Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Israels VIDENSKABS fond (Grant nr. 1023/18).

1. design af mikroarray
Bemærk: DNA-sonder repræsenterer brugerdefinerede 36-nukleotidsekvenser, der består af anerkendelses stedet for T7 DNA primase (GTC), som ligger mellem to variable flankenregioner, efterfulgt af en konstant 24-nukleotidsekvens, der er bundet til et glas dias3. Vi brugte et 4 x 180.000 microarray format, som aktiverede spotting af hver DNA sekvens i seks replikater, tilfældigt fordelt på diaset.
<ol><li>
Design af DNA-bibliotek for ...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

Den PBM metode har været meget anvendt til at undersøge bindende egenskaber af transkriptionsfaktorer og kan også anvendes til DNA-behandling enzymer, såsom DNA primase, der binder sig til DNA med lav affinitet. Der kræves dog visse ændringer af forsøgsprocedurerne. Mikroarray eksperimentet involverer flere trin: design af DNA-biblioteket, forberedelse af chippen, binding af protein målet, fluorescerende mærkning og scanning. Milde vaske trin er kritiske, da de lange skylninger med opløsninger, der indeholder r...

HTPP gør brug af DNA binding microarray teknologi kombineret med biokemisk analyse (figur 1) til statistisk at identificere specifikke funktioner i DNA-skabeloner, der påvirker den enzymatiske aktivitet af DNA primase. Derfor giver HTPP en teknologisk platform, der letter et videnspring i marken. De klassiske værktøjer, der anvendes til at bestemme primase anerkendelse sites ikke har evnen til at give massive mængde data, mens HTPP gør.
PBM er en teknik, der rutinemæssigt anvendes til at bestemme de bindende præferencer for transkriptionsfaktorer til DNA1,2; Det er dog ikke egnet til påvisning af svag/forbigående binding af proteiner til DNA. I modsætning til Universal PBM, der giver oplysninger om gennemsnitlig proteinbinding specificitet til alle mulige sekvenser bestående af otte base par, er HTPP baseret på biblioteket af enkelt-strandede DNA-skabeloner, der omfatter unikke sekvens elementer. Sådanne DNA sekvens elementer involverer titusinder kort (få snesevis af BP) genomiske sekvenser, samt computationelt designede DNA-sekvenser beriget i visse DNA gentagne sekvens elementer til stede i genomet, som besidder forskellige gennemsnitlige GC indhold . En sådan tilgang med høj gennemløb gør det muligt på en systematisk, kvantitativ og hypotese drevet måde at fastslå de sekvens relaterede egenskaber, der er vigtige for primase binding og dens enzymatiske aktivitet3. Navnlig er den vigtige forbindelse mellem primase-DNA-bindende præferencer (moduleret af DNA-sekvenser, der flanserer specifikke Tri-nucleotid-bindingssteder) og primase processivitet blevet identificeret for dette enzymatiske system4.
Den nye teknologi blev anvendt til at revidere vores forståelse af primase anerkendelse sites selv for T7 DNA primase, der er blevet grundigt undersøgt5. Specifikt, re-undersøgelse af klassiske begreber, såsom DNA-anerkendelse sites af T7 DNA primase (som blev fastsat næsten fire årtier siden 6) ved hjælp af protein-DNA binding microarray (PBM) har ført til hidtil uset indsigt i funktioner relateret til den ledsage sekvens af disse anerkendelse sites3. Det blev forventet, at sekvenser ledsage Tri-nucleotid anerkendelse site af T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') vil være tilfældig. I stedet, vi fandt, at TG-rige flankerende sekvenser øge chancerne for T7 DNA primase at syntetisere længere RNA primere indikerer en stigning i processivitet.
Andre metoder, der kan anvendes til at studere DNA-bindende egenskaber af proteiner in vitro omfatter den elektroforetiske mobilitets Skift assay (EMSA)7, DNase I fodaftryk8, overflade-Plasmon resonans (spr)9, og sydvestlige blotting 10. disse er dog, lav-gennemløb metoder kun gælder for at undersøge et lille antal DNA-sekvenser. Desuden er præcisionen og følsomheden af nogle af disse teknikker (f. eks. EMSA) lav. På den anden side, in vitro udvælgelse11 er en teknik, der, på samme måde som PBM, kan bruges til identifikation af talrige bindende sekvenser. Men, lav affinitet sekvenser er normalt udelukket i de fleste anvendelser af in vitro udvælgelse; Derfor er denne fremgangsmåde ikke egnet til at opnå sammenlignelige bindings data for alle tilgængelige sekvenser. Den universelle PBM1,2 bruges primært til at karakterisere de bindende karakteristika af transkriptionsfaktorer fra prokaryoter og eukaryoter samt specifikke faktorer (f. eks. tilstedeværelsen af visse ligands, cofaktorer osv.), der kan påvirke denne interaktion12.
HTPP udvider PBM-applikationen til DNA-forarbejdnings enzymer ved at kombinere hidtil uset statistisk effekt med høj gennemløb med høj præcision for at give oplysninger om bindings sekvens konteksten. Sådanne data er endnu ikke opnået for primases og relaterede enzymer (der har svag/forbigående binding til DNA) på grund af førnævnte tekniske begrænsninger af andre tilgængelige teknikker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA primase syntetiserer korte RNA primere, der initierer DNA-syntese af Okazaki fragmenter på den tilbagestående streng ved DNA-Polymerase under DNA-replikering. Bindingen af prokaryote dnag-lignende primases til DNA sker ved en specifik trinucleotid genkendelsessekvens. Det er et afgørende skridt i dannelsen af Okazaki fragmenter. Konventionelle biokemiske værktøjer, der anvendes til at bestemme DNA-genkendelse sekvens af DNA primase giver kun begrænset information. Ved hjælp af en mikroarray baseret bindings test med høj gennemløb og på hinanden følgende biokemiske analyser er det blevet påvist, at 1) den specifikke bindende kontekst (flankensekvens af anerkendelses stedet) påvirker DNA-primases bindende styrke til dens skabelon DNA, og 2) stærkere binding af primase til DNA giver længere RNA primere, hvilket indikerer højere processivitet af enzymet. Denne metode kombinerer PBM og primase Activity assay og er udpeget som høj gennemløb primase profilering (HTPP), og det giver mulighed for karakterisering af specifikke sekvens genkendelse af DNA primase i hidtil uset tid og skalerbarhed.

