Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

이 연구는 이스라엘 과학 재단에 의해 지원되었다 (부여 번호 1023/18).

1. 마이크로어레이 의 설계
참고: DNA 프로브는 2개의 가변 측면 영역 사이에 위치한 T7 DNA 프리마제(GTC)에 대한 인식 부위로 구성된 맞춤형 36-뉴클레오티드 서열을 나타내고, 이어서 유리 슬라이드3에연속된 일정한 24-뉴클레오티드 서열이 뒤따른다. 우리는 4 x 180,000 마이크로어레이 형식을 사용하여 슬라이드에 무작위로 분포된 6개의 복제본에서 각 DNA 서열을 ?...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

PBM 방법은 전사 인자의 결합 특성을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔으며 DNA 프리마제와 같은 DNA 처리 효소에 적용되어 친화성이 낮은 DNA에 결합할 수도 있습니다. 그러나 실험 절차의 특정 수정이 필요합니다. 마이크로어레이 실험은 DNA 라이브러리의 설계, 칩의 준비, 단백질 표적의 결합, 형광 표지 및 스캐닝과 같은 여러 단계를 수반합니다. 세제를 함유한 용액을 가진 긴 세척은 결합의 약한/?...

HTPP는 생화학 적 분석과 결합 된 DNA 결합 마이크로 어레이 기술을 사용하여DNA프리마제의 효소 활성에 영향을 미치는 DNA 템플릿의 특정 특징을 통계적으로 식별합니다. 따라서 HTPP는 현장에서 지식의 도약을 촉진하는 기술 플랫폼을 제공합니다. 원시 인식 사이트를 결정하는 데 사용되는 고전적인 도구는 HTPP가 수행하는 반면, 엄청난 양의 데이터를 얻을 수있는 능력이 없습니다.
PBM은 DNA1,2에대한 전사 인자의 결합 선호도를 결정하기 위해 일상적으로 사용되는 기술이다. 그러나, DNA에 단백질의 약 /과도 결합의 검출에 적합하지 않습니다. 8개의 염기 쌍으로 구성된 모든 가능한 서열에 평균 단백질 결합 특이성에 대한 정보를 제공하는 보편적인 PBM과는 달리, HTPP는 독특한 서열 요소를 포함하는 단일 가닥 DNA 템플릿의 라이브러리를 기반으로 한다. 이러한 DNA 서열 요소는 수만 짧은 (bp의 몇 수) 게놈 서열뿐만 아니라 다른 평균 GC 함량을 가지고 게놈에 존재하는 특정 DNA 반복적 인 서열 요소에 풍부 하게 계산 설계 DNA 서열을 포함 . 이러한 높은 처리량 접근법은 체계적이고 정량적이며 가설 구동적인 방식으로, 프리마제 결합 및 그 효소 활성에 중요한 서열 관련 특성을 결정할 수 있게한다 3. 특히, 프리마제-DNA 결합 선호도(특정 삼중 뉴클레오티드 결합 부위를 측면으로 하는 DNA 서열에 의해 변조)와 프리마제 처리율 사이의 중요한 링크가 이러한 효소 시스템4에대해 확인되었다.
이 새로운 기술은 광범위하게 연구된 T7 DNA 프리마제에 대해서도 프리마제 인식 부위에 대한 우리의 이해를 재검토하기 위해 적용되었다5. 구체적으로, 단백질 DNA 결합 마이크로어레이(PBM)를 사용하여 T7 DNA 프리마제(거의 4년 전 6년전에 결정된)의 DNA 인식 부위와 같은 고전적인 개념의 재검사는 이러한 인식 사이트의 측면 시퀀스3. T7 DNA 프리마제(5'-GTC-3')의 삼중뉴클레오티드 인식 부위를 측면으로 하는 서열이 무작위일 것으로 예상되었다. 대신, 우리는 TG가 풍부한 측면 서열이 처리율의 증가를 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 합성하는 T7 DNA 프리마제의 기회를 증가한다는 것을 것을을 발견했습니다.
