Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הישראלית למדעים (גרנט no. 1023/18).

1. עיצוב מיקרוarray
הערה: בדיקות דנ א מייצגות מותאם אישית 36-נוקלאוטיד רצפים, המורכב של אתר הזיהוי עבור T7 DNA primase (GTC) ממוקם בין שני אזורים משתנה האגפים, ואחריו רצף של 24-נוקלאוטיד קבוע קשור לשקופית זכוכית3. השתמשנו בתבנית מיקרוarray של 4 x 180,000, אשר אפשרה איתור של כל רצף דנ א ב...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

שיטת PBM נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את מאפייני הכריכה של שעתוק גורמים והוא יכול גם להיות מוחל על אנזימים עיבוד DNA, כגון primase DNA, כי לאגד DNA עם זיקה נמוכה. עם זאת, יש צורך בשינויים מסוימים בהליכים ניסיוניים. הניסוי המיקרו-מערך כרוך במספר שלבים: עיצוב ספריית ה-DNA, הכנת השבב, איגוד מטרת החלבון, תיוג פל...

HTPP עושה שימוש בטכנולוגיה מיקרו מחייב DNA בשילוב עם ניתוח ביוכימיים (איור 1) כדי סטטיסטית לזהות תכונות ספציפיות של תבניות DNA המשפיעות על הפעילות האנזימטית של primase DNA. לכן, HTPP מספק פלטפורמה טכנולוגית המאפשרת קפיצת ידע בתחום. הכלים הקלאסיים המשמשים לקביעת אתרי זיהוי primase אין להם את היכולת להניב כמות מסיבית של נתונים, בעוד HTPP עושה.
Pbm היא טכניקה המשמשת באופן שגרתי כדי לקבוע את ההעדפות קשירה של גורמי תמלול ל-DNA1,2; עם זאת, הוא אינו מתאים לזיהוי של מחייב חלש/ארעי של חלבונים ל-DNA. בניגוד PBM אוניברסלי המספק מידע על ממוצע כריכת חלבון ספציפיות לכל הרצפים האפשריים המורכב של שמונה זוגות בסיס, HTPP מבוסס על הספריה של יחיד תקועים תבניות DNA הכוללת אלמנטים רצף ייחודי. אלה אלמנטים רצף DNA כרוך עשרות אלפים קצרים (עשרות מעטים של bp) רצפים גנומית, כמו גם רצפי DNA מעוצב מעוצבים מועשר ב-DNA מסוימים רצף החוזר רכיבים הנמצאים בגנום, אשר בעלי תוכן GC ממוצע שונים . גישה בעלת תפוקה גבוהה כזו מאפשרת נחישות, באופן שיטתי, כמותי ומונחה השערות, המאפיינים הקשורים ברצף החשובים לאיגוד הprimase ופעילותה האנזימטית3. בפרט, את הקשר החשוב בין primase-DNA העדפות איגוד, (מאופנן על ידי רצפי DNA האגפים מסוימים שלושה נוקלאוטיד אתרים מחייב) ו primase מעבד זוהה עבור מערכת זו אנזימטית4.
הטכנולוגיה החדשה הוחל לחזור על ההבנה שלנו של אתרי זיהוי primase אפילו עבור ה-DNA T7 primase כי כבר למד בהרחבה5. במיוחד, בחינת מחדש של מושגים קלאסיים, כגון אתרי זיהוי דנ א של T7 DNA primase (אשר נקבעו כמעט ארבעה עשורים לפני 6) באמצעות חלבון-dna המחייב מיקרוarray (pbm) הוביל תובנה חסרת תקדים לתוך תכונות הקשורות את הרצף האגף של אתרי ההוקרה האלה3. זה היה צפוי הרצפים החוצה אתר הכרה tri-נוקלאוטיד של T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') יהיה אקראי. במקום זאת, מצאנו כי רצפים של TG-עשיר האגפים להגדיל את הסיכויים של T7 DNA primase לסנתז עוד RNA התחל להצביע על עלייה בתהליך.
שיטות אחרות אשר ניתן להשתמש כדי ללמוד את המאפיינים של כריכת ה-DNA של חלבונים בתוך מבחנה כוללים את היכולת לנוע בתנועה אלקטרופלוטית (EMSA)7, dnase I footprinting דפסה8, משטח-פלמון תהודה (spr)9, ומדרום מערב בלוק 10. אלה הם, עם זאת, שיטות תפוקה נמוכה ישים רק כדי לחקור מספר קטן של רצפי DNA. בנוסף, הדיוק והרגישות של חלק מהשיטות האלה (למשל, EMSA) נמוך. מצד שני, בחירה מחוץ גופית11 היא טכניקה, בדומה pbm, ניתן להשתמש לזיהוי רצפים מחייב רבים. עם זאת, רצפי אהדה נמוכים בדרך כלל אינם נכללים ברוב היישומים של בחירת חוץ גופית; לפיכך, גישה זו אינה מתאימה לקבלת נתונים מחייבים השוואתיים עבור כל הרצפים הזמינים. ה-pbm האוניברסלי1,2 משמש בעיקר כדי לאפיין את הקשירה של גורמי שעתוק prokaryotes ו eukaryotes, כמו גם גורמים ספציפיים (למשל, נוכחות של ליגטים מסוימים, קופטים, וכו ') שעשויים ישפיע על האינטראקציה הזאת12.
HTPP מרחיב את היישום PBM לאנזימים עיבוד ה-DNA על ידי שילוב של עוצמה סטטיסטית בתפוקה גבוהה תקדים עם דיוק גבוהה כדי לספק מידע על ההקשר רצף כריכה. נתונים אלה עדיין לא הושגו עבור primases ואנזימים הקשורים (כי יש כריכה חלשה/ארעית ל-DNA) בשל מגבלות טכניות כאמור של טכניקות זמינות אחרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

