Name: quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter
Uploaded: 2019-05-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, proc. 2012/22190-3 ve 2012/08616-8), CNPq (proc. 454214/2014-6 ve 429184/2016-6), CAPES, PRPUSP (Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de São Paulo), ıNCL ıNAIRA (MCT/CNPq/FNDCT/CAPES/ FAPEMIG/FAPERJ/FAPESP; Proc. 573813/2008-6), ıNCER Redoxoma (FAPESP/CNPq/CAPES; Proc. 573530/2008-4), NAP Redoxoma (PRPUSP; Proc. 2011.1.9352.1.8) ve CEPID Redoxoma (FAPESP; Proc. 2013/07937-8). T. F. Oliveira ve A. A. F. Oliveira FAPESP (proc. 2012/21636-8, 2011/09891-0, 2012/08617-4) ve CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de nível Superior) burs aldı. M. H. G. Medeiros, P. di Mascio, P. H. N. Saldiva ve A. P. M. Loureiro CNPq 'dan burs aldı.
Bu çalışmanın içinde bulunan bazı rakamlar ve masalar aslen Oliveira A.A.F. et al. Genotoksisik ve epigenotoksisik etkilere konsantre Ambient ince partikül madde (PM2,5) São Paulo City, Brezilya maruz farelerde yayınlandı. Parçacık ve lif toksikoloji. 15, 40 (2018).

Dört haftalık erkek A/J fareler, spesifik patojen ücretsiz, Fundação Oswaldo Cruz (FıOCRUZ), Rio de Janeiro, Brezilya Laboratuvar hayvanları üreme merkezi 'nden elde edildi ve Tıp Fakültesi Etik Komitesi göre tedavi edildi, üniversite (protokol no 1310/09).
1. fare dokularının toplanması
<ol><li>Ksilazin ve ketamin ile hayvan anestezize. 30 g vücut ağırlığı ile bir fare için, bir çözüm enjekte (2 mL 'den fazla) içeren 2,63 mg ketamin ve 0,38 xylazine mg, ...

HPLC metotları ile 8-oxodguo analizlerinde bulunan önemli bir sorun, DNA ekstraksiyonu, DNA hidrolizsi ve DNA hidrolizlerinin konsantrasyonu sırasında oluşumunun olası indüksiyonudur22,38. 8-oxodguo artifaktüel oluşumunun sorununu en aza indirmek için, tüm DNA ekstraksiyonu, depolama ve hidroliz çözümleri için deferoxamin ilavesi, sodyum iyosin chaotropik yönteminin kullanımı ve DNA ekstrüzyonunda fenol kaçınılması önerilir, % 100 μg 'ye ...

Bazı reaktif oksijen türleri (ROS) DNA üsleri ve deoksiriboz Moiety bazı Karbonlar karbon çift bağları okside edebiliyoruz, oksitlenmiş üsler ve DNA iplikçik tatili üreten1. Azot ve oksijen atomları açısından zengin, negatif olarak şarj edilen bir molekül olarak, DNA aynı zamanda nüktenik siteler (azot ve oksijen) ile tepki veren aromatiklerin elektrofilik yerdeğiştirmesi gruplar için bir hedeftir, DNA adduct2denilen ürünler vererek. Yani, DNA adduct ve oksitlenmiş DNA üsleri, elektrofilik olan maddelerin toksisite değerlendirmesi için yararlı biyomarker olan DNA lezyonları örnekleridir, Biyotransformasyon üzerine reaktif elektrofil üretir, ya da oksidatif stres1, 2' ye kadar. Değiştirilmiş DNA üsleri DNA 'dan baz veya nükleotit eksizyon onarımı (BER veya NER) tarafından kaldırılabilse de, DNA lezyonlarının eski yol açmasıyla birlikte DNA lezyonları arasında bir dengesizlik indüksiyonu, daha fazla zaman içinde kendi düzeylerinde net bir artışa neden olur3 < /C5 >. Sonuçlar DNA mutasyonu oranlarının artması, azaltılmış gen ifadesi ve azalmış protein aktivitesi2,4,5,6,7, etkileri ile yakından ilgili olan hastalıkların gelişimi. DNA mutasyonları, hücre sinyalizasyon, hücre döngüsü, genom bütünlüğü, telomer stabilitesi, epigenom, kromatin yapısı, RNA birleştirme, protein homeostasis, metabolizma, apoptoz ve hücre farklılaşma gibi çeşitli hücresel fonksiyonları etkileyebilir8 ,9. Hücre mutasyonu oranlarını ve kronik hastalık gelişimini yavaşlatma stratejileri (örn. kanser, nörodejeneratif hastalıklar) mutasyon kaynaklarının bilgisine, DNA lezyonları ve nedenleri arasında geçmektedir.
