Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

وقد حظي هذا البحث بدعم مؤسسه العلوم الاسرائيليه (المنحة رقم 1023/18).

1. تصميم ميكروصفيف
ملاحظه: تحقيقات الحمض النووي تمثل متواليات 36 المخصصة-النيوكليوتيد ، التي تتكون من موقع التعرف علي T7 DNA البدائية (GTC) الواقعة بين منطقتين متغيرتين التطويق ، تليها تسلسل ثابت 24-النيوكليوتيد المربوطة إلى شريحة زجاجيه3. استخدمنا 4 x 180,000 شكل ميكروصفي?...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

وقد استخدمت طريقه PBM علي نطاق واسع للتحقيق في خصائص ملزمه لعوامل النسخ ويمكن أيضا ان تطبق علي انزيمات معالجه الحمض النووي ، مثل الحمض النووي البدائي ، التي ترتبط الحمض النووي مع تقارب منخفضه. غير انه يلزم إدخال بعض التعديلات علي الإجراءات التجريبية. وتشمل تجربه ميكروصفيف عده خطوات: تصميم م...

HTPP يجعل استخدام الحمض النووي ربط التكنولوجيا الدقيقة مع التحليل البيوكيميائي (الشكل 1) لتحديد إحصائيا ميزات محدده من قوالب الحمض النووي التي تؤثر علي النشاط الانزيمي من الحمض النووي البدائي. ولذلك ، يوفر HTPP منصة التكنولوجية التي تسهل قفزه المعرفة في الميدان. الاداات الكلاسيكية المستخدمة لتحديد مواقع التعرف علي البدائية لا تملك القدرة علي الغلة كميه هائله من البيانات ، في حين HTPP لا.
PBM هي تقنيه تستخدم بشكل روتيني لتحديد التفضيلات الملزمة لعوامل النسخ إلى الحمض النووي1,2; ومع ذلك ، فانه ليس مناسبا للكشف عن ضعف/عابره ملزمه من البروتينات إلى الحمض النووي. علي عكس PBM العالمية التي توفر معلومات حول متوسط البروتين ربط الخصوصية لجميع تسلسل ممكن تتكون من ثمانيه أزواج الاساسيه ، ويستند HTPP علي مكتبه قوالب الحمض النووي واحده تقطعت بها السبل تتالف من عناصر تسلسل فريدة من نوعها. وتشمل هذه العناصر تسلسل الحمض النووي عشرات آلاف قصيرة (بضع عشرات من bp) متواليات الجينوم ، فضلا عن التصميم المحوسب متواليات الحمض النووي المخصب في بعض عناصر التسلسل المتكرر الحمض النووي الموجودة في الجينوم ، والتي تمتلك مختلف المحتوي GC متوسط . ويسمح هذا النهج العالي الانتاجيه بتحديد الخصائص المرتبطة بالتسلسل التي تعتبر مهمة للربط البدائي ونشاطه الانزيمي3، بطريقه منهجيه وكميه وقائمه علي الفرضيات. علي وجه الخصوص ، تم تحديد الصلة الهامه بين التفضيلات الملزمة للحمض النووي البدائي ، (التضمين بواسطة تسلسل الحمض النووي الذي يحيط بمواقع ربط ثلاثي النوكليوتيد المحددة) والمستقيم البدائي لهذا النظام الانزيمي4.
تم تطبيق التكنولوجيا الجديدة لأعاده النظر في فهمنا لمواقع التعرف علي البدائية حتى بالنسبة T7 الحمض النووي البدائية التي تم دراستها علي نطاق واسع5. وعلي وجه التحديد ، أدت أعاده النظر في المفاهيم الكلاسيكية ، مثل مواقع التعرف علي الحمض النووي T7 الحمض النووي البدائي (التي تم تحديدها قبل أربعه عقود تقريبا 6) باستخدام البروتين الحمض النووي ملزمه ميكروصفيف (PBM) إلى رؤية غير مسبوقة في الميزات المتعلقة التسلسل [فلكينغ] من هذا تمييز موقعات3. وكان من المتوقع ان التسلسل الذي يحيط بموقع الاعتراف ثلاثي النوكليوتيد من T7 DNA بريتاز (5 '-GTC-3 ') سيكون عشوائيا. بدلا من ذلك ، وجدنا ان المتواليات الغنية TG التي تزيد من فرص T7 الحمض النووي البدائية لتوليف الإشعال الجيش الملكي النيبالي أطول تشير إلى زيادة في processivity.
وتشمل الطرق الأخرى التي يمكن استخدامها لدراسة خصائص ربط الحمض النووي من البروتينات في المختبر اختبار تحول الحركة الكهربية (EMSA)7، dnase انا الطباعة علي الاقدام8، السطح-PLASMON الرنين (موارد الاستخدام الخاصة)9، وجنوب غرب التنقيط 10. ومع ذلك ، فان أساليب الانتاجيه المنخفضة تنطبق فقط علي التحقيق في عدد صغير من تسلسل الحمض النووي. الاضافه إلى ذلك ، فان دقه وحساسية بعض هذه التقنيات (مثل EMSA) منخفضه. من ناحية أخرى ، في المختبر الاختيار11 هو الأسلوب الذي ، بالمثل لل PBM ، يمكن استخدامها لتحديد العديد من تسلسل ملزمه. ومع ذلك ، عاده ما تستبعد تسلسلات تقارب منخفضه في معظم تطبيقات الاختيار في المختبر. ولذلك ، فان هذا النهج غير مناسب للحصول علي بيانات الربط المقارن لجميع التسلسلات المتاحة. ويستخدم العالمية PBM1,2 أساسا لتوصيف الخصائص الملزمة لعوامل النسخ من النوى البدائية والنواة وكذلك عوامل محدده (علي سبيل المثال ، وجود بعض ligands ، والعوامل المختلطة ، وما إلى ذلك) التي قد تؤثر علي هذا التفاعل12.
HTPP يوسع تطبيق PBM لانزيمات معالجه الحمض النووي من خلال الجمع بين الطاقة الاحصائيه عاليه الانتاجيه غير مسبوقة مع دقه عاليه لتوفير معلومات حول سياق تسلسل الربط. ولم يتم بعد الحصول علي هذه البيانات بالنسبة للبدائيات والانزيمات ذات الصلة (التي لها ارتباط ضعيف/عابر بالحمض النووي) بسبب القيود التقنية المذكورة أعلاه للتقنيات المتاحة الأخرى.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

