Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
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इस शोध को इसराल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 1023/

1. माइक्रोरेरे का डिजाइन
नोट: डीएनए जांच कस्टम 36-न्यूक्लिओटाइड दृश्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें दो चर flanking क्षेत्रों के बीच स्थित T7 डीएनए प्राइमेज़ (जीटीसी) के लिए मान्यता साइट से मिलकर, ?...

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	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

पीबीएम विधि व्यापक रूप से प्रतिलेखन कारकों के बाध्यकारी गुणों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और यह भी डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे डीएनए प्राइमेज़, कि कम आत्मीय?...

एचटीपीपी डीएनए बाइंडिंग माइक्रोरेरे प्रौद्योगिकी का उपयोग जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ संयुक्त करता है (चित्र 1) डीएनए टेम्पलेट्स की विशिष्ट विशेषताओं की सांख्यिकीय रूप से पहचान करने के लिए जो डीएनए प्राइमेज़ की एंजाइमी गतिविधि को प्रभावित करता है। इसलिए, HTPP एक तकनीकी मंच है कि क्षेत्र में एक ज्ञान छलांग की सुविधा प्रदान करता है. प्रथम मान्यता साइटों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले शास्त्रीय उपकरणों में भारी मात्रा में डेटा प्राप्त करने की क्षमता नहीं है, जबकि एचटीपीपी करता है।
पीबीएम एक ऐसी तकनीक है जिसका प्रयोग डीएनए 1,2के प्रतिलेखन कारकों की बाध्यकारी प्राथमिकताओं को निर्धारित करने के लिए नियमित रूप से किया जाता है ; तथापि, यह डीएनए के लिए प्रोटीन के कमजोर/परिवर्तनीय बंधन का पता लगाने के लिए उपयुक्त नहीं है। आठ आधार जोड़े से मिलकर सभी संभव दृश्यों के लिए औसत प्रोटीन बाध्यकारी विशिष्टता के बारे में जानकारी प्रदान करता है कि सार्वभौमिक पीबीएम के विपरीत, HTPP अद्वितीय अनुक्रम तत्वों को शामिल एकल फैला डीएनए टेम्पलेट्स के पुस्तकालय पर आधारित है। इस तरह के डीएनए अनुक्रम तत्वों जीनोम में मौजूद कुछ डीएनए दोहराव अनुक्रम तत्वों में समृद्ध कुछ डीएनए दोहराव अनुक्रम तत्वों में समृद्ध हजारों कम (बीपी के कुछ दसियों) जीनोम दृश्यों, साथ ही साथ computationally डिजाइन डीएनए दृश्यों के दसियों शामिल है, जो विभिन्न औसत जीसी सामग्री के अधिकारी . इस तरह के एक उच्च throughput दृष्टिकोण के निर्धारण की अनुमति देता है, एक व्यवस्थित, मात्रात्मक, और परिकल्पना संचालित तरीके से, अनुक्रम से संबंधित गुण है कि प्राइमे बंधन और इसकी एंजाइमी गतिविधि3के लिए महत्वपूर्ण हैं. विशेष रूप से, प्राइमेज़-डीएनए बाइंडिंग प्राथमिकताओं के बीच महत्वपूर्ण लिंक, (विशिष्ट त्रि-न्यूक्लिओटाइड बाइंडिंग साइटों के बगल में डीएनए दृश्यों द्वारा संशोधित) और इस एंजाइमी प्रणाली4के लिए प्राइमेज़ प्रोसेक्टिविटी की पहचान की गई है।
नई प्रौद्योगिकी टी7 डीएनए प्राइमासे के लिए भी प्राइमेसी मान्यता स्थलों के बारे में हमारी समझ पर फिर से विचार करने के लिए लागू की गई थी , जिसका व्यापक अध्ययन किया गया है5. विशेष रूप से, शास्त्रीय अवधारणाओं की फिर से जांच, जैसे T7 डीएनए प्राइमाज़ के डीएनए मान्यता साइटों (जो लगभग चार दशक पहले निर्धारित किया गया था 6) प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी microarray (PBM) का उपयोग कर से संबंधित सुविधाओं में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि के लिए नेतृत्व किया गया है इन मान्यता स्थलों के flanking अनुक्रम3. यह उम्मीद की गई थी कि टी 7 डीएनए प्राइमेज़ (5'-जीटीसी-3') की त्रि-न्यूक्लिओटाइड मान्यता साइट के बगल में अनुक्रम यादृच्छिक होंगे। इसके बजाय, हमने पाया कि टीजी समृद्ध flanking दृश्यों T7 डीएनए primese की संभावना को बढ़ाने के लिए अब आरएनए प्राइमर संश्लेषित processivity में वृद्धि का संकेत.
अन्य तरीकों कि इन विट्रो में प्रोटीन के डीएनए बाध्यकारी गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA)7, DNase मैं पदचिह्न8, सतह-प्लासम अनुनाद (एसपीआर)9, और दक्षिण पश्चिमी blotting शामिल 10.तथापि, ये कम-थ्रूपुट विधियां हैं जो केवल डीएनए अनुक्रमों की एक छोटी संख्या की जांच करने के लिए लागू होती हैं. इसके अलावा, इन तकनीकों में से कुछ की सटीक और संवेदनशीलता (उदा., EMSA) कम है. दूसरी ओर, इन विट्रो चयन11 एक तकनीक है कि, इसी तरह पीबीएम के लिए, कई बाध्यकारी दृश्यों की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, कम आत्मीयता दृश्यों आमतौर पर इन विट्रो चयन के अधिकांश अनुप्रयोगों में बाहर रखा गया है; इसलिए, यह उपागम सभी उपलब्ध अनुक्रमों के लिए तुलनात्मक बाइंडिंग डेटा प्राप्त करने के लिए उपयुक्त नहीं है। सार्वभौमिक पीबीएम1,2 का उपयोग मुख्य रूप से प्रोकैरियोट और यूकैरियोट से प्रतिलेखन कारकों की बाध्यकारी विशिष्टताओं के साथ-साथ विशिष्ट कारकों (जैसे, कुछ लिगन्ड्स की उपस्थिति, सहकारक, आदि) की विशेषता के लिए किया जाता है जो हो सकता है इस बातचीत को प्रभावित12|
HTPP बाध्यकारी अनुक्रम संदर्भ पर जानकारी प्रदान करने के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ अभूतपूर्व उच्च throughput सांख्यिकीय शक्ति के संयोजन के द्वारा डीएनए प्रसंस्करण एंजाइमों के लिए पीबीएम आवेदन का विस्तार। अन्य उपलब्ध तकनीकों की उपर्युक्त तकनीकी सीमाओं के कारण ऐसे आंकड़े अभी तक प्राइमेसिस और संबंधित एंजाइमों (जो डीएनए के लिए कमजोर/परिवर्तनीय बाध्यकारी हैं) के लिए प्राप्त नहीं किए गए हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

