Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Dit onderzoek werd gesteund door de ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1023/18).

1. ontwerp van Microarray
Opmerking: DNA-sondes vertegenwoordigen aangepaste 36-nucleotide-sequenties, bestaande uit de herkennings plaats voor T7 DNA primase (GTC), gelegen tussen twee variabele flankerende gebieden, gevolgd door een constante 24-nucleotide sequentie die is aangesloten op een glas Slide3. We gebruikten een 4 x 180.000 Microarray formaat, die het spotten van elke DNA sequentie in zes replicaten mogelijk gemaakt, willekeurig verdeeld over de glijbaan.
...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

De PBM-methode is op grote schaal gebruikt om bindende eigenschappen van transcriptiefactoren te onderzoeken en kan ook worden toegepast op DNA-verwerkings enzymen, zoals DNA primase, die binden aan DNA met een lage affiniteit. Er zijn echter bepaalde wijzigingen van experimentele procedures vereist. Het microarray-experiment omvat verschillende stappen: ontwerp van de DNA-bibliotheek, voorbereiding van de chip, binding van het eiwit doelwit, fluorescerende labeling en scannen. Milde wasstappen zijn van cruciaal belang, ...

HTPP maakt gebruik van DNA-bindende microarray-technologie in combinatie met biochemische analyse (Figuur 1) om statistisch specifieke kenmerken van DNA-templates te identificeren die de enzymatische activiteit van DNA primase beïnvloeden. Daarom biedt HTPP een technologisch platform dat een kennis sprong in het veld vergemakkelijkt. De klassieke instrumenten die worden gebruikt om de Primase herkennings locaties te bepalen, hebben niet de mogelijkheid om enorme hoeveelheden gegevens te leveren, terwijl HTPP dat wel doet.
PBM is een techniek die routinematig wordt gebruikt om de bindende voorkeuren van transcriptiefactoren te bepalen naar DNA1,2; het is echter niet geschikt voor het opsporen van zwakke/voorbijgaande binding van eiwitten aan DNA. In tegenstelling tot de universele PBM die informatie verschaft over de gemiddelde eiwit bindende specificiteit van alle mogelijke sequenties bestaande uit acht basis paren, is HTPP gebaseerd op de bibliotheek van enkel-streng DNA-templates, bestaande uit unieke sequentie-elementen. Dergelijke DNA sequentie elementen omvatten tienduizenden korte (enkele tientallen BP) genomische sequenties, evenals computationeel ontworpen DNA sequenties verrijkt in bepaalde DNA repetitieve sequentie elementen aanwezig in het genoom, die beschikken over verschillende gemiddelde GC inhoud . Een dergelijke aanpak met hoge doorvoer maakt het mogelijk om, op een systematische, kwantitatieve en hypothese-gestuurde manier, de sequentie-gerelateerde eigenschappen te bepalen die belangrijk zijn voor de binding van Primase en de enzymatische activiteit3. In het bijzonder is het belangrijke verband tussen de voorkeuren van Primase-DNA-binding (gemoduleerd door DNA-sequenties flankerende specifieke Tri-nucleotide binding sites) en Primase processiviteit geïdentificeerd voor dit enzymatische systeem4.
De nieuwe technologie werd toegepast om onze kennis van de herkenningspunten van Primase te herbekijken, zelfs voor de T7 DNA primase die uitgebreid is bestudeerd5. In het bijzonder heeft het opnieuw onderzoeken van klassieke concepten, zoals DNA-herkennings locaties van T7 DNA primase (die bijna vier decennia geleden werden vastgesteld 6) met behulp van PROTEÏNE-DNA binding Microarray (PBM) geleid tot ongekend inzicht in functies die verband houden met de flankerende volgorde van deze herkennings locaties3. Verwacht werd dat de sequenties flankerende Tri-nucleotide herkenning plaats van T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') willekeurig zal zijn. In plaats daarvan ontdekten we dat TG-rijke flankerende sequenties de kans van T7 DNA primase vergroten om langere RNA-primers te synthetiseren die wijzen op een toename van processiviteit.