الحمض النووي البدائي توليف الإشعال RNA قصيرة التي تبدا تخليق الحمض النووي من شظايا Okazaki علي حبلا متخلفه من قبل الحمض النووي البوليميريز خلال النسخ المتماثل DNA. والربط بين البدائيات ذات النواة الحقيقية الشبيهة بالحمض النووي في الدنا يحدث عند تسلسل معين للاعتراف بالكروموسومات الثلاثية. وهي خطوه محوريه في تشكيل شظايا اوكازاكي. الاداات البيوكيميائية التقليدية التي تستخدم لتحديد تسلسل التعرف علي الحمض النووي من الحمض النووي البدائي توفر فقط معلومات محدوده. باستخدام المقايسة الدقيقة العالية الانتاجيه المستندة إلى ميكروصفيف والتحليلات البيوكيميائية المتتابعة ، فقد تبين ان 1) السياق ملزمه محدده (الربط متواليات من موقع الاعتراف) يؤثر علي قوه ملزمه من الحمض النووي البدائي إلى قالبه الحمض النووي ، و 2) اقوي ملزمه من البدائية إلى الحمض النووي غله أطول الجيش النيبالي العالي الإشعال ، مشيرا إلى ارتفاع المستقيم من الانزيم. ويجمع هذا الأسلوب بين الفحص الدقيق والنشاط البدائي ويتم تعيينه كتصنيف بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، ويسمح بتوصيف التعرف علي تسلسل محدد بواسطة الحمض النووي البدائي في وقت وقابليه غير مسبوقين.

هذا التقدم التكنولوجي لرسم خرائط المواقع ملزمه البدائية يسمح الحصول علي خصائص ربط الحمض النووي التي يصعب ، ان لم يكن من المستحيل ، لمراقبه استخدام الاداات الكلاسيكية. والاهم من ذلك ، تمكن HTPP من أعاده الفهم التقليدي لمواقع ربط البدائية. علي وجه التحديد ، HTPP يكشف عن خصوصيا?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

ترتبط تجارب البروتين المجهري الملزم (PBM) المقترنة باختبارات الكيمياء الحيوية بالخصائص الملزمة والمحفزة للحمض النووي البدائي ، وهو انزيم يجمع الإشعال الريبي علي الحمض النووي. ويمكن استخدام هذه الطريقة ، التي تم تعيينها كتنميط بدائي عالي الانتاجيه (HTPP) ، للكشف عن أنماط ربط الحمض النووي لمجموعه متنوعة من الانزيمات.