डीएनए प्राइमेज़ कम आरएनए प्राइमर को संश्लेषित करता है जो डीएनए प्रतिकृति के दौरान डीएनए पॉलिमरेज द्वारा पिछड़े किनारा पर ओकाज़ाकी टुकड़े के डीएनए संश्लेषण को आरंभ करता है। डीएनए के लिए प्रोकैरियोटिक डीएनएजी की तरह प्राइमेस की बाइंडिंग एक विशिष्ट trinucleotide मान्यता अनुक्रम में होती है। यह Okazaki टुकड़े के गठन में एक महत्वपूर्ण कदम है. पारंपरिक जैव रासायनिक उपकरण है कि डीएनए primase के डीएनए मान्यता अनुक्रम निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है केवल सीमित जानकारी प्रदान करते हैं. एक उच्च throughput microarray आधारित बाध्यकारी परख और लगातार जैव रासायनिक विश्लेषण का उपयोग करना, यह दिखाया गया है कि 1) विशिष्ट बाध्यकारी संदर्भ (मान्यता साइट के flanking दृश्यों) अपने टेम्पलेट के लिए डीएनए प्राइमाज़ की बाध्यकारी ताकत को प्रभावित करती है डीएनए, और 2) डीएनए के लिए प्राइमेज़ की मजबूत बाध्यकारी अब आरएनए प्राइमर पैदावार, एंजाइम के उच्च processivity का संकेत. इस विधि पीबीएम और प्राइमाज़ गतिविधि परख को जोड़ती है और उच्च के रूप में नामित किया गया है-थ्रूपुट प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (HTPP), और यह अभूतपूर्व समय और मापनीयता में डीएनए primese द्वारा विशिष्ट अनुक्रम मान्यता की विशेषता की अनुमति देता है.

