Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Diese Forschung wurde von der ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Zuschuss Nr. 1023/18) unterstützt.

1. Design von Mikroarray
HINWEIS: DNA-Sonden stellen benutzerdefinierte 36-Nukleotid-Sequenzen dar, die aus der Erkennungsstelle für T7 DNA primase (GTC) bestehen, die sich zwischen zwei variablen Flankenbereichen befindet, gefolgt von einer konstanten 24-Nukleotid-Sequenz, die an einen Glasschlitten gebunden ist3. Wir verwendeten ein 4 x 180.000 Mikroarray-Format, das es ermöglichte, jede DNA-Sequenz in sechs Replikationen zu erkennen, die zufällig auf der Folie verte...

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	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

Die PBM-Methode wurde weit verbreitet, um bindungseigenschaften von Transkriptionsfaktoren zu untersuchen und kann auch auf DNA-Verarbeitungsenzyme wie DNA-Primase angewendet werden, die an DNA mit geringer Affinität binden. Es sind jedoch bestimmte Änderungen der Versuchsverfahren erforderlich. Das Mikroarray-Experiment umfasst mehrere Schritte: Entwurf der DNA-Bibliothek, Vorbereitung des Chips, Bindung des Proteinziels, fluoreszierende Kennzeichnung und Scannen. Milde Waschschritte sind entscheidend, da die langen W...