דנ א primase מגדלים קצרים RNA התחל ליזום סינתזה של דנ א של קטעי וקאזאקי על סטרנד בפיגור על ידי DNA פולימראז במהלך שכפול DNA. הכריכה של הprimases של prokaryotic בדומה ל-DNA מתרחשת ברצף זיהוי טריאוקלאוטית מסוים. זהו צעד מרכזי ביצירת קטעים של וקאזאקי. כלים ביוכימיים קונבנציונליים המשמשים כדי לקבוע את רצף זיהוי ה-DNA של primase DNA לספק רק מידע מוגבל. באמצעות שיטת האיגוד המבוסס על מיקרוarray עם תפוקה גבוהה וניתוחים ביוכימיים עוקבים, הוכח כי 1) ההקשר המחייב הספציפי (רצפי מעבר של אתר הזיהוי) משפיע על חוזק הכריכה של ה-DNA הprimase לתבנית שלו DNA, ו 2) מחייב חזק יותר של primase לתשואות ה-DNA התחל עוד RNA, המציין מעבד גבוה יותר של האנזים. שיטה זו משלבת PBM ו primase הפעילות והוא מיועד כprimase התפוקה גבוהה (HTPP), והוא מאפשר אפיון של זיהוי רצף ספציפי על ידי primase DNA בזמן ומדרגיות חסר תקדים.

מקדמה טכנולוגית זו למיפוי אתרי הכריכה הprimase מאפשרת קבלת תכונות מחייבות של דנ א, הקשות, אם לא בלתי אפשריות, להתבונן בכלים הקלאסיים. חשוב יותר, HTPP מאפשר המחודשת של ההבנה המסורתית של אתרי איגוד primase. באופן ספציפי, HTPP חושף את מחייב specificities בנוסף ידוע 5 '-GTC-3 ' רצפי זיהוי, אשר מוביל ?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

מיקרו-מערך מחייב חלבון (pbm) ניסויים בשילוב עם בחני יוכימיים מקשר את תכונות הכריכה והקטליטי של ה-dna primase, אנזים שעושה שילוב של ה-RNA התחל ב-dna תבנית. שיטה זו, המיועדת כprimase ליצירת פרופיל בתפוקה גבוהה (HTPP), יכולה לשמש לחשיפת דפוסי איגוד DNA של מגוון אנזימים.