Kirletici pozlama, kalıcı inflamasyon, hastalık patofizyolojisi (örn. diyabet) vb. nedeniyle endojenously fazlalıkta oluşturulan Ros, DNA ve lipid hasarı dahil olmak üzere biyomolekül hasarının önemli nedenleridir1. Örnek olarak, H2O2 ' den oluşan son derece reaktif hidroksil radikal (Oh) geçiş metal iyonlarına (Fe2 +, cu+) göre difüzyon kontrollü DNA üsleri, DNA şekeri kısım ve çoklu doymamış yağ asitleri oksitlenir oranları10. 80 arasında zaten oksitlenmiş nükvanoüsler karakterize3, en çok çalışan 8-OXO-7, 8-dihidroguanin (8-oxoGua) veya 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo, Şekil 1), gt transversions içinde yol açan bir lezyon memelinin hücreleri10,11. Bu, guanin mono elektronik oksidasyonu veya DNA1' de guanin hidroksil radikal veya atlet oksijen saldırısı ile oluşur. Çoklu doymamış yağ asitleri, lipid peroksidasyonu1,12sürecini başlatan •Oh gibi yüksek reaktif oksidanların diğer önemli hedefleridir. Aromatiklerin elektrofilik yerdeğiştirmesi aldehitler ve epoxyaldehydes için deforme olabilir yağ asidi hidroperoksitler artış sağlar, Malondialdehit, 4-hidroksi-2-nonenal, 2, 4-decadienal, 4, 5-Epoxy-(2E)-decenal, hexenal, acrolein, crotonaldehyde gibi malondialdehit-, Propano-veya etheno adduct1,12,13gibi mutajisik exokiktik DNA adduct 'ları oluşturabilecektir. Eteno adduct 1,n2-etheno-2'-deoxyguanosine (1,n2-εdguo, Şekil 1) ve 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado, Şekil 1 ) inflamasyonun patofizyolojisinde potansiyel Biyomarkörler olarak önerilen14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59734/59734fig1.jpg"> Şekil 1. DNA lezyonları mevcut çalışmada nicelik kimyasal yapıları. dR = 2 ́-deoksirriboz. Bu rakam Oliveira ve al.34güncellenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59734/59734fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
1980 ' lerin başlarında yürütülen çalışmalar yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal algılama (HPLC-ECD) ile birleştiğinde 8-oxodGuo hassas tespiti izin verdi. 8-oxodguo tarafından HPLC-ECD tarafından oksitlenme koşullarına maruz kalan çeşitli biyolojik sistemlerde, 8-oxodguo ' nın DNA 'da oksidatif olarak indüklenen baz hasarının bir biyomarker olarak tanınmasına yol açan1,16. Düşük fmol aralığı17' de 8-oxodGuo miktarının sağlam olmasına rağmen, HPLC-ECD ölçümleri analitik kimlik tespiti için analit tutma süresi doğruluğunu ve Kromatografi çözünürlüğünü diğer örnek bileşenleri. Elektrokimyasal algılama mobil aşamada tuz kullanımı (örneğin, potasyum fosfat, sodyum asetat) gerektirdiğinden, yeterli analitik koşulların bakımı rutin sütun ve ekipman temizleme süresi gerekir.
Alternatif olarak, bakteriyel DNA onarım enzim formayidopyrimidine DNA glycosylase (FPG) kullanımı ve daha sonra, insan 8-oxoguanine glycosylase 1 (hOGG1), algılama ve DNA 'dan 8-oxogua kaldırılması için, DNA alkali labil indüksiyon için bir yol olarak ortaya çıktı Site. Alkali labil siteleri DNA Strand molaları dönüştürülür ve alkalin tek hücreli jel elektroforez ("kuyruklu yıldız tahlil") ile 8-oxogua çok yüksek duyarlı dolaylı kantifikasyon sağlar. Yüksek hassasiyet ve hücresel DNA ekstraksiyon gerek kalmadan analizlerin başarısı bu tür tahlil ana avantajlarıdır. DNA 'da 8-oxoGua en düşük sabit devlet seviyeleri verir, genellikle 7-10 kez HPLC dayalı biyoanalitik Yöntemler ile elde edilen düzeylerinden daha düşük. Ancak, bu 8-oxogua dolaylı bir ölçüsüdür ve bazı dezavantajları özgüllük eksikliği veya onarım enzimlerin bilinmeyen verimliliği kullanılan1,16,18.