HTPP nutzt die DNA-bindende Mikroarray-Technologie in Kombination mit biochemischer Analyse (Abbildung 1), um spezifische Merkmale von DNA-Vorlagen, die die enzymatische Aktivität von DNA-Primase beeinflussen, statistisch zu identifizieren. Daher bietet HTPP eine technologische Plattform, die einen Wissenssprung auf diesem Gebiet erleichtert. Die klassischen Werkzeuge, die verwendet werden, um Primase-Erkennungs-Sites zu bestimmen, haben nicht die Fähigkeit, eine riesige Datenmenge zu liefern, während HTPP dies tut.
PBM ist eine Technik, die routinemäßig verwendet wird, um die Bindungspräferenzen von Transkriptionsfaktoren an DNA1,2zu bestimmen; es ist jedoch nicht geeignet, eine schwache/transiente Bindung von Proteinen an die DNA zu erkennen. Im Gegensatz zum universellen PBM, das Informationen über die durchschnittliche Proteinbindungsspezifität zu allen möglichen Sequenzen aus acht Basenpaaren liefert, basiert HTPP auf der Bibliothek einsträngiger DNA-Vorlagen, die einzigartige Sequenzelemente enthalten. Solche DNA-Sequenzelemente umfassen Zehntausende kurze (wenige Dutzend bp) genomische Sequenzen sowie computerisch gestaltete DNA-Sequenzen, die in bestimmten DNA-Wiederholungssequenzelementen angereichert sind, die im Genom vorhanden sind und unterschiedliche durchschnittliche GC-Gehalte aufweisen. . Ein solcher Ansatz mit hohem Durchsatz ermöglicht die systematische, quantitative und hypothesengesteuerte Bestimmung der sequenzbezogenen Eigenschaften, die für die Primasebindung und ihre enzymatische Aktivität wichtig sind3. Insbesondere wurde für dieses enzymatische Systemdiewichtige Verbindung zwischen Primase-DNA-Bindungspräferenzen (moduliert durch DNA-Sequenzen, die bestimmte Trinukleotid-Bindungsstellen flankieren) und der Primase-Prozessivität identifiziert 4 .
Die neue Technologie wurde angewendet, um unser Verständnis von Primase-Erkennungsstellen auch für die T7 DNA Primase zu überprüfen, die ausgiebig untersucht wurde5. Insbesondere die erneute Untersuchung klassischer Konzepte, wie DNA-Erkennungsstellen von T7-DNA-Primase (die vor fast vier Jahrzehnten bestimmt wurden 6) mit Protein-DNA-bindendem Mikroarray (PBM) hat zu beispiellosen Erkenntnissen in Merkmalen geführt, die mit die flankierende Reihenfolge dieser Erkennungsstellen3. Es wurde erwartet, dass die Sequenzen, die die Trinukleotid-Erkennungsstelle von T7 DNA Primase (5'-GTC-3') flankieren, zufällig sein werden. Stattdessen fanden wir heraus, dass TG-reiche Flankensequenzen die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass T7-DNA-Primse längere RNA-Primer synthetisieren, was auf eine Erhöhung der Prozessivität hindeutet.
Andere Methoden, die verwendet werden können, um DNA-bindende Eigenschaften von Proteinen in vitro zu untersuchen, sind der elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstest (EMSA)7, DNase I Footprinting8, Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)9und Southwestern Blotting 10. Dabei handelt es sich jedoch um Methoden mit geringem Durchsatz, die nur zur Untersuchung einer kleinen Anzahl von DNA-Sequenzen gelten. Darüber hinaus ist die Genauigkeit und Empfindlichkeit einiger dieser Techniken (z. B. EMSA) gering. Andererseits ist die In-vitro-Auswahl11 eine Technik, die ähnlich wie PBM zur Identifizierung zahlreicher Bindungssequenzen eingesetzt werden kann. Jedoch, niedrige Affinität Sequenzen sind in der Regel in den meisten Anwendungen der In-vitro-Auswahl ausgeschlossen; Daher ist dieser Ansatz nicht geeignet, vergleichende Verbindliche Daten für alle verfügbaren Sequenzen zu erhalten. Das universelle PBM1,2 wird hauptsächlich verwendet, um die Bindungsspezifitäten von Transkriptionsfaktoren von Prokaryoten und Eukaryoten sowie spezifische Faktoren (z. B. Vorhandensein bestimmter Liganden, Kofaktoren usw.) zu charakterisieren, die diese Interaktion beeinflussen12.
HTPP erweitert die PBM-Anwendung auf DNA-verarbeitungsenzyme, indem beispiellose statistische Leistung mit hohem Durchsatz mit hoher Präzision kombiniert wird, um Informationen über den Bindungssequenzkontext bereitzustellen. Solche Daten wurden für Primas und verwandte Enzyme (die eine schwache/transiente Bindung an die DNA haben) aufgrund der oben genannten technischen Beschränkungen anderer verfügbarer Techniken noch nicht gewonnen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA-Primase synthetisiert kurze RNA-Primer, die die DNA-Synthese von Okazaki-Fragmenten auf dem laggierenden Strang durch DNA-Polymerase während der DNA-Replikation initiieren. Die Bindung von prokaryotischen DnaG-ähnlichen Primasen an die DNA erfolgt in einer bestimmten Trinukleotid-Erkennungssequenz. Es ist ein entscheidender Schritt bei der Bildung von Okazaki-Fragmenten. Herkömmliche biochemische Werkzeuge, die zur Bestimmung der DNA-Erkennungssequenz von DNA-Primase verwendet werden, liefern nur begrenzte Informationen. Anhand eines mikroarraybasierten Bindungstests mit hohem Durchsatz und aufeinander folgenden biochemischen Analysen wurde gezeigt, dass 1) der spezifische Bindungskontext (flankierende Sequenzen der Erkennungsstelle) die Bindungsfestigkeit der DNA-Primase an ihre Schablone beeinflusst. DNA und 2) eine stärkere Bindung von Primase an die DNA ergibt längere RNA-Primer, was auf eine höhere Prozessivität des Enzyms hindeutet. Diese Methode kombiniert PBM und Primase Aktivität Assay und wird als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet, und es ermöglicht die Charakterisierung der spezifischen Sequenzerkennung durch DNA-Primase in beispielloser Zeit und Skalierbarkeit.

Dieser technologische Fortschritt für die Kartierung der Primase-Bindungsstellen ermöglicht die Erlangung von DNA-Bindungseigenschaften, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar unmöglich zu beobachten sind. Noch wichtiger ist, dass HTPP die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Insbesondere zeigt HTPP neben bekannten 5'-GTC-3'-Erkennungssequenzen verbindliche Spezifitäten auf, was zu Veränderungen der funktionellen Akt...