Andere methoden die kunnen worden gebruikt om DNA-bindende eigenschappen van eiwitten in vitro te bestuderen, zijn onder andere de elektroforetisch Mobility Shift assay (EMSA)7, DNase I Footprinting8, Surface-Plasmon Resonance (SPR)9en zuidwestelijke blotting 10. Dit zijn echter methoden met een lage doorvoer die alleen van toepassing zijn op het onderzoeken van een klein aantal DNA-sequenties. Bovendien is de nauwkeurigheid en gevoeligheid van sommige van deze technieken (bijv. EMSA) laag. Aan de andere kant is in vitro selectie11 een techniek die, net als PBM, kan worden gebruikt voor de identificatie van talrijke bindings sequenties. Echter, lage affiniteit reeksen worden meestal uitgesloten in de meeste toepassingen van in vitro selectie; Daarom is deze benadering niet geschikt voor het verkrijgen van vergelijkende bindingsgegevens voor alle beschikbare reeksen. De universele PBM1,2wordt voornamelijk gebruikt om de bindende kenmerken van transcriptiefactoren van prokaryoten en eukaryoten te karakteriseren, evenals specifieke factoren (bijv. de aanwezigheid van bepaalde liganden, cofactoren, enz.) die kunnen invloed op deze interactie12.
HTPP breidt de PBM-toepassing uit naar DNA-verwerkings enzymen door ongekende hoge doorvoer statistisch vermogen te combineren met hoge precisie om informatie te bieden over de bindings sequentie context. Dergelijke gegevens zijn nog niet verkregen voor primases en verwante enzymen (die een zwakke/voorbijgaande binding hebben met DNA) als gevolg van bovengenoemde technische beperkingen van andere beschikbare technieken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA primase synthetiseert korte RNA-primers die DNA-synthese van Okazaki fragmenten op de achterblijvende streng door DNA-polymerase tijdens DNA-replicatie initiëren. De binding van prokaryotische DnaG-achtige primases aan DNA vindt plaats in een specifieke trinucleotide-herkennings sequentie. Het is een cruciale stap in de vorming van Okazaki fragmenten. Conventionele biochemische hulpmiddelen die worden gebruikt om de DNA-herkennings volgorde van DNA primase te bepalen, bieden slechts beperkte informatie. Met behulp van een op hoge doorvoer microarray gebaseerde bindende assay en opeenvolgende biochemische analyses, is aangetoond dat 1) de specifieke bindende context (flankerende sequenties van de herkennings plaats) de bindende sterkte van het DNA primase op zijn template beïnvloedt DNA, en 2) sterkere binding van Primase aan het DNA levert langere RNA-primers op, wat duidt op een hogere processiviteit van het enzym. Deze methode combineert PBM en Primase activity assay en is aangewezen als high-throughput Primase profilering (HTPP), en het maakt karakteriseren van specifieke sequentie herkenning door DNA primase in ongekende tijd en schaalbaarheid mogelijk.

Deze technologische voorsprong voor het in kaart brengen van de Primase bindingsplaatsen maakt het verkrijgen van DNA bindings eigenschappen die moeilijk, zo niet onmogelijk zijn, te observeren met behulp van klassieke gereedschappen. Nog belangrijker is dat HTPP het herbezoeken van het traditionele begrip van de bindende sites van Primase mogelijk maakt. In het bijzonder onthult HTPP bindende specifieke kenmerken naast bekende 5 '-GTC-3 ' herkennings sequenties, wat leidt tot verandering...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Experimenten met eiwitbinding Microarray (PBM) in combinatie met biochemische assays koppelen de bindende en katalytische eigenschappen van DNA primase, een enzym dat RNA-primers op Template DNA synthetiseert. Deze methode, aangeduid als high-throughput Primase profilering (HTPP), kan worden gebruikt om DNA-bindende patronen van een verscheidenheid aan enzymen te onthullen.