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

פרוטוקול זה מתאר איסוף של נתונים מסיביים ממיקרו-ריי מחייב חלבון-DNA עבור primase, אנזים שנקשר באופן חולף לרצפי DNA ספציפיים בתורו מקטלז היווצרות של פריימרים RNA. וידאו זה יכסה כיצד טכנולוגיית microarray יכול לעזור להגדיר מחדש אתרי זיהוי רצף primase וכיצד גישה תפוקה גבוהה יכולה להחמיא ביוכימיה קלאסית. טכניקה זו משלבת שתי גישות: פרימאז DNA מחייב microarray ובדיקות פעילות primase.Microarray מספק נתונים מסיביים של primase מחייב רצפי DNA, שם כמו בדיקה ביוכימית מספק מידע על היווצרות פריימר RNA על ידי פרימז DNA. הפעילות האנזימטית שנבדקה תלויה בתובנה מניסוי המיקרו-ריי ותפוקתו הנמוכה יותר באופיו. הקשר בין יעילות הכריכה, בחירת רצף הדנ"א לבין פעילות האנזים נבדק.זיהוי של קביעת רצף באמצעות microarray, מאפשר לנו להסיק מסקנות מדויקות המבוססות על נתונים מסיביים של microarray. גישה זו שימשה עד כה לתיאור רצפי קשירה DNA של גורמי שעתוק. גורמי שעתוק הם חלבונים סטטיים הנקשרים בחוזקה לדנ"א.הוכחת ההליך תהיה סטפן איליק. כדי להתחיל בהליך זה, הרטיב מראש את החלקת המיקרו-ריי על-ידי הנחתה בצנצנת קופלין המכילה 0.01%Triton-X 100. ומסתובב על מסובב מעבדה, להוסיף 125 סל"ד במשך חמש דקות.פיפטה פתרון החסימה לתוך קופסת פלסטיק. ואז להסיר את השקופית microarray מתוך צנצנת coplin. השתמש בניגוב עדין כדי להניע את הצד שאינו DNA ואת הקצוות של השקופית.מניחים באיטיות את המיקרו-ריי בקופסת הפלסטיק. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה עם רעידות איטיות. לאחר מכן, לשטוף את השקופית פעם אחת עם 0.01%Tween-20 ב- PBS.על מסובב מעבדה ב 125 סל"ד במשך חמש דקות. הסר את Tween-20 ולשטוף את השקופית פעם אחת עם 0.01% טריטון-X 100 ב- PBS על מסובב מעבדה ב 125 סל"ד במשך שתי דקות. לאחר מכן העבר במהירות את השקופית לצנצנת קופלין המכילה PBS.תחילה, הרכב את תא PMB כמפורט בפרוטוקול הטקסט. מקם את השקופית בשטח המיועד לכך. השתמש פינצטה לדחוף אותו למטה ושמאלה.מניחים את אטם הסיליקון על גבי, לוודא שהוא מיושר היטב עם החלק התחתון של תא PBM. ואז לסגור את התא ולהדק את הברגים באלכסון. פיפטה תערובת חלבון מחייב לתוך כל באר של אטם.לאחר מכן, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. כדי להתחיל, פיפטה 0.05%Tween-20 ב PBS לתוך תא PBM לשטוף בקצרה את השקופית. באמצעות שאופרטור ואקום, להסיר את הפתרון מן בארות התא נזהר לא לגעת כתמי DNA.חזור על זה, לשטוף בקצרה את השקופית עם PBS. ולהשתמש בוואקום כדי להסיר את הפתרון מ בארות התא תוך הקפדה לא לגעת כתמי DNA. לאחר מכן, להוסיף אלקסה 488 מצומד אנטי הנוגדן שלו לכל באר של תא PBM.דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף בקצרה את השקופית בתוך תא PBM על ידי הוספת כמה טיפות של 0.05%Tween-20 ב PBS לתוך כל באר. ולהשתמש בשואב הוואקום כדי להסיר את הפתרון מ בארות התא, נזהר לא לגעת כתמי DNA.