Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av ISRAELS VITENSKAPS STIFTELSE (Grant no. 1023/18).

1. design av Microarray
Merk: DNA-sonder representerer tilpassede 36-nukleotid sekvenser, bestående av anerkjennelses stedet for T7 DNA-primase (GTC) mellom to variable flankerer regioner, etterfulgt av en konstant 24-nukleotid sekvens bundet til et glass Slide3. Vi brukte en 4 x 180 000 Microarray format, som aktiverte spotting av hver DNA-sekvens i seks replikerer, tilfeldig fordelt på lysbildet.
<ol><li>
Design av DNA-bibliotek for primases med kjente gje...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

Den PBM metoden har vært mye brukt til å undersøke bindende egenskaper transkripsjon faktorer og kan også brukes til DNA prosessering enzymer, slik som DNA primase, som binder til DNA med lav affinitet. Imidlertid er visse modifikasjoner av eksperimentelle prosedyrer nødvendig. Den Microarray eksperimentet omfatter flere trinn: design av DNA-biblioteket, utarbeidelse av chip, binding av proteinet målet, fluorescerende merking, og skanning. Milde vasketrinn er avgjørende, siden den lange vasker med løsninger som i...

HTPP gjør bruk av DNA bindende Microarray teknologi kombinert med biokjemiske analyse (figur 1) for å statistisk identifisere bestemte funksjoner i DNA-maler som påvirker enzymatisk aktivitet av DNA-primase. Derfor gir HTPP en teknologisk plattform som forenkler et kunnskaps sprang i felten. Den klassiske verktøy som brukes til å bestemme primase anerkjennelse nettsteder ikke har muligheten til å gi enorme mengder data, mens HTPP gjør.
PBM er en teknikk som rutinemessig brukes til å bestemme bindende preferanser av transkripsjon faktorer til DNA1,2; Det er imidlertid ikke egnet for påvisning av svake/forbigående binding av proteiner til DNA. I motsetning til den universelle PBM som gir informasjon om gjennomsnittlig protein bindende spesifisitet til alle mulige sekvenser bestående av åtte base parene, HTPP er basert på biblioteket av single-strandet DNA maler bestående av unike sekvens elementer. Slike DNA sekvens elementer innebære titusenvis kort (noen titalls BP) genomisk sekvenser, samt beregningsmessig utformet DNA-sekvenser beriket i visse DNA repeterende sekvens elementer til stede i Genova, som besitter ulike gjennomsnittlige GC innhold . En slik høy gjennomstrømmings tilnærming gjør det mulig å bestemme, på en systematisk, kvantitativ og hypotese-drevet måte, de sekvens relaterte egenskapene som er viktige for primase binding og dets enzymatisk aktivitet3. Spesielt den viktige koblingen mellom primase-DNA bindende preferanser, (modulert av DNA-sekvenser flankerer spesifikke Tri-nukleotid bindende områder) og primase processivity har blitt identifisert for dette enzymatisk system4.
Den nye teknologien ble brukt for å revidere vår forståelse av primase anerkjennelse nettsteder selv for T7 DNA primase som har blitt grundig studert5. Nærmere bestemt, re-undersøkelse av klassiske konsepter, slik som DNA-anerkjennelse nettsteder av T7 DNA primase (som ble bestemt nesten fire ti år siden 6) ved hjelp av PROTEIN-DNA bindende MICROARRAY (PBM) har ført til enestående innsikt i funksjoner knyttet til flankerer sekvensen av disse anerkjennelse nettsteder3. Det var forventet at sekvensene flankerer Tri-nukleotid anerkjennelse stedet av T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') vil være tilfeldig. I stedet fant vi at TG-rike flankerer sekvenser øker sjansene for T7 DNA-primase til å syntetisere lengre RNA-primere som indikerer en økning i processivity.
Andre metoder som kan brukes til å studere DNA-bindende egenskaper av proteiner in vitro inkluderer Elektroforetiske mobilitet Shift-analysen (EMSA)7, DNase jeg Footprinting8, overflate-Plasmon resonans (spr)9, og Southwestern blotting 10. disse er imidlertid lav gjennomstrømming metoder bare gjelder for å undersøke et lite antall DNA-sekvenser. I tillegg er presisjonen og følsomheten til noen av disse teknikkene (f. eks EMSA) lav. På den annen side, in vitro utvalg11 er en teknikk som, på samme måte som PBM, kan brukes til identifisering av mange bindende sekvenser. Imidlertid, lav affinitet sekvenser er vanligvis utelukket i de fleste anvendelser av in vitro valg; Denne tilnærmingen er derfor ikke egnet for innhenting av komparative bindings data for alle tilgjengelige sekvenser. Den universelle PBM1,2 er i hovedsak brukt til å karakterisere bindingen særegenheter av transkripsjon faktorer fra prokaryoter og Landplantenes samt spesifikke faktorer (for eksempel tilstedeværelsen av visse ligander, kofaktorer, etc.) som kan påvirke denne samhandlingen12.
HTPP utvider PBM programmet til DNA prosessering enzymer ved å kombinere enestående høy gjennomstrømming statistisk effekt med høy presisjon for å gi informasjon om bindende sekvens sammenheng. Slike data er ennå ikke innhentet for primases og beslektede enzymer (som har svake/forbigående binding til DNA) på grunn av nevnte tekniske begrensninger for andre tilgjengelige teknikker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA primase syntetiserer kort RNA primere som starter DNA-syntese av Okazaki fragmenter på henger strand av DNA polymerase under DNA-replikering. Bindingen av prokaryote DnaG-lignende primases til DNA oppstår ved en bestemt trinucleotide anerkjennelse sekvens. Det er et vesentlig skritt i dannelsen av Okazaki fragmenter. Konvensjonelle biokjemiske verktøy som brukes til å bestemme DNA-anerkjennelse sekvensen av DNA-primase gir bare begrenset informasjon. Ved hjelp av en Microarray bindings analyse med høy gjennomstrømming og påfølgende biokjemiske analyser, har det vist seg at 1) den spesifikke bindings konteksten (flankerer sekvenser av anerkjennelses stedet) påvirker bindings styrken til DNA-primase til dens mal DNA, og 2) sterkere binding av primase til DNA gir lengre RNA-primere, noe som indikerer høyere processivity av enzymet. Denne metoden kombinerer PBM og primase aktivitet analysen og er utpekt som høy gjennomstrømming primase profilering (HTPP), og det tillater karakterisering av spesifikke sekvens anerkjennelse av DNA primase i enestående tid og skalerbarhet.