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

يصف هذا البروتوكول جمع بيانات ضخمة من البروتين والحمض النووي microarray ملزمة لل primase، وهو الانزيم الذي يرتبط عابرة لتسلسلات الحمض النووي محددة، وبالتالي يحفز تشكيل الائلية RNA. سيغطي هذا الفيديو كيف يمكن أن تساعد تقنية microarray في إعادة تعريف مواقع التعرف على التسلسل الرئيسي وكيف يمكن لنهج الإنتاجية العالية أن يكمل الكيمياء الحيوية الكلاسيكية. هذه التقنية يجمع بين نهجين: primase DNA microarray ملزمة ومجايسة النشاط الرئيسي.microarray يوفر بيانات ضخمة من بريماسي ملزمة لتسلسل الحمض النووي، حيث كما المقايسة الكيميائية الحيوية يوفر معلومات عن تشكيل التمهيدي RNA من قبل بريماسي الحمض النووي. يعتمد النشاط الأنزيمي المختبر على البصيرة من تجربة microarray وإنتاجيتها المنخفضة في طبيعتها. يتم التحقيق في العلاقة بين كفاءة الربط ، واختيار تسلسل الحمض النووي ونشاط الإنزيم.تحديد تحديد التسلسل باستخدام microarray، يسمح لنا باستخلاص استنتاجات دقيقة استنادا إلى بيانات ضخمة من microarray. وقد استخدم هذا النهج حتى الآن لوصف تسلسلات الحمض النووي الملزمة لعوامل النسخ. عوامل النسخ هي بروتينات ثابتة ترتبط بإحكام بالحمض النووي.(سيُظهر الإجراء سيكون (ستيفان ايليتش لبدء هذا الإجراء، قبل الرطب الشريحة microarray عن طريق وضعه في جرة كوبلين تحتوي على 0.01٪ تريتون-X 100. وتدوير على جهاز تدوير مختبر، إضافة 125 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.الماصات الحل حظر في مربع من البلاستيك. ثم إزالة الشريحة microarray من جرة كوبلين. استخدام مسح غرامة لدفع الجانب غير الحمض النووي حواف الشريحة.ضع ببطء microarray في مربع من البلاستيك. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع اهتزاز بطيء. بعد ذلك، غسل الشريحة مرة واحدة مع 0.01٪ Tween-20 في برنامج تلفزيوني.على جهاز دوار مختبر عند 125 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. إزالة Tween-20 وشطف الشريحة مرة واحدة مع 0.01٪ تريتون X 100 في برنامج تلفزيوني على مدار دورة مختبر في 125 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. ثم نقل بسرعة الشريحة إلى جرة كوبلين تحتوي على برنامج تلفزيوني.أولاً، قم بتجميع غرفة PMB كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع الشريحة في المساحة المعينة. استخدام ملاقط لدفعه إلى أسفل واليسار.ضع طوقا السيليكون على القمة ، مع التأكد من أن يتم محاذاته بشكل جيد مع الجزء السفلي من غرفة PBM. ثم أغلق الغرفة وشد البراغي قطريا. الماصات بروتين ملزمة الخليط في كل بئر من طوقا.ثم، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. للبدء ، ماصة 0.05 ٪ Tween - 20 في برنامج تلفزيوني في غرفة PBM لغسل الشريحة لفترة وجيزة. باستخدام ازاحة فراغ، إزالة الحل من آبار الغرفة مع الحرص على عدم لمس البقع الحمض النووي.كرر هذا، وغسل لفترة وجيزة الشريحة مع برنامج تلفزيوني. واستخدام الفراغ لإزالة الحل من آبار الغرفة مع الحرص على عدم لمس البقع الحمض النووي. بعد ذلك ، أضف Alexa 488 مترافقًا ضد الأجسام المضادة له إلى كل بئر من غرفة PBM.احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، وغسل لفترة وجيزة الشريحة داخل غرفة PBM بإضافة بضع قطرات من 0.05 ٪ Tween - 20 في برنامج تلفزيوني في كل بئر. واستخدام التعرق فراغ لإزالة الحل من آبار الغرفة، مع الحرص على عدم لمس البقع الحمض النووي.