प्राइमाज़ बाइंडिंग साइटों मानचित्रण के लिए इस तकनीकी अग्रिम डीएनए बाध्यकारी गुण है कि मुश्किल कर रहे हैं प्राप्त करने की अनुमति देता है, अगर असंभव नहीं, शास्त्रीय उपकरणों का उपयोग कर निरी...

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

प्रोटीन बाइंडिंग माइक्रोरेयर (पीबीएम) जैव रासायनिक परख के साथ संयुक्त प्रयोगों डीएनए प्राइमर के बाध्यकारी और उत्प्रेरक गुणों को जोड़ते हैं, एक एंजाइम जो टेम्पलेट डीएनए पर आरएनए प्राइमर को संश्लेषित करता है। इस विधि, उच्च throughput प्राइमाज़ प्रोफाइलिंग (HTPP) के रूप में नामित, एंजाइमों की एक किस्म के डीएनए बाध्यकारी पैटर्न प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

डीएनए द्वारा डीएनए अनुक्रम मान्यता उच्च-Throughput प्राइमाज़ प्रोफ़ेशनल का उपयोग कर

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

यह प्रोटोकॉल प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी माइक्रोएरे से बड़े पैमाने पर डेटा के संग्रह का वर्णन करता है, एक एंजाइम जो क्षणिक रूप से विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बांधता है और बदले में आरएनए प्राइमर के गठन को उत्प्रेरित करता है। यह वीडियो कवर करेगा कि कैसे माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी प्राइमाज़ अनुक्रम मान्यता साइटों को फिर से परिभाषित करने में मदद कर सकती है और कैसे एक उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण क्लासिक बायोकेमिस्ट्री को बधाई दे सकता है। यह तकनीक दो दृष्टिकोणों को जोड़ती है: डीएनए बाध्यकारी माइक्रोएरी और प्राइमा गतिविधि परख को प्राइमाज़ करें।माइक्रोएरे डीएनए दृश्यों के लिए प्राइमाज़ बाध्यकारी के बड़े पैमाने पर डेटा प्रदान करता है, जहां जैव रासायनिक परख डीएनए प्राइमास द्वारा आरएनए प्राइमर गठन के बारे में जानकारी प्रदान करता है । परीक्षण एंजाइमेटिक गतिविधि माइक्रोएरे प्रयोग और इसकी प्रकृति में कम थ्रूपुट से अंतर्दृष्टि पर निर्भर करती है। बाध्यकारी की दक्षता, डीएनए अनुक्रम चयन और एंजाइम की गतिविधि के बीच की कड़ी की जांच की जाती है।माइक्रोएरे का उपयोग करके अनुक्रम निर्धारक की पहचान, हमें माइक्रोएरे के बड़े पैमाने पर डेटा के आधार पर सटीक निष्कर्ष निकालने की अनुमति देती है। इस दृष्टिकोण का उपयोग अब तक प्रतिलेखन कारकों के डीएनए बाध्यकारी दृश्यों का वर्णन करने के लिए किया गया है । प्रतिलेखन कारक स्थिर प्रोटीन होते हैं जो डीएनए को कसकर बांधते हैं।प्रक्रिया का प्रदर्शन स्टीफन Ilic होगा । इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, 0.01% ट्राइटन-एक्स 100 वाले कॉपलिन जार में रखकर माइक्रोएरी स्लाइड को प्री गीला करें। और एक प्रयोगशाला रोटेटर पर घूर्णन, पांच मिनट के लिए १२५ आरपीएम जोड़ें ।एक प्लास्टिक बॉक्स में अवरुद्ध समाधान पिपेट करें। फिर कॉप्लिन जार से माइक्रोएरे स्लाइड निकालें। स्लाइड के गैर डीएनए पक्ष और किनारों ड्राइव करने के लिए एक ठीक पोंछ का प्रयोग करें।धीरे-धीरे माइक्रोएरे को प्लास्टिक बॉक्स में रखें। धीमी गति से मिलाते हुए एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। इसके बाद, पीबीएस में 0.01% ट्वीन-20 के साथ एक बार स्लाइड धोएं।