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Proteinbindende Mikroarray -Experimente (PBM) in Kombination mit biochemischen Assays verknüpfen die Bindungs- und katalytischen Eigenschaften von DNA-Primase, einem Enzym, das RNA-Primer auf Vorlagen-DNA synthetisiert. Diese Methode, die als High-Throughput Primase Profiling (HTPP) bezeichnet wird, kann verwendet werden, um DNA-bindende Muster einer Vielzahl von Enzymen zu offenbaren.

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Dieses Protokoll beschreibt die Sammlung massiver Daten aus protein-DNA-bindenden Mikroarrays für Primase, ein Enzym, das vorübergehend an bestimmte DNA-Sequenzen bindet und damit die Bildung von RNA-Primern katalysiert. In diesem Video wird beschrieben, wie die Mikroarray-Technologie dazu beitragen kann, Primase-Sequenzerkennungsstellen neu zu definieren und wie ein Ansatz mit hohem Durchsatz die klassische Biochemie ergänzen kann. Diese Technik kombiniert zwei Ansätze: Primase DNA-bindendes Mikroarray und Primase-Aktivitäts-Assay.Das Mikroarray liefert massive Daten über die Primasebindung an DNA-Sequenzen, wobei der biochemische Assay Informationen über die RNA-Primerbildung durch DNA-Primase liefert. Die getestete enzymatische Aktivität hängt von der Einsicht aus dem Mikroarray-Experiment und seinem geringeren Durchsatz in seiner Natur ab. Der Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit der Bindung, der DNA-Sequenzauswahl und der Aktivität des Enzyms wird untersucht.Die Identifizierung der Sequenzdeterminanz mit Mikroarray ermöglicht es uns, genaue Schlussfolgerungen auf der Grundlage massiver Daten des Mikroarrays zu ziehen. Dieser Ansatz wurde bisher verwendet, um DNA-Bindungssequenzen von Transkriptionsfaktoren zu beschreiben. Transkriptionsfaktoren sind statische Proteine, die eng an die DNA binden.Das Verfahren wird Stefan Ilic demonstrieren. Um dieses Verfahren zu beginnen, befeuchten Sie den Mikroarray-Dia, indem Sie ihn in ein Coplin-Glas mit 0,01%Triton-X 100 legen. Und drehen auf einem Laborrotator, fügen Sie 125 Rpm für fünf Minuten.Die Sperrlösung in eine Kunststoffbox zersiekern. Entfernen Sie dann das Mikroarray-Dia aus dem Coplin-Glas. Verwenden Sie ein feines Wischen, um die Nicht-DNA-Seite und die Ränder des Dias zu fahren.Legen Sie das Mikroarray langsam in die Kunststoffbox. Bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit langsamem Schütteln inkubieren. Danach die Rutsche einmal mit 0,01%Tween-20 in PBS waschen.Auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für fünf Minuten. Entfernen Sie den Tween-20 und spülen Sie das Dia einmal mit 0,01%Triton-X 100 in PBS auf einem Laborrotator bei 125 Rpm für zwei Minuten. Dann übertragen Sie die Folie schnell in ein Coplin-Glas, das PBS enthält.Montieren Sie zunächst die PMB-Kammer, wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie die Folie in den angegebenen Bereich. Verwenden Sie eine Pinzette, um sie nach unten und links zu drücken.Legen Sie die Silikondichtung auf und stellen Sie sicher, dass sie gut mit dem unteren Teil der PBM-Kammer ausgerichtet ist. Schließen Sie dann die Kammer und ziehen Sie die Schrauben diagonal fest. Die Proteinbindungsmischung in jeden Brunnen der Dichtung geben.Dann bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Zunächst pipette 0.05%Tween-20 in PBS in die PBM-Kammer, um die Rutsche kurz zu waschen. Entfernen Sie die Lösung mit einem Vakuumsauger aus den Brunnen der Kammer, da Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.Wiederholen Sie dies, waschen Sie die Folie kurz mit PBS. Und verwenden Sie das Vakuum, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, während Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren. Als nächstes fügen Sie Alexa 488 konjugierten Anti-His Antikörper zu jedem Brunnen der PBM-Kammer.Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Danach waschen Sie die Rutsche in der PBM-Kammer kurz, indem Sie ein paar Tropfen von 0,05%Tween-20 in PBS in jeden Brunnen hinzufügen. Und verwenden Sie den Vakuum-Aspirator, um die Lösung aus den Brunnen der Kammer zu entfernen, wobei Sie darauf achten, die DNA-Spots nicht zu berühren.Zerlegen Sie die PBM-Kammer und entfernen Sie die Folie. Spülen Sie die Dias zweimal in 0,05%Tween-20 in PBS, wobei jede Spülung drei Minuten dauert. Spülen Sie dann die Dias zweimal in PBS, wobei jede Spülzeit jeweils drei Minuten dauert.Und einmal in doppelt destilliertem Wasser für drei Minuten. Trocknen Sie die Dias mit Druckluft. Und lagern Sie sie in einer dunklen Diabox, bis sie zum Scannen bereit ist.Wenn Sie bereit sind, scannen Sie den Chip mit einem Mikroarray-Scanner mit einer Anregung von 495 Nanometern und einer Emission von 19 Nanometern. Und sammeln Sie die mittlere Fluoreszenzintensität. In dieser Studie wird pi durchsatz-Primase-Profiling verwendet, um die Primase-Bindungsstellen abzubilden, einschließlich derjenigen, die mit klassischen Werkzeugen schwer, wenn nicht gar nicht zu beobachten sind.Wichtig ist, dass pi-Durchsatz-Primase-Profiling die Überprüfung des traditionellen Verständnisses von Primase-Bindungsstellen ermöglicht. Besonders pi-Durchsatz-Primase-Profiling zeigt neben bekannten 5'GTC3'Erkennungssequenzen auch Bindungsspezifitäten auf, was zu Veränderungen in den funktionellen Aktivitäten der T7-DNA-Primase führt. Nämlich werden zwei Gruppen von Sequenzen identifiziert.Starke Bindungs-DNA-Sequenzen, die TG in den Flanken enthielten, und schwache Bindungs-DNA-Sequenzen, die AG in den Flanken enthielten. Es wurde keine Primasebindung an DNA-Vorlagen festgestellt, die 5'GTC3'in ihren Sequenzen fehlten. Die Primase-DNA-Erkennungsstellen, die spezifische Merkmale wie TG-reiche Flanken enthalten, erhöhen die Primase-DNA-Bindung bis zum 10-fachen.Überraschenderweise erhöhen sie auch die Länge der neu gebildeten RNA. Wichtig ist, dass das Primse-Profiling mit hohem Durchsatz es uns ermöglicht, die Variabilität in der Grundlänge in Bezug auf die Sequenz der DNA-Vorlage zu beobachten und zu quantifizieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten die Waschschritte subtil sein.Und Puffer sollten Komponenten enthalten, die den Primase auf der DNA protokolliert haben. Auch ein Schwellenwert für vergebliche Bindungsereignisse wird biochemisch bestimmt. Daher ist die Analyse des Mikroarrays unzureichend.Methoden wie eine Oberflächenplasmaresonanz und Gelverschiebungstests können die Bindungsaffinität von Primase bestimmen, um die DNA-Sequenzen auszuwählen. Mein Labor implementiert Vorhersagemodelle für maschinelles Lernen, um Primatese-Sequenzdeterminanten zu erkennen, die produktive Primer liefern, die durch DNA-Polymerase erweitert werden können. Im Ära der Big Data, einer Implementierung statistischer Methoden zur Analyse von Big Data, wird die Technik definitiv dazu beitragen, bestimmte DNA-Sequenzen besser zu charakterisieren und die Sequenzerkennung mit der Aktivität von Primase zu verknüpfen.Jeder, der mit Strahlung arbeitet, sollte ein gründliches Verständnis der Vorschriften und Gefahren im Zusammenhang mit der Verwendung ionisierender Strahlung haben. Sollte sich einer Schulung unterziehen und mit Sicherheitsausrüstung arbeiten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

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Forschung

Biochemie

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