시험관 내 단백질의 DNA 결합 특성을 연구하는 데 사용할 수 있는 다른 방법은 전기 영동 이동성 시프트 분석법(EMSA)7,DNase I 풋프린트8,표면 플라스몬 공명(SPR)9,및 남서부 블로팅을 포함합니다. 10. 그러나, 이들은 적은 수의 DNA 서열을 조사하는 데에만 적용 가능한 저처리법입니다. 또한, 이러한 기술 들(예를 들어, EMSA)의 정밀도 및 감도는 낮다. 한편, 시험관내선택(11)은 PBM과 유사하게, 수많은 결합 서열의 식별을 위해 사용될 수 있는 기술이다. 그러나, 낮은 친화도 서열은 일반적으로 시험관 내 선택의 대부분의 응용 프로그램에서 제외; 따라서 이 방법은 사용 가능한 모든 시퀀스에 대한 비교 바인딩 데이터를 가져오는 데 적합하지 않습니다. 범용 PBM1,2는 주로 원핵생물 및 진핵생물로부터의 전사 인자의 결합 특이성뿐만 아니라 특정 인자(예를 들어, 특정 리간드, 보조 인자 등)의 결합 특이성을 특성화하는 데 사용됩니다. 이 상호 작용에 영향을미치는 12.
HTPP는 전례없는 높은 처리량의 통계적 파워와 높은 정밀도를 결합하여 결합 서열 컨텍스트에 대한 정보를 제공함으로써 PBM 응용 프로그램을 DNA 처리 효소로 확장합니다. 이러한 데이터는 다른 사용 가능한 기술의 전술한 기술적 한계로 인해 프리마제 및 관련 효소(DNA에 약/과도 결합)에 대해 아직 획득되지 않았습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA 프리마제는 DNA 복제 중에 DNA 폴리머라제에 의해 지연 가닥에 오카자키 단편의 DNA 합성을 시작하는 짧은 RNA 프라이머를 합성합니다. DNA에 원핵 DNAG 같이 프리마제의 결합은 특정 삼중뉴클레오티드 인식 순서에서 생깁니다. 그것은 오카자키 조각의 형성에 중요한 단계입니다. DNA 프리마제의 DNA 인식 서열을 결정하는 데 사용되는 기존의 생화학 적 도구는 제한된 정보만을 제공한다. 고처리량 마이크로어레이 기반 결합 분석 및 연속적인 생화학 적 분석을 사용하여 1) 특정 결합 컨텍스트 (인식 부위의 측면 서열)가 DNA 프리마제의 결합 강도에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. DNA, 및 2) DNA에 프리마제의 강한 결합은 효소의 더 높은 처리율을 나타내는 더 긴 RNA 프라이머를 산출한다. 이 방법은 PBM 및 프리마제 활성 분석법을 결합하고 고처리량 프리마제 프로파일링 (HTPP)으로 지정되며 전례없는 시간과 확장성에서 DNA 프리마제에 의한 특정 서열 인식의 특성화를 허용합니다.

프리마제 결합 부위를 매핑하기 위한 이러한 기술적 진보는 고전적 도구를 사용하여 관찰하기 어려운 DNA 결합 특성을 얻을 수 있게 한다. 더 중요한 것은, HTPP는 프리마제 바인딩 사이트의 전통적인 이해를 다시 방문 할 수 있습니다. 구체적으로, HTPP는 알려진 5'-GTC-3' 인식 서열 이외에 결합 특이성을 밝혀, 이는 T7 DNA 프리마제의 기능적 활동의 변화로 이어진다. 즉, 서열의...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

생화학 분석과 결합된 단백질 결합 마이크로어레이(PBM) 실험은 DNA 프리마제의 결합 및 촉매 특성을 연결하며, 이는 템플릿 DNA에 RNA 프라이머를 합성하는 효소입니다. 고처리량 프리마제 프로파일링(HTPP)으로 지정된 이 방법은 다양한 효소의 DNA 결합 패턴을 밝히는 데 사용될 수 있다.