पांच मिनट के लिए 125 आरपीएम पर एक लैब रोटेटर पर। ट्वीन-20 निकालें और दो मिनट के लिए 125 आरपीएम पर एक लैब रोटेटर पर पीबीएस में 0.01% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ एक बार स्लाइड कुल्ला। फिर जल्दी से पीबीएस युक्त एक कॉप्लिन जार में स्लाइड स्थानांतरित करें।सबसे पहले, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित पीएमबी चैंबर को इकट्ठा करें। निर्धारित स्थान में स्लाइड रखें। चिमटी का प्रयोग करें इसे नीचे धक्का और छोड़ दिया है ।सिलिकॉन गैसकेट को शीर्ष पर रखें, यह सुनिश्चित करें कि यह पीबीएम चैंबर के निचले हिस्से के साथ अच्छी तरह से गठबंधन है। इसके बाद चैंबर बंद कर तिरछे शिकंजा कस लें। गैसकेट के प्रत्येक कुएं में प्रोटीन बाइंडिंग मिश्रण को पिपेट करें।फिर, 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। शुरू करने के लिए, पीबीएस में पीबीएस में 0.05% ट्वीन-20 को संक्षेप में स्लाइड धोने के लिए। एक वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग करके, डीएनए धब्बे को छूने के लिए सावधान रहने वाले कक्ष के कुओं से समाधान निकालें।इसे दोहराएं, पीबीएस के साथ स्लाइड को संक्षेप में धोएं। और डीएनए धब्बे को छूने के लिए सावधान रहने के दौरान कक्ष के कुओं से समाधान को हटाने के लिए वैक्यूम का उपयोग करें। इसके बाद, एलेक्सा 488 संयुग्मित एंटी-उसकी एंटीबॉडी को पीबीएम चैंबर के प्रत्येक कुएं में जोड़ें।30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट। इसके बाद, प्रत्येक कुएं में पीबीएस में 0.05% ट्वीन-20 की कुछ बूंदें जोड़कर पीबीएम कक्ष के अंदर स्लाइड को संक्षेप में धोएं। और वैक्यूम एस्पिरेटर का उपयोग कक्ष के कुओं से समाधान को हटाने के लिए करें, डीएनए धब्बे को छूने के लिए सावधान रहें।पीबीएम चैंबर को अलग करें और स्लाइड को हटा दें। पीबीएस में 0.05% ट्वीन-20 में दो बार स्लाइड कुल्ला, प्रत्येक कुल्ला तीन मिनट तक चलने के साथ। फिर, पीबीएस में दो बार स्लाइड खंगाल, प्रत्येक कुल्ला तीन मिनट तक चलने के साथ ।और तीन मिनट के लिए डबल आसुत पानी में एक बार । संकुचित हवा के साथ स्लाइड सूखी। और स्कैन करने के लिए तैयार होने तक उन्हें एक अंधेरे स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें।तैयार होने पर 495 नैनोमीटर के एक्सटिटेशन और 19 नैनोमीटर के उत्सर्जन के साथ चिप को स्कैन करने के लिए माइक्रोएरे स्कैनर का इस्तेमाल करें। और औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता एकत्र करें। इस अध्ययन में pi थ्रूपुट प्राइमास प्रोफाइलिंग का उपयोग प्राइमाज़ बाध्यकारी साइटों को मैप करने के लिए किया जाता है, जिनमें वे शामिल हैं जो शास्त्रीय उपकरणों का उपयोग करके निरीक्षण करना असंभव नहीं है।महत्वपूर्ण बात, pi थ्रूपुट प्राइमास प्रोफाइलिंग प्राइमाज़ बाइंडिंग साइटों की पारंपरिक समझ की समीक्षा करने में सक्षम बनाता है। विशेष रूप से pi थ्रूपुट प्राइमास प्रोफाइलिंग ज्ञात 5'GTC3'मान्यता दृश्यों के अलावा बाध्यकारी विशिष्टताओं का पता चलता है, जो T7 डीएनए प्राइमास की कार्यात्मक गतिविधियों में परिवर्तन की ओर जाता है। अर्थात्, दृश्यों के दो समूहों की पहचान की जाती है।