometri utvecklats som guldmyntfoten för denna typ av kvantifiering med biologiska matriser. Oxidativ stress är en vanlig händelse för olika patofysiologiska processer. Ökade nivåer av etenoaddukter har påvisats i vävnader eller urin hos patienter med inflammatoriska sjukdomar.DNA-lesionerna ger också information om endogena händelser som utlöses av exponering för föroreningar. Om DNA-lesionerna ökas kan exponeringen vara på den nivå som ökar risken för till exempel cancerutveckling. Lesionerna kan kvantifieras i DNA från alla cellulära system och alternativt i urin, plasma, salivodlingsmedium med anpassningar vid provberedning.Till att börja med använd en odlingsplatta placerad på is som bas för att skära en bit vävnad med en skalpell. Väg ett gram av vävnaden i varje 50-milliliter takrör för omedelbar användning. Håll den återstående vävnaden på torris innan du förvarar vid minus 80 grader Celsius.Till varje rör, tillsätt 10 milliliter av kommersiella cell lyslösning som innehåller 0,5-millimolar deferoxamine, och hålla på is. Ställ in vävnadshomogenatorn på låg hastighet, runt 60 till 90 rpm. Homogenisera vävnaderna på is i några minuter tills lösningen är utan vävnadsfragment.Tillsätt sedan 150 mikroliter av proteinas K-lösning till varje homogeniserat prov. Skaka rören genom inversion, och hålla dem i rumstemperatur över natten. På morgonen, tillsätt 40 mikroliter av ribonukleas En lösning, skaka genom inversion, och hålla rören i rumstemperatur i två timmar.Tillsätt fem milliliter kommersiell proteinfällningslösning, virvel kraftigt och centrifug vid 2, 000 gånger g, fyra grader Celsius, i 10 minuter. Överför supernatanterna till 50-milliliter takrör som innehåller 10 milliliter kall isopropanol. Invertera rören försiktigt flera gånger tills observation av fällt DNA.Använd en Pasteurpipett som är stängd i slutet för att samla in det utfällda DNA. Överför det insamlade DNA:t till rör som innehåller fyra milliliter 10 millimol tris buffert och en millimolar deferoxamin vid pH sju för att lösa upp. Efter att DNA är helt upplöst i rören, tillsätt fyra milliliter av en kloroformlösning som innehåller 4%isoamylalkohol till varje rör.Invertera rören 10 gånger för homogenisering, centrifug vid 2, 000 gånger g, fyra grader Celsius, i 10 minuter, och överföra de övre faserna till nya rör. Upprepa tvätten av den övre fasen med kloroformlösningen ytterligare två gånger. Tillsätt sedan åtta milliliter absolut etanol och 0,4 milliliter av en fem-molar natriumkloridlösning för att fälla ut DNA.Återigen, samla den utfällda DNA, och överföra den till tre milliliter 70%etanol. Upprepa tvätten med 70%etanol en gång till. Kassera etanollösningen med försiktighet, och invertera de rör som innehåller det utfällda DNA på absorberande papper för att avlägsna överflödig lösning.Efter att ha förberett DNA hydrolys prover med 15N5 isotopisk standard av 1, N6-etheno-deoxyadenosine och 15N5 isotopstandard av 1, N2-etheno-deoxyguanosine enligt manuskriptet, överföra 10 microliters av varje prov till rör för kvantifiering av normala deoxynucleosides av HPLC-UV. Underställ restvolymen en utvinning i fast fas. För att utföra HPLC, elute först en C18-kolonn fäst på en C18 SecurityGuard-patron med en lutning på 0,1%myrsyra och metanol.Ställ in toningsprogrammet så att det går från noll till 25 minuter med noll till 18%metanol, från 25 till 27 minuter med 18 till 0%metanol, sedan från 27 till 37 minuter med 0%metanol vid en flödeshastighet på en milliliter per minut och 30 grader Celsius. Därefter injicera en volym mellan två och sex mikroliter för varje prov som reserverats för normal deoxynucleosides kvantifiering. Ställ DAD-detektorn på 260 nanometer för integrering av deoxyguanosin- och deoxyadenosintopparna.För att utföra solid-fas extraktion för analyser av 1, N6-etheno-deoxyadenosine och 1, N2-etheno-deoxyguanosin, först ladda patronerna med en serie lösningar på en volym av en milliliter. Tillsätt 100%metanol, avjoniserat vatten, hydrolyserat DNA-prov, avjoniserat vatten, 10%metanol, 15%metanol, och slutligen 100%metanol för insamling. Fortsätt sedan enligt manuskriptet.Efter att ha förberett DNA-hydrolysprov 15N5 isotopisk standard på 8-oxo-deoxyguanosin, överför 80 mikroliter av varje prov till injektionsflaska för analys i HPLC-ESI-MS/MS-systemet. Reservera de återstående 20 mikroliter för kvantifiering av deoxyguanosin på HPLC-UV, som gjort tidigare. För analys av 8-oxo-deoxyguanosin på HPLC-ESI-MS/MS, elute C18-kolonnen A kopplade till en C18 SecurityGuard-patron med en lutning av lösningsmedel A och B med en flödeshastighet på 150 mikroliter per minut och 25 grader Celsius.Kör den binära pumpen med noll till 15%av lösningsmedel B under