Bağışıklık sistemi, 1,n6-DAdo ve 1,n2-Dguo12gibi 8-oxogua1 ve exokiktik DNA kanalının saptanması için kullanılan diğer yöntemler kümesidir. Duyarlılık rağmen, DNA lezyonlarının tespiti için antikorların kullanımı bir eksiklik biyolojik numunelerin diğer bileşenlere çapraz reaktivite nedeniyle özgüllük eksikliği, normal DNA üsleri dahil,1,12. 1,n6-DAdo ve 1,n2-DGUO dahil olmak üzere exokiklik DNA adduct 'lar da tespit edilebilir ve son derece hassas 32P-postetiketleme12ile ölçülebilir. 32P-postetiketleme yüksek duyarlılık 1010 normal üsler başına yaklaşık 1 yaklaştırmak tespiti için DNA (örneğin, 10 μg) çok az miktarda kullanımını sağlar19. Ancak, radyo-kimyasallar, kimyasal özgüllük ve düşük doğruluk eksikliği kullanımı bazı dezavantajları19,20.
Yukarıda bahsedilen yöntemlerin paylaşılan sınırlaması, istenilen moleküllerin algılanması için düşük seçicilik veya özgüllük şeklindedir. Bu senaryoda, elektrosprey iyonizasyon tandem kütle spektrometresi (HPLC-ESI-MS/MS ve HPLC-MS3) ile BIRLEŞEN HPLC, DNA, idrar, plazma ve tükürük gibi biyolojik matrislerde değiştirilmiş nükleslerin ölçülmesini için altın standart olarak gelişti. 1 , 19 , 20. HPLC-ESı-MS/MS yöntemlerinin avantajları (genellikle düşük fmol aralığında) duyarlılık ve ı tarafından sağlanan yüksek özgüllük) kromatografik ayrım, II) kütle içinde molekül parçalanma karakteristik ve bilinen deseni Spektrometre çarpışma odası ve III) birden fazla reaksiyon izleme modunda seçilen kütlenin şarj oranı (m/z) doğru ölçümü1,19. İzotopik etiketli iç standartların kullanımı, DNA hidroliz ve analit zenginleştirme adımları sırasında molekül kayıplarına yönelik düzeltmeler ve numuneler arasındaki analit iyonizasyon farklılıkları için bir avantaj katıyor. Aynı zamanda birden fazla zirve mevcut olduğunda doğru kromatografik zirvede teşhis yardımcı olur1,12,19,20.
HPLC-ESI-MS/MS bazlı çeşitli yöntemler, farklı biyolojik örneklerden çıkarılan DNA 'da 8-oxodguo, 1,n6-dAdo ve 1,n2-dguo miktarının ölçülmesini için kullanılmıştır12,15,20 ,21,22,23,24,25,26,27,28,29 . İnce parçacıklar (PM2,5) organik ve inorganik kimyasallar taşır, polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH) gibi, Nitro-PAHs, aldehyler, ketonlar, karboksilik asitler, kinolinler, metaller, ve su çözünür iyonlarının, hangi inflamasyon neden olabilir ve oksidatif stres, biyomolekül hasar ve hastalığın oluşumu lehine koşullar30,31,32,33. Burada onaylanan HPLC-ESı-MS/MS yöntemleri, 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo ve 1,n2-DGUO in Lung, karaciğer ve böbrek DNA 'sı/J farelerinin ölçülmesi için başarıyla uygulanmıştır. ortam PM2,5 pozlama34etkileri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1260px;" width="1262">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyadenosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3895-25</td>
			<td style="width:65px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">[15N5]-2&#8217;-deoxyguanosine</td>
			<td style="width:369px;">Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td style="width:472px;">NLM-3899-CA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412413000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">alkaline phosphatase from bovine intestinal mucosa</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P5521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ammonium acetate</td>
			<td style="width:369px;">Merck</td>
			<td style="width:472px;">101116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">calf thymus DNA</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">cell lysis solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">chloroform</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">412653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deferoxamine</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">deoxyribonuclease I (DNase I)</td>
			<td style="width:369px;">Bio Basic Inc</td>
			<td style="width:472px;">DD0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ethanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">414542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">formic acid</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="242">
			<td height="242" style="height:242px;width:353px;">HPLC-ESI-MS/MS system</td>
			<td style="width:369px;">HPLC: Agilent 1200 series&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Applied Biosystems/MDS Sciex Instruments</td>
			<td style="width:472px;">HPLC: binary pump (G1312B), isocratic pump (G1310A), column oven with a column switching valve (G1316B), diode array detector (G1315C), auto sampler (G1367C).&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; ESI-MS/MS: Linear Quadrupole Ion Trap mass spectrometer, Model 4000 QTRAP.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="138">