고처리량 프리마제 프로파일링을 사용하여 DNA 프리마제에 의한 DNA 서열 인식

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

이 프로토콜은 primase를 위한 단백질 DNA 결합 마이크로어레이에서 대규모 데이터의 집합을 기술합니다, 특정 DNA 서열에 일시적으로 결합하고 차례차례로 RNA 프라이머의 형성을 촉매하는 효소. 이 비디오는 마이크로어레이 기술이 원시 서열 인식 사이트를 재정의하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지, 높은 처리량 접근 방식이 고전적인 생화학을 칭찬할 수 있는 방법을 다룹니다. 이 기술은 두 가지 접근법을 결합합니다: primase DNA 결합 마이크로어레이 및 primase 활동 분석.마이크로어레이는 생화학적 분석이 DNA 프리마아제에 의한 RNA 프라이머 형성에 대한 정보를 제공하는 DNA 서열에 결합하는 원시적 물질의 방대한 데이터를 제공한다. 테스트된 효소 활동은 마이크로어레이 실험의 통찰력과 그 특성의 낮은 처리량에 따라 달라집니다. 결합의 효율, DNA 서열 선택 및 효소의 활성 사이의 링크가 조사됩니다.마이크로어레이를 사용하여 서열 결정의 식별을 통해 마이크로어레이의 방대한 데이터를 기반으로 정확한 결론을 도출할 수 있습니다. 이 접근법은 전사 요인의 DNA 결합 서열을 설명하기 위하여 지금까지 이용되었습니다. 전사 요인은 DNA에 단단히 묶는 정적 단백질입니다.절차를 시연하는 것은 스테판 일릭이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 0.01%트리톤-X 100이 포함된 코플린 항아리에 배치하여 마이크로어레이 슬라이드를 미리 적시십시오. 그리고 실험실 회전기에서 회전하면 5 분 동안 125 rpm을 추가하십시오.블로킹 용액을 플라스틱 상자에 파이펫합니다. 그런 다음 코플린 항아리에서 마이크로 어레이 슬라이드를 제거합니다. 미세한 닦기를 사용하여 슬라이드의 비 DNA 측면과 가장자리를 구동합니다.마이크로어레이를 플라스틱 상자에 천천히 넣습니다. 실온에서 1시간 동안 느리게 흔들리며 배양합니다. 그 후 PBS에서 0.01%Tween-20으로 슬라이드를 한 번 씻으십시오.125 rpm의 실험실 회전기에서 5 분 동안. Tween-20을 제거하고 125 rpm의 실험실 회전기에서 PBS에서 0.01%트리톤-X 100으로 슬라이드를 한 번 헹구십시오. 그런 다음 슬라이드를 PBS가 들어있는 코플린 항아리로 신속하게 전송합니다.먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PMB 챔버를 조립합니다. 슬라이드를 지정된 공간에 배치합니다. 핀셋을 사용하여 아래로 밀어 내고 왼쪽으로 이동합니다.실리콘 개스킷을 위에 놓고 PBM 챔버의 하부와 잘 정렬되었는지 확인합니다. 그런 다음 챔버를 닫고 나사를 대각선으로 조입니다. 개스킷의 각 우물에 단백질 결합 혼합물을 피펫.그런 다음 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 시작하려면 PBS에서 파이펫 0.05%Tween-20을 PBM 챔버로 들어가 슬라이드를 잠깐 세척합니다. 진공 흡인기를 사용하여, DNA 반점을 만지지 않도록 주의되는 챔버의 우물에서 용액을 제거합니다.이 것을 반복하고 PBS로 슬라이드를 잠깐 씻으십시오. 그리고 진공을 사용하여 DNA 반점을 만지지 않도록 주의하면서 챔버의 우물에서 용액을 제거하십시오. 다음으로, PBM 챔버의 각 우물에 알렉사 488 공액 된 항 -그의 항체를 추가합니다.실온에서 30분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그 후 PBS에서 0.05%Tween-20의 몇 방울을 각 우물에 추가하여 PBM 챔버 내부의 슬라이드를 짧게 세척합니다. 그리고 진공 흡구기를 사용하여 챔버의 우물에서 용액을 제거하고 DNA 반점을 만지지 않도록주의하십시오.PBM 챔버를 분해하고 슬라이드를 제거합니다. PBS에서 0.05%Tween-20으로 슬라이드를 두 번 헹구고 각 헹구는 것은 3분 동안 지속됩니다. 