Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
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这项研究得到了以色列科学基金会（第1023/18号赠款）的支持。

1. 微阵列设计
注：DNA探针代表定制的36核苷酸序列，由位于两个可变侧翼区域之间的T7DNA原发酶（GTC）的识别位点组成，然后是与玻璃滑动3系成的恒定的24核苷酸序列。我们使用 4 x 180，000 微阵列格式，该格式允许在幻灯片上随机分布的六个复制中发现每个 DNA 序列。
<ol><li>
具有已知识别序列的灵原体DNA库设计
	<ol>
<li>确保每个序列由60个核苷?...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

PBM方法已广泛用于研究转录因子的结合特性，还可用于DNA处理酶，如DNA原发酶，这些酶与低亲和力的DNA结合。然而，实验程序需要某些修改。微阵列实验涉及几个步骤：DNA库的设计、芯片的制备、蛋白质靶点结合、荧光标记和扫描。轻度洗涤步骤至关重要，因为长时间使用含有洗涤剂的溶液会导致蛋白质与DNA模板分离，因为结合的弱/瞬态模式。其他关键步骤包括结合条件（例如，缓冲物组合、辅...

HTPP利用DNA结合微阵列技术与生化分析相结合（图1），从统计学上识别影响DNA原发酶酶酶活性的DNA模板的具体特征。因此，HTPP 提供了一个技术平台，有助于该领域的知识飞跃。用于确定原始酶识别站点的经典工具无法生成大量数据，而 HTPP 则无法生成。
PBM是一种常用的技术，用于确定转录因子与DNA1、2的结合偏好;然而，它不适合检测蛋白质与DNA的弱/瞬态结合。与向由八个碱基对组成的所有可能序列提供平均蛋白质结合特异性信息的通用 PBM 不同，HTPP 基于包含独特序列元素的单链 DNA 模板库。这种DNA序列元素涉及数以万计的短（几十bp）基因组序列，以及计算设计的DNA序列，这些序列丰富于基因组中某些DNA重复序列元素中，这些序列具有不同的平均GC含量.这种高通量方法允许以系统、定量和假设驱动的方式确定对原性酶结合及其酶活性3重要的序列相关属性。特别是，在这种酶系4中，已确定了原始酶-DNA结合偏好（由DNA序列在特定的三核苷酸结合位点两侧调节）和原始酶过程性之间的重要联系。
这项新技术被应用来重新审视我们对灵酶识别位点的理解，甚至对于T7DNA原性酶，已经被广泛研究5。具体来说，重新审查经典概念，如T7 DNA原发酶的DNA识别位点（这是近40年前确定6）使用蛋白质-DNA结合微阵列（PBM）已导致前所未有的洞察与这些识别站点的侧翼序列3。预计T7DNA原发酶（5'-GTC-3'）三核苷酸识别位点两侧的序列将是随机的。相反，我们发现TG丰富的侧翼序列增加了T7 DNA原始酶合成较长RNA引注的机会，表明工艺性增加。
其他可用于研究体外蛋白质DNA结合特性的方法包括电泳移动转移测定（EMSA）7、DNase I足迹8、表面质子共振（SPR）9和西南印迹10.然而，这些低通量方法只适用于研究少量DNA序列。此外，其中一些技术（例如 EMSA）的精度和灵敏度较低。另一方面，体外选择11是一种技术，与PBM类似，可用于识别许多结合序列。然而，在大多数体外选择应用中，通常排除低亲和序列;因此，此方法不适合获取所有可用序列的比较绑定数据。通用PBM1，2主要用于描述原核生物和真核生物转录因子的结合特性，以及特定因素（例如，某些配体、辅助因子等）可能影响此交互12。
HTPP 将前所未有的高通量统计能力与高精度相结合，提供结合序列上下文的信息，将 PBM 应用扩展到 DNA 处理酶。由于上述其他可用技术的技术限制，尚未获得灵性酶和相关酶（与DNA具有弱/瞬态结合）的数据。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

脱氧核糖核酸（DNA）原始酶合成短RNA引物，在DNA复制过程中通过DNA聚合酶启动Okazaki片段的DNA合成。原核DnaG样原蛋白酶与DNA结合发生在特定的三核苷酸识别序列中。这是冈崎碎片形成的关键一步。用于确定DNA原生酶DNA识别序列的传统生化工具只提供了有限的信息。使用高通量微阵列结合测定和连续生化分析，已经表明1）特定的结合背景（识别部位的粘结序列）影响DNA原发性酶与其模板的结合强度脱氧核糖核酸（DNA）和2）使原性酶与DNA结合得更强烈，从而产生更长的RNA引结，表明酶的工艺性更高。该方法结合了PBM和原发酶活性测定，被指定为高通量原发性酶分析（HTPP），允许在前所未有的时间和可扩展性下，通过DNA原发酶对特定序列识别进行表征。

这种绘制原始酶结合位点的技术进步使得获得DNA结合特性，即使不是不可能的话，也很难用经典工具观察。更重要的是，HTPP 能够重新审视对原始酶结合位点的传统理解。具体来说，HTPP揭示了结合特性，除了已知的5'-GTC-3'识别序列，这导致T7DNA原代酶的功能活动的变化。即，确定了两组序列：侧翼包含T/G的强结合DNA序列和侧翼中含有A/G的弱结合序列（强结合模板中的所有?...