DNA-sequentie herkenning door DNA primase met behulp van high-throughput Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Dit protocol beschrijft het verzamelen van massieve gegevens uit eiwit-DNA bindende microarray voor primase, een enzym dat zich van voorbijgaande aard bindt aan specifieke DNA-sequenties en op zijn beurt de vorming van RNA-primers katalyseert. Deze video zal bespreken hoe microarray-technologie kan helpen bij het herdefiniëren van primase sequentieherkenningssites en hoe een hoge doorvoerbenadering de klassieke biochemie kan complimenteren. Deze techniek combineert twee benaderingen: primase DNA bindende microarray en primase activiteit test.De microarray levert enorme gegevens van primase binding aan DNA-sequenties, waar als de biochemische test geeft informatie over RNA primer vorming door DNA primase. De geteste enzymatische activiteit is afhankelijk van het inzicht van het microarray-experiment en de lagere doorvoer in zijn aard. Het verband tussen de efficiëntie van binding, DNA-sequentieselectie en de activiteit van het enzym wordt onderzocht.Identificatie van sequentiebepaling met behulp van microarray, stelt ons in staat om nauwkeurige conclusies te trekken op basis van enorme gegevens van de microarray. Deze aanpak is tot nu toe gebruikt om DNA-bindende sequenties van transcriptiefactoren te beschrijven. Transcriptiefactoren zijn statische eiwitten die zich nauw binden aan DNA.Het aantonen van de procedure zal Stefan Ilic zijn. Om deze procedure te beginnen, maak de microarray-dia voor nat door deze in een coplinpot te plaatsen met 0,01%Triton-X 100. En draaien op een lab rotator, voeg 125 rpm voor vijf minuten.Pipette de blokkerende oplossing in een plastic doos. Verwijder vervolgens de microarray-dia uit de coplin-pot. Gebruik een fijne doekje om de niet-DNA-kant en randen van de dia aan te drijven.Plaats de microarray langzaam in de plastic doos. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een uur met langzaam schudden. Daarna was je de glijbaan één keer met 0,01%Tween-20 in PBS.Op een lab rotator bij 125 rpm gedurende vijf minuten. Verwijder de Tween-20 en spoel de glijbaan één keer af met 0,01%Triton-X 100 in PBS op een labdrammer bij 125 tpm gedurende twee minuten. Breng de glijbaan vervolgens snel over naar een coplin-pot met PBS.Stel eerst de PMB-kamer samen zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de dia in de aangewezen ruimte. Gebruik een pincet om het naar beneden en naar links te duwen.Plaats de siliciumpakking op de top, zorg ervoor dat het goed is uitgelijnd met het onderste deel van de PBM-kamer. Sluit vervolgens de kamer en draai de schroeven diagonaal aan. Pipette het eiwitbindingsmengsel in elke put van de pakking.Vervolgens, incubeer op kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Om te beginnen, pipet 0,05%Tween-20 in PBS in de PBM-kamer om de glijbaan kort te wassen. Verwijder met behulp van een vacuüm-aspirator de oplossing uit de putten van de kamer en wees erop dat u de DNA-vlekken niet aanraakt.Herhaal dit, was de glijbaan kort met PBS. En gebruik het vacuüm om de oplossing uit de putten van de kamer te verwijderen terwijl je voorzichtig bent om de DNA-vlekken niet aan te raken. Voeg vervolgens Alexa 488 geconjugeerde anti-Zijn Antibodie toe aan elke put van de PBM-kamer.Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Daarna, kort wassen van de dia in de PBM kamer door het toevoegen van een paar druppels van 0,05% Tween-20 in PBS in elke put. En gebruik de vacuüm aspirator om de oplossing te verwijderen uit de putten van de kamer, voorzichtig om niet aanraken van de DNA-vlekken.DeG-kamer demonteren en de schuif verwijderen. Spoel de glijbanen twee keer in 0,05%Tween-20 in PBS, met elke spoeling van drie minuten. Spoel vervolgens de glijbanen twee keer in PBS, waarbij elke spoeling elk drie minuten duurt.En één keer in dubbel gedestilleerd water gedurende drie minuten. Droog de glijbanen met perslucht. En bewaar ze in een donkere diadoos tot ze klaar zijn om te scannen.Gebruik een microarrayscanner om de chip te scannen met een excitatie van 495 nanometer en een emissie van 19 nanometer. En verzamel de mediane fluorescentie intensiteit. In deze studie pi doorvoer primase profilering wordt gebruikt om de primase bindende sites in kaart te brengen, met inbegrip van die moeilijk, zo niet onmogelijk te observeren met behulp van klassieke instrumenten.Belangrijk is dat pi throughput primase profilering het mogelijk maakt om het traditionele begrip van primase binding sites opnieuw te bekijken. Vooral pi doorvoer primase profilering onthult bindende specificiteiten in aanvulling op bekende 5'GTC3'herkenning sequenties, wat leidt tot veranderingen in de functionele activiteiten van T7 DNA primase. Namelijk, twee groepen van sequenties worden geïdentificeerd.Sterke bindende DNA-sequenties die TG in de flanken en zwakke bindende DNA-sequenties bevatten die AG in de flanken bevatten. Er werden geen primase binding aan DNA-sjablonen gevonden die 5'GTC3' misten in hun sequenties. De primase DNA-herkenningsplaatsen die specifieke kenmerken bevatten, zoals TG-rijke flanken, verhogen de primase DNA-binding tot 10 keer.Verrassend genoeg verhogen ze ook de lengte van nieuw gevormd RNA. Belangrijk is dat hoge doorvoer primase profilering stelt ons in staat om te observeren en kwantificeren van de variabiliteit in primer lengte in relatie tot de volgorde van de DNA-sjabloon. Bij het uitvoeren van deze procedure moeten de wasstappen subtiel zijn.En buffers moeten componenten bevatten die de primase op het DNA hebben geregistreerd. Ook wordt een drempel van futiele bindende gebeurtenissen biochemisch bepaald. Daarom is de analyse van de microarray onvoldoende.Methoden zoals een oppervlakteplasmaresonantie en gelverschuivingstesten kunnen de bindende affiniteit van primase bepalen om de DNA-sequenties te selecteren. Mijn lab implementeert machine learning voorspellingsmodellen om primase sequentiedeterminanten te detecteren die productieve primers opleveren die kunnen worden uitgebreid met DNA polymerase. In het tijdperk van big data, een implementatie van statistische methoden om big data te analyseren, zal de techniek zeker helpen om specifieke DNA-sequenties beter te karakteriseren en de sequentieherkenning te koppelen aan de activiteit van primase.Iedereen die met straling werkt, moet een grondig inzicht hebben in de regelgeving en gevaren die gepaard gaan met het gebruik van ioniserende straling. Moet een opleiding volgen en moet werken met veiligheidsuitrusting.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Een eenvoudige, robuuste en hoge doorvoer enkel molecuul Flow uitrekkende Assay uitvoering voor de studie van vervoer van moleculen langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-Polymerase activiteit Assay gebruikend nabij-infrarood fluorescerende gelabelde DNA gevisualiseerd door Acrylamide Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA kleuring methode gebaseerd op Formazan neerslag veroorzaakt door blootstelling aan blauw licht

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Real-time opvolgen van de DNA Strand Exchange reactie gemedieerd door Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

De Elektroforese van het DNA met behulp van Thiazole oranje in plaats van ethidiumbromide of alternatieve kleurstoffen

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering en identificatie geïllustreerd door angiotensine II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...