			<td height="138" style="height:138px;width:353px;">HPLC/DAD system</td>
			<td style="width:369px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:472px;">Two pumps (LC-20AT), photo diode array detector (DAD-20AV), auto-injector (Proeminence SIL-20AC), column oven (CTO-10AS/VP)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (50 x 2.0 mm i.d., 2.5 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td>00B-4446-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (150 x 2.0 mm i.d., 3.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00F-4251-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC column (250 x 4.6 mm i.d., 5.0 &#181;m, C18)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">00G-4252-E0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">HPLC C18 security guard cartridge (4.0 x 3.0 mm i.d.)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">AJO-4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">M32658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">isopropyl alcohol (isopropanol)</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">A412790010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ketamine</td>
			<td style="width:369px;">Ceva</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Dopalen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">349377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">methanol</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">L022909K7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">phosphodiesterase I from Crotalus atrox</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">P4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">protein precipitation solution</td>
			<td style="width:369px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:472px;">158912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">proteinase K</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">ribonuclease A</td>
			<td style="width:369px;">Sigma</td>
			<td style="width:472px;">R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:369px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:472px;">S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">SPE-C18 (Strata-X)</td>
			<td style="width:369px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:472px;">8B-S100-TAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:353px;">tris(hydroxymethyl)-aminomethane</td>
			<td style="width:369px;">Carlo Erba Reagents</td>
			<td style="width:472px;">489983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:353px;">xylazine</td>
			<td style="width:369px;">Syntec do Brasil</td>
			<td style="width:472px;">Commercial name: Xilazin</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of three dna lesions by mass spectrometry and assessment of their levels in tissues of mice exposed to ambient fine particulate matter

DNA akıları ve oksitlenmiş DNA üsleri, elektrofilik olan maddelerin toksisite değerlendirmesi için yararlı biyomarker olan DNA lezyonları örnekleridir, Biyotransformasyon üzerine reaktif elektrofil üretir veya oksidatif strese neden olur. Oksitlenmiş nüklüler arasında en çok çalışan 8-OXO-7, 8-dihidroguanin (8-oxoGua) veya 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), DNA 'da oksidatif olarak indüklenen baz hasarının bir biyokarker olduğunu. Lipid peroksidasyonu işleminden kaynaklanan aldehydes ve epoxyaldehydes, etheno adduct 1,n2-etheno-2'-deokguanosin (1,n2-) gibi MUTAJISIK exokiktik DNA adaklarını oluşturabilen elektrofilik moleküllerdir. εdGuo) ve 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-εdado), inflamasyonun patofizyolojisinde potansiyel biomarkerler olarak önerilmiştir. Hücre mutasyonu oranlarını ve kronik hastalık gelişimini yavaşlatmak için önleyici stratejilerin geliştirilmesi için (örneğin, kanser, nörodejeneratif hastalıklar), DNA 'daki ölçülerinin seçici ve hassas yöntemleri gereklidir. Onların algılama için kullanılabilir hassas Yöntemler arasında (yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal veya TANDEM kitle spektrometri dedektörleri, kuyruklu yıldız tahlil, immünasder, 32P-postetiketleme), en seçici bu tabanlı olan birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (HPLC-ESI-MS/MS) ile birleştiğinde. Seçicilik, karmaşık biyolojik numuneleri ve HPLC-ESı-MS/MS analizinde temel bir avantajdır, DNA, idrar, plazma ve tükürük gibi biyolojik matrislerde değiştirilen nükletlerin ölçülmesinde altın standardı olarak gelişti. İzotopik etiketli iç standartların kullanımı, DNA hidroliz ve analit zenginleştirme adımları sırasında molekül kayıplarına yönelik düzeltmeler ve numuneler arasındaki analit iyonizasyon farklılıkları için bir avantaj katıyor. Aynı zamanda birden fazla zirve olduğunda doğru kromatografik zirvede tanımlanmasını da yardımcı olur.