Dette teknologiske frem forskud til kortlægning af primase bindingssteder gør det muligt at opnå DNA-bindingsegenskaber, der er svære, hvis ikke umulige, at observere ved hjælp af klassiske værktøjer. Endnu vigtigere er det, at HTPP gør det muligt at genbesøge den traditionelle forståelse af primase bindingssteder. Specifikt, HTPP afslører bindende særtræk i tillæg til kendte 5 '-GTC-3 ' anerkendelse sekvenser, hvilket fører til ændringer i funktionelle aktiviteter af T7 D...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Protein binding microarray (PBM) eksperimenter kombineret med biokemiske assays forbinder bindende og katalytiske egenskaber af DNA primase, et enzym, der syntetiserer RNA primere på Template DNA. Denne metode, der er udpeget som et højt gennemløb primase profilering (HTPP), kan bruges til at afsløre DNA-bindende mønstre af en række enzymer.

DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Denne protokol beskriver indsamling af massive data fra protein-DNA bindende microarray for primase, et enzym, der transiently binder sig til specifikke DNA-sekvenser og til gengæld katalyser dannelse af RNA primere. Denne video vil dække, hvordan microarray teknologi kan hjælpe med at omdefinere primase sekvens anerkendelse websteder, og hvordan en høj gennemløb tilgang kan komplimentere klassiske biokemi. Denne teknik kombinerer to tilgange: primase DNA bindende microarray og primase aktivitet assay.Microarray giver massive data om primase binding til DNA-sekvenser, hvor som den biokemiske analyse giver oplysninger om RNA primer dannelse ved DNA primase. Den testede enzymatiske aktivitet afhænger af indsigten fra microarray eksperimentet og dets lavere gennemløb i sin natur. Forbindelsen mellem bindingens effektivitet, valg af DNA-sekvens og enzymets aktivitet undersøges.Identifikation af sekvens determinance ved hjælp af microarray, giver os mulighed for at drage præcise konklusioner baseret på massive data af microarray. Denne fremgangsmåde er hidtil blevet brugt til at beskrive DNA-bindende sekvenser af transskriptionsfaktorer. Transskription faktorer er statiske proteiner, der binder stramt til DNA.Demonstration af proceduren vil være Stefan Ilic. For at starte denne procedure, pre våd microarray dias ved at placere den i en coplin krukke, der indeholder 0,01% Triton-X 100. Og rotere på en lab rotator, tilføje 125 rpm i fem minutter.Pipette blokeringsopløsningen i en plastikkasse. Fjern derefter mikroarray-rutsjebanen fra coplin-krukken. Brug en fin klud til at køre ikke-DNA side og kanter af diaset.Placer langsomt mikroarray i plastikkassen. Inkuber ved stuetemperatur i en time med langsom omrystning. Derefter vaskes sliden én gang med 0,01% Tween-20 i PBS.På en lab rotator ved 125 omdrejninger i fem minutter. Fjern Tween-20 og skyl diaset én gang med 0,01%Triton-X 100 i PBS på en lab rotator ved 125 omdrejninger i to minutter. Overfør derefter hurtigt diaset til en coplin krukke, der indeholder PBS.Først skal du samle PMB-kammeret som beskrevet i tekstprotokollen. Placer diaset i det angivne område. Brug en pincet til at skubbe den ned og venstre.Placer siliciumpakningen på toppen, og sørg for, at den er godt på linje med den nederste del af PBM-kammeret. Luk derefter kammeret og stram skruerne diagonalt. Pipette proteinbindende blandingen i hver brønd af pakningen.Derefter inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter. Til at begynde, pipette 0,05% Tween-20 i PBS i PBM kammer til kort vaske dias. Ved hjælp af en vakuumaspirator skal du fjerne opløsningen fra kammerets brønde og være omhyggelig med ikke at røre DNA-pletterne.Gentag dette, vask kortvarigt sliden med PBS. Og brug vakuum til at fjerne opløsningen fra brøndene i kammeret og samtidig være omhyggelig med ikke at røre DNA-pletterne. Dernæst tilføje Alexa 488 konjugeret anti-hans antistof til hver brønd af PBM kammer.Inkuberes i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter. Derefter