تفكيك غرفة PBM وإزالة الشريحة. شطف الشرائح مرتين في 0.05٪ Tween-20 في برنامج تلفزيوني، مع كل شطف تستمر ثلاث دقائق. ثم، شطف الشرائح مرتين في برنامج تلفزيوني، مع كل شطف تستمر ثلاث دقائق لكل منهما.و مرة واحدة في الماء المقطر المزدوج لمدة ثلاث دقائق جفف الشرائح بالهواء المضغوط. وتخزينها في مربع شريحة داكنة حتى تصبح جاهزة للمسح الضوئي.عندما تكون جاهزة، استخدم ماسح ضوئي microarray لمسح الشريحة مع استثارة من 495 نانومتر وانبعاث 19 نانومتر. وجمع متوسط كثافة الفلورس. في هذه الدراسة pi إنتاجية primase التنميط يستخدم لرسم خريطة primase ملزمة المواقع ، بما في ذلك تلك التي يصعب إن لم يكن من المستحيل أن نلاحظ باستخدام الأدوات الكلاسيكية.الأهم من ذلك ، pi إنتاجية primase التنميط تمكن من إعادة النظر في الفهم التقليدي لمواقع ملزمة primase. خاصة pi الإنتاجية primase التنميط يكشف عن خصوصيات ملزمة بالإضافة إلى معروفة 5'GTC3'الاعتراف تسلسل، الأمر الذي يؤدي إلى تغييرات في الأنشطة الوظيفية من T7 DNA primase. أي أنه تم تحديد مجموعتين من التسلسلات.تسلسل الحمض النووي ملزمة قوية التي تحتوي على TG في الجناحين وتسلسل الحمض النووي ملزمة ضعيفة التي تحتوي على AG في الجناحين. لم يتم الكشف عن أي ربط بريما لقوالب الحمض النووي التي كانت مفقودة 5'GTC3'داخل تسلسلها. مواقع التعرف على الحمض النووي بريماسي التي تحتوي على ميزات محددة مثل الجناحين الغنية TG، وزيادة بريماسي الحمض النووي ملزمة تصل إلى 10 أضعاف.والمثير للدهشة، أنها أيضا زيادة طول الحمض النووي الريبي شكلت حديثا. الأهم من ذلك ، ارتفاع الإنتاجية primase التنميط يسمح لنا لمراقبة وقياس التباين في طول التمهيدي بالنسبة لتسلسل قالب الحمض النووي. عند تنفيذ هذا الإجراء يجب أن تكون خطوات الغسيل خفية.ويجب أن تحتوي المخازن المؤقتة على مكونات تسجيل بريما على الحمض النووي. أيضا حدّ من عبثيّة ييحدّد اتّزاميّة حادثات يميّا. ولذلك فإن تحليل الميكروساومي غير كاف.يمكن أن تحدد أساليب مثل الرنين البلازما السطحية ومقايسات تحول الجل تقارب ملزم من primase لتحديد تسلسل الحمض النووي. مختبري ينفذ نماذج التنبؤ التعلم الآلي للكشف عن محددات تسلسل الرئيسيات التي تنتج التمهيديات المنتجة التي يمكن تمديدها بواسطة بوليميراز الحمض النووي. في عصر البيانات الضخمة ، وتنفيذ الطرق الإحصائية لتحليل البيانات الضخمة ، فإن هذه التقنية ستساعد بالتأكيد على تحديد تسلسل الحمض النووي المحدد بشكل أفضل وربط التعرف على التسلسل بنشاط primase.وينبغي أن يكون لدى أي شخص يعمل مع الإشعاع فهم دقيق للوائح والأخطار المرتبطة باستخدام الإشعاع المؤين. يجب أن يخضع للتدريب وينبغي أن تعمل مع معدات السلامة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

جزيء واحد بسيطة وقوية وعالية إنتاجية تدفق تمتد مقايسة التنفيذ لدراسة نقل جزيئات على طول الحمض النووي

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

بوليميراز الدنا نشاط الإنزيم استخدام القريبة من الأشعة تحت الحمراء الحمض النووي المسمى الفلورسنت تصور بالتفريد هلام الاكريلاميد

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

الحمض النووي تلطيخ الأسلوب استناداً إلى هطول الأمطار Formazan الناجمة عن التعرض للضوء الأزرق

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

التفريد الحمض النووي باستخدام أورانج Thiazole بدلاً من اثيديوم بروميد أو الأصباغ البديلة

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

مقايسة مثيلة الحمض النووي المقترنة بالنوكلياز الداخلي القائمة على التألق المستمر لفحص مثبطات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...