Burada, 8-oxodGuo, 1,n6-DAdo ve 1,n2-DGUO in Lung, karaciğer ve böbrek DNA 'sı için/J farelerinin ölçülmesini başarıyla uyguladığınız hassas, doğru ve hassas HPLC-ESI-MS/MS yöntemlerinin doğrulanması Ambient PM2,5 pozlama etkilerini değerlendirilmesi.

Fare karaciğerinden (~ 1 g doku), akciğer (~ 0,2 g dokusu) ve böbrek (~ 0,4 g dokusu) elde edilen ortalama DNA konsantrasyonları (± SD), sırasıyla 5.068 ± 2.615, 4.369 ± 1.021 HPLC-DAD tarafından elde edilen, saflaştırılmış DNA 'nın temsili kromatogram Şekil 3' te gösterilir. Dört 2 '-deoxynucleosides varlığı, RNA ribonucleosides ücretsiz, karşılık gelen hemen önce elute 2 '-deoxynucleosides, DNA saflık gösterir.
<p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter at JoVE.

Quantification of three DNA Lesions by Mass Spectrometry and Assessment of Their Levels in Tissues of Mice Exposed to Ambient Fine Particulate Matter

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

DNA adducts and oxidized DNA bases are examples of DNA lesions that are useful biomarkers for the toxicity assessment of substances that are ...

Burada sunulan yöntemler, oksidatif stresin neden olduğu DNA lezyonlarının sayısallaştırılmasına olanak sağlayarak, hastalıkların önlenmesi ve tedavisi için hedef olabilecek patofizyolojik mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır. Seçicilik ve duyarlılık başlıca avantajlarıdır. Seçicilik karmaşık biyolojik numuneler ile çalışırken önemli bir avantajdır.HPLC tandem kütle spektrometresi ile birleştiğinde biyolojik matrisler ile nicelleştirme bu tür altın standart olarak gelişti. Oksidatif stres farklı patofizyolojik süreçleriçin ortak bir olaydır. İnflamatuar hastalığı olan hastaların doku veya idrarında eto adducts düzeylerinin arttığı saptanmıştır.DNA lezyonları da kirleticilere maruz kalma tarafından tetiklenen endojen olaylar hakkında bilgi sağlar. DNA lezyonları artarsa, maruz kalma kanser gelişimi riskini artıran düzeyde olabilir, örneğin. Lezyonlar herhangi bir hücresel sistemden DNA'da ve alternatif olarak idrar, plazma, tükürük kültürü ortamında örnek hazırlama da adaptasyonlarla ölçülebilir.Başlamak için, neşter ile doku parçası kesmek için bir temel olarak buz üzerine yerleştirilen bir kültür plakası kullanın. Hemen kullanım için her 50 mililitrelik kapaklı tüp doku bir gram tartın. Eksi 80 santigrat derecede depolamadan önce kalan dokuyu kuru buzda saklayın.Her tüp için, 0.5 milimolar deferoksamin içeren ticari hücre lisis çözeltisi 10 mililitre ekleyin ve buz üzerinde tutmak. Düşük bir hıza doku homogenizer ayarlayın, yaklaşık 60-90 rpm. Çözelti doku parçaları olmadan birkaç dakika buz üzerindeki dokuları homojenize.Daha sonra, her homojenize örnek proteinaz K çözeltisi 150 mikrolitre ekleyin. Tüpleri ters çevirerek sallayın ve gece boyunca oda sıcaklığında tutun. Sabah, ribonuclease Bir çözelti 40 mikrolitre ekleyin, ters sallamak, ve iki saat boyunca oda sıcaklığında tüpler tutun.Ticari protein yağış çözeltisi beş mililitre ekleyin, girdap şiddetle, ve santrifüj 2, 000 kez g, dört derece santigrat, 10 dakika. Supernatants 50 mililitre kapaklı tüpler soğuk izopropanol 10 mililitre içeren aktarın. Çökelmiş DNA gözlemi yapılana kadar tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirin.Çökelmiş DNA toplamak için sonunda kapalı bir Pasteur pipet kullanın. Toplanan DNA'yı 10 milimolar Tris tamponunun dört mililitresini içeren tüplere ve pH 7'de bir milimolar deferoksamin içeren tüplere aktarın. DNA tüplerde tamamen çözüldükten sonra, her tüpe %4 isoamyl alkol içeren dört mililitre kloroform çözeltisi ekleyin.Tüpleri homojenizasyon için 10 kez ters çevirin, 2, 000 kez g santrifüj, dört santigrat derece, 10 dakika, ve yeni tüpler için üst aşamaları aktarın. Kloroform çözeltisi ile üst fazın yıkanan iki kez daha tekrarlayın. Sonra, DNA çökelti için mutlak etanol sekiz mililitre ve beş molar sodyum klorür çözeltisi 0.4 mililitre ekleyin.Yine, çökelmiş DNA toplamak ve% 70 etanol üç mililitre aktarın. Yıkamayı %70 etanol ile bir kez daha tekrarlayın. Etanol çözeltisini dikkatli bir şekilde atın ve aşırı çözeltiyi çıkarmak için çökelmiş DNA içeren tüpleri emici kağıda ters çevirin.15N5 izotopik standardı 1, N6-etheno-deoksiadenozin ve 15N5 izotopik standardı 1, El yazmasına göre N2-etheno-deoksiguanozin ile DNA hidroliz örnekleri hazırlandıktan sonra, hplc-UV ile normal deoksinükleozitlerin ölçülmesi için her numunenin 10 mikrolitresini tüplere aktarın. Artık hacmi katı faz çıkarma konusuna tabi tart.rekti. HPLC'yi gerçekleştirmek için, %0,1 formik asit ve metanol degradesi olan C18 SecurityGuard kartuşu ile bağlı bir C18 sütununu ilk kez takın.Degrade programını sıfırdan 25 dakikaya sıfırdan %18'e kadar metanolle, 25-27 dakikadan %18 ila %0 metanolle, sonra dakikada bir mililitre ve 30 santigrat derecelik bir akış hızıyla %0 metanolle 27 ila 37 dakikadan çalışacak şekilde ayarlayın. Bundan sonra, normal deoksinükleonitler nicelleştirme için ayrılmış her örnek için iki ve altı mikrolitre arasında bir hacim enjekte edin. Deoksiguanozin ve deoksiadenozin zirvelerinin entegrasyonu için 260 nanometre de BABA dedektörü ayarlayın.1, N6-etheno-deoksiadenozin ve 1, N2-etheno-deoksiguanozin analizleri için katı faz ekstraksiyon gerçekleştirmek için, ilk bir mililitre hacimde bir dizi çözelti ile kartuşları yükleyin. Toplama için %100 metanol, deiyonize su, hidrolize DNA örneği, deiyonize su, %10 metanol, %15 metanol ve son olarak %100 metanol ekleyin. Sonra, el yazmasına göre devam edin.DNA hidroliz örnekleri hazırlandıktan sonra 15N5 izotopik standart 8-okso-deoksiguanozin, HPLC-ESI-MS/MS sisteminde analiz için her numunenin 80 mikrolitresini şişelere aktarın. Daha önce yapıldığı gibi, HPLC-UV üzerinde deoksiguanozin in sayısallaştırılması için kalan 20 mikrolitreyi rezerve edin. HPLC-ESI-MS/MS üzerinde 8-oxo-deoksiguanozin analizi için, C18 sütun A dakikada 150 mikrolitre ve 25 santigrat derece bir akış hızında solvent A ve B bir degrade ile birleştiğinde C18 sütun birleştiğinde elute.İlk 25 dakika boyunca B çözücünün sıfır ila %15'i, 25-28 dakika dan B çözücünün %15 ila %80'ini, 28-31 dakikadan solvent B'nin %80'ini, 31-33 dakikadan B solventinin %80'ini ve 33-46 dakikadan %0'ı çözücü B ile çalıştırın. A sütununun ilk 16 dakikasını boşa yönlendirin. Dakikada 150 mikrolitre akış hızında %0.1 formik asit içeren suda %15 metanol çözeltisi olan izokratik pompa ile B kolonu.Altı dakika sonra, 16 ila 32 dakika aralığında sütun A.during 8-okso-deoksiguanozin standart elutes sağlamak için kromatogram kontrol, sütun A ve sütun B arasında bağlantı sağlayan pozisyona vana geçiş.İkinci sütundan 8-oxo-deoksiguanozin yakın ve keskin bir kromatografik tepe olsun 32 dakika valf kapatın. 