vaskes glidet kort inde i PBM-kammeret ved at tilføje et par dråber på 0,05% Tween-20 i PBS i hver brønd. Og brug vakuumaspiratoren til at fjerne opløsningen fra kammerets brønde, og pas på ikke at røre DNA-pletterne.Adskil PBM-kammeret, og fjern rutsjebanen. Skyl diasene to gange i 0,05%Tween-20 i PBS, med hver skylning varer tre minutter. Skyl derefter objektglassene to gange i PBS, hvor hver skylning varer tre minutter hver.Og en gang i dobbelt destilleret vand i tre minutter. Tør objektglassene med trykluft. Og opbevar dem i en mørk slideboks, indtil de er klar til at scanne.Når du er klar, skal du bruge en microarray scanner til at scanne chippen med en excitation af 495 nanometer og en emission på 19 nanometer. Og indsamle median fluorescens intensitet. I denne undersøgelse pi gennemløb primase profilering bruges til at kortlægge de primase bindende steder, herunder dem, der er vanskelige, hvis ikke umuligt at observere ved hjælp af klassiske værktøjer.Det er vigtigt, at pi-overførselshastigheden for primase profilering gør det muligt at revidere den traditionelle forståelse af primase bindingssteder. Især pi gennemløb primase profilering afslører bindende specificiteter ud over kendte 5'GTC3'anerkendelse sekvenser, hvilket fører til ændringer i funktionelle aktiviteter T7 DNA primase. Nemlig, to grupper af sekvenser er identificeret.Stærke bindende DNA-sekvenser, der indeholdt TG i flankerne og svage bindende DNA-sekvenser, der indeholdt AG i flankerne. Der blev ikke fundet nogen primase binding til DNA-skabeloner, der manglede 5'GTC3'inden for deres sekvenser. De primase DNA anerkendelse steder, der indeholder specifikke funktioner såsom TG rige flanker, øge primase DNA bindende op til 10 gange.Overraskende nok øger de også længden af nydannet RNA. Det er vigtigt, at høj overførselshastighed primase profilering giver os mulighed for at observere og kvantificere variabiliteten i primerlængde i forhold til sekvensen af DNA-skabelonen. Når du udfører denne procedure vasketrinnene bør være subtile.Og buffere skal indeholde komponenter, der loggede primase på DNA. Også en tærskel for forgæves bindende begivenheder bestemmes biokemisk. Derfor er analysen af mikroarray utilstrækkelig.Metoder som en overflade plasma resonans og gel skift analyser kan bestemme bindende affinitet primase at vælge DNA-sekvenser. Mit laboratorium implementerer maskinlæring forudsigelse modeller til at opdage primase sekvens determinanter, der giver produktive primere, der kan udvides med DNA polymerase. I en tid med big data, en gennemførelse af statistiske metoder til at analysere big data, vil teknikken helt sikkert bidrage til bedre at karakterisere specifikke DNA-sekvenser og knytte sekvensgenkendelsen til aktiviteten af primase.Enhver, der arbejder med stråling bør have en grundig forståelse af regler og farer i forbindelse med brugen af iioniserende stråling. Bør gennemgå uddannelse og bør arbejde med sikkerhedsudstyr.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høj overførselshastighed enkelt molekyle Flow strækker Assay gennemførelse for at studere Transport af molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing af DNA-fragmenter i realtid af Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet Assay ved hjælp af nær-infrarødt fluorescerende mærket DNA visualiseret af acrylamid Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA farvning metode baseret på formazankoncentrationen nedbør induceret af blå lys eksponering

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Real-time overvågning af DNA streng Exchange reaktion medieret af Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA elektroforese ved hjælp af Thiazole Orange i stedet for ethidiumbromid eller Alternative farvestoffer

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaseret endonukleasekoblet DNA-methyleringsassay til screening for DNA-methyltransferasehæmmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...