그런 다음 PBS에서 슬라이드를 두 번 헹구고 각 헹구는 것이 각각 3 분 동안 지속됩니다.그리고 3 분 동안 이중 증류수에서 한 번. 압축 공기로 슬라이드를 건조시다. 그리고 스캔 할 준비가 될 때까지 어두운 슬라이드 상자에 저장합니다.준비되면 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 495 나노미터의 발산과 19 나노미터의 방출로 칩을 스캔합니다. 및 중간 형광 강도를 수집합니다. 이 연구에서 pi 처리량 프리마제 프로파일링은 고전적인 도구를 사용하여 관찰하는 것이 불가능하지 않을 경우 어려운 사이트를 포함하여 프리마제 바인딩 사이트를 매핑하는 데 사용됩니다.중요한 것은 파이 처리량 프리마제 프로파일링을 통해 프리마제 바인딩 사이트에 대한 전통적인 이해를 다시 볼 수 있습니다. 특히 pi 처리량 프리마제 프로파일링은 알려진 5'GTC3'인식 서열 외에도 결합 특이성을 드러내며, 이는 T7 DNA primase의 기능 적 활동의 변화로 이어진다. 즉, 시퀀스의 두 그룹이 식별됩니다.측면에 TG를 포함 하는 강한 바인딩 DNA 서열 및 측면에 AG를 포함 하는 약한 바인딩 DNA 서열. 그들의 순서 내에서 5'GTC3'가 누락된 DNA 템플릿에 대한 프리마아제 결합이 발견되지 않았습니다. TG 풍부한 측면과 같은 특정 특징을 포함하는 프리마제 DNA 인식 사이트는 최대 10배까지 스니마제 DNA결합을 증가시다.놀랍게도, 그들은 또한 새로 형성 된 RNA의 길이를 증가시다. 중요한 것은, 높은 처리량 프리마제 프로파일링을 통해 DNA 템플릿의 서열과 관련하여 프라이머 길이의 가변성을 관찰하고 정량화할 수 있습니다. 이 절차를 수행 할 때 세척 단계는 미묘해야합니다.그리고 버퍼에는 DNA에 프리마아를 기록한 구성 요소가 포함되어야 합니다. 또한 쓸데없는 결합 이벤트의 임계 값은 생화학적으로 결정된다. 따라서 마이크로어레이의 분석이 충분하지 않습니다.표면 플라즈마 공명 및 겔 시프트 와 같은 방법은 DNA 서열을 선택하는 프리마제의 결합 친화성을 결정할 수 있다. 내 실험실은 DNA 폴리머라아제에 의해 확장 될 수있는 생산프라이머를 산출 primase 시퀀스 결정요인을 감지하기 위해 기계 학습 예측 모델을 구현합니다. 빅 데이터의 시대에 빅 데이터를 분석하는 통계 적 방법의 구현은 특정 DNA 서열을 더 잘 특성화하고 서열 인식을 primase의 활성에 연결하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.방사선으로 일하는 사람은 이온화 방사선의 사용과 관련된 규정과 위험에 대한 철저한 이해를 가져야합니다. 교육을 받아야 하며 안전 장비와 함께 작동해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

간단 하 고 강력한, 높은 처리량 단일 분자 DNA에 따라 분자의 수송을 공부에 대 한 스트레칭 분석 결과 구현 흐름

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

연구

생화학

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Smartphone을 이용한 DNA 단편 분리 실시간 추적

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA 방법 Formazan 강 수 푸른 빛의 노출에 의해 유도에 따라 얼룩

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

중재 Rad51 DNA 물가 교환 반응의 실시간 관찰

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

안지오텐신 II에 의해 설명 니트로 펩티드 프로파일링 및 식별

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...