1 analizi için, N6-etheno-deoksiadenozin ve 1, N2-etheno-deoksiguanozin, dakikada 130 mikrolitre ve 25 santigrat derece bir akış hızında çözücü A ve B degradesi ile bir C18 SecurityGuard kartuş bir c18 sütun birleştiğinde bir C18 sütun elute. İkili pompayı ilk 10 dakika için %0, B solventinin %20'sini 10 ila 39 dakika, B solventinin %20 ila %75'ini 39 dakikadan 41 dakikaya, %75'ini 41 dakikadan 46 dakikaya, B solventinin %75'ini 46-47 dakika ve %0'ı 47-60 dakika arasında çalıştırın.İlk 35 dakikayı atıklara ve ESI kaynağına 35-42 dakikalık fraksiyonu yönlendirmek için anahtarlama valfini kullanın. Adduct standartlarının ayarlanan aralıktaki sütundan silindiğinden emin olun. 8-oxo-deoksiguanozin 15N5 izotopik standart 8-oxo-deoksiguanozin doruklarını entegre, 1, N6-etheno-deoksiadenozin, 15N5 izotopik standart 1, N6-etheno-deoksiadenozin, 1, N2-etheno-deoksiguanozin, ve 15N5 izotopik standart 1, HPLC-ESI-MS/MS analizlerinden N2-etheno-deoksiguanozin.Kalibrasyon eğrileri ve numuneler için alan oranlarını hesaplayın. Kalibrasyon eğrilerini belirleyin ve enjekte edilen her örnekteki lezyonların miktarlarını hesaplayın. HPLC-UV analizlerinden deoksiguanozin ve deoksiadenozin zirvelerini entegre edin.Kalibrasyon eğrileri kurmak için alanları kullanın ve her enjekte örnek hayvanlarda deoksiguanozin ve deoksiadenozin miktarlarını hesaplamak. Deoksiguanozin üzerinde 8-oxo-deoksiguanozin için molar fraksiyonları hesaplayın, 1, Deoksiadenozin üzerinde N6-etheno-deoksiadenosin, ve 1, Deoksiguanozin üzerinde N2-etheno-deoksiguanozin, hangi bir milyon normal deoksiguanozin veya deoksiadenosin başına lezyonların sayısını vermek. HPLC-UV ile elde edilen safdna'nın temsili bir kromatogramı, RNA ribonükleozitlerinden arındırılmış dört normal deoksinükleonitin varlığını gösterir ve DNA saflığını gösterir.HPLC-ESI-MS/MS 8-oxo-deoksiguanozin, 1, N6-etheno-deoksiadenozin ve 1, N2-etheno-deoksiguanozinden temsilen kromatogramlar fare dokusu DNA örneklerinde gösterilmiştir. UV tespiti ile elde edilen kromatogram, ilk kolondan yaklaşık 10 dakikaya kadar eluting eden dört normal deoksinükleoziti, 8-oxo-deoksiguanozinden iyi bir ayrım ile istenmeyen girişimleri ortadan kaldırır. Tam nicelikler için hatırlanması gereken önemli bir şey, kalibrasyon eğrileri ve numunelerde enjeksiyon hacminde her zaman aynı miktarda iç standartlara sahip olmaktır.Burada sunulan yöntemler diğer modifiye deoksinükleozitlerin nicelleştirilmesi için uyarlanabilir. Modifiye deoksinükleonit bandının genişletilmesi altta yatan patofizyolojik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlar. Ksenobiyotiklere maruz kalma, diyabet ve hücre malign transformasyonu gibi farklı durumlarda oksidatif hasarın rolünü araştırarak önleyici ve tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabiliriz.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Ökaryotik gen kökenli araştırmaya filogenetik analizi kullanılarak

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Enrichment of Bacterial Lipoproteins and Preparation of N-terminal Lipopeptides for Structural Determination by Mass Spectrometry

Zenginleştirme bakteriyel lipoproteinler ve kütle spektrometresi tarafından yapısal kararlılık için N-terminal Lipopeptides hazırlanması

Lipoproteins are important constituents of the bacterial cell envelope and potent activators of the mammalian innate immune response. Despite their ...