לפרק את תא PBM ולהסיר את השקופית. שטפו את השקופיות פעמיים ב-0.05%Tween-20 ב-PBS, כאשר כל שטיפה נמשכה שלוש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות פעמיים ב-PBS, כאשר כל שטיפה נמשכה שלוש דקות כל אחת.ופעם אחת במים מזוקקים כפולים במשך שלוש דקות. יבש את השקופיות עם אוויר דחוס. ולאחסן אותם בתיבת שקופיות כהה עד מוכן לסריקה.כאשר מוכן, להשתמש בסורק microarray כדי לסרוק את השבב עם העירור של 495 ננומטר ו פליטה של 19 ננומטר. ולאסוף את עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית. במחקר זה פרופיל פרימז תפוקת פאי משמש למיפוי אתרי כריכת primase, כולל אלה שקשה אם לא בלתי אפשרי להתבונן באמצעות כלים קלאסיים.חשוב לציין, פרופיל פרימז תפוקת פאי מאפשר בחינה מחדש של ההבנה המסורתית של אתרי כריכת פרימז. במיוחד פרופיל פרימאז תפוקת פאי מגלה ספציפיות מחייבת בנוסף לרצפי זיהוי ידועים של 5'GTC3', מה שמוביל לשינויים בפעילויות הפונקציונליות של T7 DNA primase. כלומר, שתי קבוצות של רצפים מזוהות.רצפי דנ"א קשירה חזקים שהכילו TG באגפים ורצפי דנ"א מחייבים חלשים שהכילו AG באגפים. לא זוהה איגוד פרימאז לתבניות דנ"א שהיו חסרות 5'GTC3' בתוך הרצפים שלהן. אתרי זיהוי הדנ"א של primase המכילים תכונות ספציפיות כגון אגפים עשירים ב- TG, מגדילים את ה- DNA של primase עד פי 10.באופן מפתיע, הם גם להגדיל את אורך RNA שזה עתה נוצר. חשוב לציין, פרופיל פרימז תפוקה גבוהה מאפשר לנו להתבונן ולכומת את השונות באורך פריימר ביחס לרצף של תבנית ה- DNA. בעת ביצוע הליך זה שלבי הכביסה צריכים להיות עדינים.ומאגרים צריכים להכיל רכיבים שרשמתי את הפרימטאז בדנ"א. גם סף של אירועים מחייבים חסרי תועלת נקבע ביוכימית. לכן ניתוח של microarray אינו מספיק.שיטות כגון תהודה פלזמה פני השטח ובדיקות משמרת ג'ל יכול לקבוע את הזיקה מחייבת של primase כדי לבחור את רצפי ה-DNA. המעבדה שלי מיישמת מודלים לחיזוי למידת מכונה כדי לזהות גורמים לרצף פרימאז המניבים פריימרים פרודוקטיביים שניתן להאריך על ידי פולימראז DNA. בעידן של ביג דאטה, יישום של שיטות סטטיסטיות לניתוח ביג דאטה, הטכניקה בהחלט תעזור לאפיין טוב יותר רצפי דנ"א ספציפיים ולקשר את זיהוי הרצף לפעילות הפרימטיז.כל מי שעובד עם קרינה צריך הבנה מעמיקה של תקנות ומפגעים הקשורים לשימוש בקרינה מייננת. צריך לעבור הכשרה צריך לעבוד עם ציוד בטיחות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA פולימראז פעילות Assay באמצעות DNA שכותרתו פלורסנט-סגול, דמיינו ידי אקרילאמיד אלקטרופורזה בג'ל

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA מכתים שיטה המבוססת על משקעים Formazan הנגרם על ידי חשיפה אור כחול

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...