Denne teknologiske fremskritt for kartlegging av primase bindende områder tillater innhenting av DNA bindende egenskaper som er vanskelig, om ikke umulig, å observere ved hjelp av klassiske verktøy. Enda viktigere, HTPP muliggjør besøke den tradisjonelle forståelsen av primase bindende nettsteder. Spesielt avslører HTPP bindende særegenheter i tillegg til kjente 5 '-GTC-3 ' anerkjennelse sekvenser, noe som fører til endringer i funksjonelle aktiviteter av T7 DNA primase. Nemlig, ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Microarray (PBM) eksperimenter kombinert med biokjemiske analyser knytter de bindende og katalysatorer til DNA-primase, et enzym som syntetiserer RNA-primere på mal-DNA. Denne metoden, utpekt som høy gjennomstrømming primase profilering (HTPP), kan brukes til å avdekke DNA-bindende mønstre av en rekke enzymer.

DNA Sequence anerkjennelse av DNA Primase ved hjelp av høy gjennomstrømming Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Denne protokollen beskriver innsamling av massive data fra protein-DNA bindende mikroarray for primase, et enzym som midlertidig binder seg til spesifikke DNA-sekvenser og i sin tur katalyserer dannelsen av RNA primere. Denne videoen vil dekke hvordan mikroarrayteknologi kan bidra til å omdefinere primase sekvensgjenkjenningssteder og hvordan en høy gjennomstrømning tilnærming kan kompliment klassisk biokjemi. Denne teknikken kombinerer to tilnærminger:primase DNA bindende mikroarray og primase aktivitet analyse.Mikroarrayet gir massive data om primase binding til DNA-sekvenser, hvor den biokjemiske analysen gir informasjon om RNA primer dannelse av DNA primase. Den testede enzymatiske aktiviteten avhenger av innsikten fra mikroarrayeksperimentet og dens nedre gjennomstrømning i sin natur. Koblingen mellom effektiviteten av binding, DNA sekvens valg og aktiviteten til enzymet er probed.Identifisering av sekvensavgjørelse ved hjelp av mikroarray, tillater oss å trekke nøyaktige konklusjoner basert på massive data om mikroarrayet. Denne tilnærmingen har blitt brukt så langt for å beskrive DNA bindende sekvenser av transkripsjonsfaktorer. Transkripsjonsfaktorer er statiske proteiner som binder seg tett til DNA.Å demonstrere prosedyren vil være Stefan Ilic. For å starte denne prosedyren, pre våt microarray lysbildet ved å plassere den i en coplin krukke som inneholder 0,01% Triton-X 100. Og roterer på en lab rotator, legg til 125 rpm i fem minutter.Pipette blokkeringsløsningen inn i en plastboks. Fjern deretter mikroarraysklien fra coplinkrukken. Bruk en fin klut til å kjøre ikke-DNA-siden og kantene på lysbildet.Plasser mikroarrayet langsomt inn i plastboksen. Inkuber ved romtemperatur i en time med langsom risting. Etter dette vasker du lysbildet én gang med 0,01%Tween-20 i PBS.På en lab rotator på 125 rpm i fem minutter. Fjern Tween-20 og skyll lysbildet én gang med 0,01% Triton-X 100 i PBS på en laboratorierotator ved 125 o/min i to minutter. Deretter overfører du raskt lysbildet til en coplin krukke som inneholder PBS.Først monterer du PMB-kammeret som beskrevet i tekstprotokollen. Plasser lysbildet i det angitte området. Bruk pinsett til å skyve den ned og venstre.Plasser silikonpakningen på toppen, og pass på at den er godt justert med den nedre delen av PBM-kammeret. Lukk deretter kammeret og stram skruene diagonalt. Pipette proteinbindende blandingen i hver brønn av pakningen.Deretter inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Til å begynne med, pipette 0,05% Tween-20 i PBS inn i PBM kammeret for å kort vaske lysbildet. Bruk en vakuumaspirator til å fjerne løsningen fra brønnene i kammeret og være forsiktig med å ikke berøre DNA-flekkene.Gjenta dette, vask lysbildet kort med PBS. Og bruk vakuumet til å fjerne løsningen fra brønnene i kammeret samtidig som du er forsiktig med å