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

蛋白质结合微阵列（PBM）实验与生化测定相结合，将DNA原蛋白酶的结合和催化特性联系起来，DNA原蛋白酶是一种在模板DNA上合成RNA引体的酶。该方法被指定为高通量原发性酶分析（HTPP），可用于揭示各种酶的DNA结合模式。

DNA序列识别利用高通量原酶分析的DNAPrimase

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

该协议描述了从蛋白质-DNA结合微阵列中收集的海量数据，用于原始酶，这种酶暂时与特定的DNA序列结合，进而催化RNA底源的形成。本视频将介绍微阵列技术如何帮助重新定义原始序列识别站点，以及高吞吐量方法如何与经典生物化学称赞。该技术结合了两种方法：原始DNA结合微阵列和原始活性测定。微阵列提供与DNA序列结合的大量原始数据，其中生化测定通过DNA原始提供RNA底源形成的信息。测试的酶活性取决于微阵列实验的洞察力及其较低的吞吐量。探讨结合效率、DNA序列选择与酶活性之间的联系。使用微阵列识别序列确定性，使我们能够根据微阵列的海量数据得出准确的结论。到目前为止，这种方法已经用于描述转录因子的DNA结合序列。转录因子是与DNA紧密结合的静态蛋白质。演示程序将是斯特凡·伊利奇。要开始此过程，请将微阵列幻灯片放入包含 0.01% Triton-X 100 的科普林罐中，以预先湿润。在实验室旋转器上旋转，增加 125 rpm，持续 5 分钟。将阻塞溶液移入塑料盒中。然后从科普林罐中取下微阵列幻灯片。使用精细擦拭来驱动幻灯片的非 DNA 侧和边缘。慢慢地将微阵列放入塑料盒中。在室温下孵育一小时，缓慢摇晃。在此之后，用 PBS 中的 0.01% Tween-20 洗一次幻灯片。在实验室旋转器上，转速为 125 rpm，持续 5 分钟。取出 Tween-20，在实验室转速为 125 rpm 的实验室旋转器上用 0.01% Triton-X 100 在 PBS 中冲洗一次幻灯片，持续两分钟。然后快速将幻灯片转移到包含 PBS 的科普林罐中。首先，按文本协议中概述的组装 PMB 腔室。将幻灯片放入指定空间。用钳子推下去，然后向左推。将硅垫片放在顶部，确保其与 PBM 腔室的下部对齐。然后关闭腔室，对角线拧紧螺钉。将蛋白质结合的混合物移入垫片的每个井中。然后，在室温下孵育30分钟。首先，将 PBS 中的移液器 0.05%Tween-20 放入 PBM 腔室，以短暂清洗幻灯片。使用真空吸气器，从腔室的孔中去除溶液，小心不要接触DNA斑点。重复一遍，用 PBS 短暂清洗幻灯片。并使用真空从腔室的孔中去除溶液，同时小心不要接触DNA斑点。接下来，在PBM腔室的每个孔中加入Alexa 488结合的抗他抗体。在室温下在黑暗中孵育30分钟。在此之后，通过在每个井中加入 PBS 中的几滴 0.05%Tween-20 来短暂清洗 PBM 腔室内的幻灯片。并使用真空吸气器从腔室的孔中去除溶液，小心不要接触DNA斑点。拆解 PBM 腔室并拆下幻灯片。在 PBS 中 0.05%Tween-20 中冲洗幻灯片两次，每次冲洗持续三分钟。然后，在 PBS 中冲洗幻灯片两次，每次冲洗持续三分钟。一次双蒸馏水三分钟。用压缩空气擦干滑梯。将它们存放在黑暗的幻灯片框中，直到准备扫描。准备就绪后，使用微阵列扫描仪扫描芯片，其激发为 495 纳米，发射为 19 纳米。并收集中位荧光强度。本研究 pi 吞吐量原始分析用于映射原始绑定站点，包括那些使用经典工具（如果不是不可能）难以观察的站点。重要的是，pi 吞吐量原始分析能够重新访问对原始绑定站点的传统理解。特别是 pi 吞吐量原始分析除了显示已知的 5'GTC3'识别序列外，还揭示了结合特性，这会导致 T7 DNA 原始源的功能活动发生变化。也就是说，标识两组序列。在齿面中含有TG的强结合DNA序列和在齿面中含有AG的弱结合DNA序列。未检测到序列中缺少 5'GTC3'的 DNA 模板的原始结合。原始DNA识别位点包含特定特征，如TG丰富的侧翼，增加原始DNA结合高达10倍。令人惊讶的是，它们也会增加新形成的RNA的长度。重要的是，高通量原始分析使我们能够观察和量化底转长度相对于DNA模板序列的变异性。执行此过程时，清洗步骤应很微妙。缓冲区应包含记录DNA原始成分的组件。此外，徒劳结合事件的阈值也是生化决定的。因此，对微阵列的分析是不够的。表面等离子体共振和凝胶移位测定等方法可以确定原始基因的结合亲和力，以选择DNA序列。我的实验室实现了机器学习预测模型，以检测原始序列决定因素，产生可由DNA聚合酶扩展的生产性底转器。在大数据时代，对大数据进行分析的统计方法的实现，必将有助于更好地描述特定的DNA序列，并将序列识别与原始序列的活动联系起来。任何从事辐射工作的人应全面了解与使用电离辐射有关的法规和危害。应接受培训，并应与安全设备一起工作。

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