de första 25 minuterna, 15 till 80%av lösningsmedel B från 25 till 28 minuter, 80%av lösningsmedel B från 28 till 31 minuter, 80 till 0%av lösningsmedel B från 31 till 33 minuter, och 0%av lösningsmedel B från 33 till 46 minuter. Rikta de första 16 minuterna av kolonnen A eluent till avfall. Tillståndskolumnen B av den isokratiska pumpen med en lösning på 15%metanol i vatten som innehåller 0,1%myrsyra vid en flödeshastighet på 150 mikroliter per minut.Efter sex minuter, kontrollera kromatogrammet för att säkerställa 8-oxo-deoxyguanosine standard elutes från kolumn A.Under 16 till 32 minuter intervallet, växla ventilen till den position som möjliggör anslutning mellan kolumn A och kolumn B.Stäng ventilen på 32 minuter för att elute 8-oxo-deoxyguanosine från den andra kolumnen och få en skarp kromatografisk topp. För analys av 1, N6-etheno-deoxyadenosin och 1, N2-etheno-deoxyguanosine, elute en C18 kolumn kopplade till en C18 SecurityGuard patron med en gradient av lösningsmedel A och B vid en flödeshastighet på 130 mikroliter per minut och 25 grader Celsius. Kör den binära pumpen med 0%av lösningsmedel B under de första 10 minuterna, noll till 20%av lösningsmedel B i 10 till 39 minuter, 20 till 75%av lösningsmedel B från 39 till 41 minuter, 75%av lösningsmedel B från 41 till 46 minuter, 75 till 0%av lösningsmedel B från 46 till 47 minuter, och 0%av lösningsmedel B från 47 till 60 minuter.Använd kopplingsventilen för att rikta de första 35 minuterna av eluent till avfall och 35 till 42 minuters fraktion till ESI-källan. Var noga med att adduct-standarderna elar från kolumnen i det inställda intervallet. Integrera topparna för 8-oxo-deoxyguanosin 15N5 isotopisk standard på 8-oxo-deoxyguanosin, 1, N6-etheno-deoxyadenosin, 15N5 isotopisk standard på 1, N6-etheno-deoxyadenosine, 1, N2-etheno-deoxyguanosine och 15N5 isotopstandard på 1, N2-etheno-deoxyguanosin från analyserna HPLC-ESI-MS/MS.Beräkna arealförhållanden för kalibreringskurvorna och proverna. Upprätta kalibreringskurvorna, och beräkna mängden lesioner i varje injicerat prov. Integrera topparna av deoxyguanosin och deoxyadenosin från HPLC-UV-analyserna.Använd områdena för att fastställa kalibreringskurvorna, och beräkna de mängder deoxyguanosin och deoxyadenosin hos djur i varje injicerat prov. Beräkna molfraktionerna för 8-oxo-deoxyguanosin över deoxyguanosin, 1, N6-etheno-deoxyadenosine över deoxyadenosin, och 1, N2-etheno-deoxyguanosin över deoxyguanosin, som ger antalet lesioner per en miljon normal deoxyguanosin eller deoxyadenosine. Ett representativt kromatogram av det renade DNA som erhållits av HPLC-UV visar närvaron av de fyra normala deoxynucleosides, fri från RNA-ribonukleosider, som visar DNA-renheten.Representativa kromatogram från HPLC-ESI-MS/MS av 8-oxo-deoxyguanosin, 1, N6-etheno-deoxyadenosin, och 1, N2-etheno-deoxyguanosine i möss vävnad DNA prover visas. Kromatogrammet som erhålls med UV-detektering visar de fyra normala deoxynucleosides eluering från den första kolumnen fram till ca 10 minuter, med en bra separation från 8-oxo-deoxyguanosine, vilket eliminerar oönskade störningar. En viktig sak att komma ihåg för exakta kvantifieringar är att ha alltid samma mängder interna standarder i injektionsvolymen i kalibreringskurvorna och proverna.De metoder som presenteras här kan anpassas för kvantifiering av andra modifierade deoxynucleosides. Utöka bandet av modifierade deoxynucleosides möjliggör en bättre förståelse av de underliggande patofysiologiska mekanismerna. Vi kan undersöka vilken roll oxidativ skada i olika situationer såsom exponering för xenobiotika, diabetes, och cell maligna omvandling, därför medhjälp till utvecklingen av förebyggande och strategier behandling.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrovågsassisterad snabb diagnos av växtsjukdomar virus genom transmissionselektronmikroskopi

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Omvandling av probiotiska Jäst och deras återhämtning från Gastrointestinal Immune Vävnader Efter oral sondmatning hos möss

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Icke-invasiv provtagning av slemhinna slemhinnan vätska för kvantifiering av In Vivo övre luftvägarna immun-medlare nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Använda fylogenetisk analys för att undersöka eukaryota gen ursprung

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

En roman Feeder-fria System för massproduktion av murina naturliga mördarceller In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Anrikning av bakteriell lipoproteiner och beredning av N-terminala Lipopeptides för strukturella bestämning genom masspektrometri

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...