मजबूत बाध्यकारी डीएनए दृश्यों कि flanks और कमजोर बाध्यकारी डीएनए दृश्यों कि flanks में एजी निहित में टीजी निहित । डीएनए टेम्पलेट्स के लिए कोई प्राइमाज़ बाध्यकारी नहीं है जो उनके दृश्यों के भीतर 5'GTC3'' याद कर रहे थे। प्राइमास डीएनए मान्यता साइटों जिसमें टीजी रिच फ्लैंक जैसी विशिष्ट विशेषताएं हैं, 10 गुना तक प्राइमा डीएनए बाइंडिंग को बढ़ाती हैं।हैरानी की बात यह है कि वे नवगठित आरएनए की लंबाई भी बढ़ाते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि उच्च थ्रूपुट प्राइमास प्रोफाइलिंग हमें डीएनए टेम्पलेट के अनुक्रम के संबंध में प्राइमर लंबाई में परिवर्तनशीलता का निरीक्षण करने और निर्धारित करने की अनुमति देता है। इस प्रक्रिया को करते समय धोने के कदम सूक्ष्म होने चाहिए।और बफ़र्स घटक है कि डीएनए पर प्राइमास लॉग इन किया जाना चाहिए । इसके अलावा व्यर्थ बाध्यकारी घटनाओं की एक सीमा जैव रासायनिक निर्धारित किया जाता है । इसलिए माइक्रोएरे का विश्लेषण अपर्याप्त है।सतह प्लाज्मा प्रतिध्वनि और जेल शिफ्ट परख जैसे तरीके डीएनए दृश्यों का चयन करने के लिए प्राइमाज़ की बाध्यकारी आत्मीयता निर्धारित कर सकते हैं। मेरी प्रयोगशाला मशीन लर्निंग भविष्यवाणी मॉडल को मौलिक अनुक्रम निर्धारकों का पता लगाने के लिए लागू करती है जो उत्पादक प्राइमर उत्पीड करते हैं जिन्हें डीएनए पॉलीमरेज द्वारा बढ़ाया जा सकता है। बड़े डेटा के युग में, बड़े डेटा का विश्लेषण करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों का कार्यान्वयन, तकनीक निश्चित रूप से विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बेहतर ढंग से चित्रित करने और अनुक्रम मान्यता को प्राइमा की गतिविधि से जोड़ने में मदद करेगी।विकिरण के साथ काम करने वाले किसी भी व्यक्ति को आयनीकरण विकिरण के उपयोग से जुड़े नियमों और खतरों की पूरी तरह से समझ होनी चाहिए। प्रशिक्षण से गुजरना चाहिए और सुरक्षा उपकरणों के साथ काम करना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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एक सरल, मजबूत, और उच्च प्रवाह एकल अणु डीएनए के साथ अणुओं के परिवहन के अध्ययन के लिए परख कार्यांवयन खींच प्रवाह

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Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि परख का उपयोग कर के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए visualized द्वारा Acrylamide जेल ट्रो

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

डीएनए धुंधला Formazan नीले प्रकाश जोखिम से प्रेरित वर्षण पर आधारित विधि

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

प्रतिलेखन फैक्टर के उच्च संवेदनशीलता माप-प्रतिस्पर्धी अनुमापन द्वारा डीएनए बाध्यकारी समानताएं प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया की वास्तविक समय अवलोकन Rad51 द्वारा मध्यस्थता

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

डीएनए वैद्युतिडियम या वैकल्पिक रंजक के बजाय Thiazole ऑरेंज का उपयोग कर Electrophoresis

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

डीएनए मेथिलट्रांसफेरेज़ इनहिबिटर के लिए स्क्रीन करने के लिए निरंतर फ्लोरेसेंस-आधारित एंडोन्यूक्लिज़-युग्मित डीएनए मिथाइलेशन परख

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...