ikke berøre DNA-flekkene. Deretter legger Alexa 488 konjugert anti-hans antistoff til hver brønn av PBM kammeret.Inkuber i mørket ved romtemperatur i 30 minutter. Etter dette, vask kort lysbildet inne i PBM-kammeret ved å legge til noen dråper på 0,05% Tween-20 i PBS i hver brønn. Og bruk vakuumaspiratoren til å fjerne løsningen fra brønnene i kammeret, vær forsiktig med å ikke berøre DNA-flekkene.Demonter PBM-kammeret og fjern lysbildet. Skyll lysbildene to ganger i 0,05%Tween-20 i PBS, med hver skyll som varer i tre minutter. Skyll deretter lysbildene to ganger i PBS, med hver skyll som varer i tre minutter hver.Og en gang i dobbelt destillert vann i tre minutter. Tørk lysbildene med trykkluft. Og lagre dem i en mørk lysbildeboks til de er klare til å skanne.Når du er klar, bruk en mikroarrayskanner til å skanne brikken med en eksitasjon på 495 nanometer og et utslipp på 19 nanometer. Og samle median fluorescens intensitet. I denne studien pi gjennomstrømning primase profilering brukes til å kartlegge primase bindende nettsteder, inkludert de som er vanskelig om ikke umulig å observere ved hjelp av klassiske verktøy.Viktigere, pi gjennomstrømming primase profilering gjør det mulig å besøke den tradisjonelle forståelsen av primase bindende nettsteder. Spesielt pi gjennomstrømming primase profilering avslører bindende spesifisiteter i tillegg til kjente 5'GTC3'anerkjennelse sekvenser, noe som fører til endringer i funksjonelle aktiviteter av T7 DNA primase. Nemlig identifiseres to grupper med sekvenser.Sterke bindende DNA-sekvenser som inneholdt TG i flankene og svake bindende DNA-sekvenser som inneholdt AG i flankene. Ingen primase binding til DNA-maler som manglet 5'GTC3'i sine sekvenser ble oppdaget. De primære DNA-gjenkjenningsstedene som inneholder spesifikke funksjoner som TG rike flanker, øker primase DNA-bindingen opptil 10 ganger.Overraskende, de også øke lengden på nyopprettede RNA. Viktigere, høy gjennomstrømning primase profilering tillater oss å observere og kvantifisere variasjonen i primer lengde i forhold til sekvensen av DNA-malen. Når du utfører denne prosedyren, bør vasketrinnene være subtile.Og buffere bør inneholde komponenter som logget primase på DNA. Også en terskel for nytteløse bindende hendelser bestemmes biokjemisk. Derfor er analysen av mikroarray utilstrekkelig.Metoder som en overflate plasma resonans og gel skift analyser kan bestemme bindende affinitet av primase å velge DNA-sekvenser. Mitt laboratorium implementerer maskinlæring prediksjon modeller for å oppdage primase sekvens determinanter som gir produktive primere som kan utvides med DNA polymerase. I en tid med store data, en implementering av statistiske metoder for å analysere store data, vil teknikken definitivt bidra til å bedre karakterisere spesifikke DNA-sekvenser og knytte sekvensgjenkjenningen til aktiviteten til primase.Alle som arbeider med stråling bør ha grundig forståelse av forskrifter og farer forbundet med bruk av irasjonsstråling. Bør gjennomgå opplæring og bør arbeide med sikkerhetsutstyr.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust og høy gjennomstrømning ett molekyl flyte strekker analysen implementering for å studere Transport av molekyler langs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing av DNA-fragmenter i sanntid etter Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet analysen med nær-infrarøde fluorescerende merket DNA visualisert ved akrylamid Gel geleelektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA flekker metode basert på Formazan nedbør forårsaket av blå lyseksponering

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Sanntid observasjon av DNA Strand Exchange reaksjonen formidlet av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA geleelektroforese bruke Thiazole oransje i stedet for Ethidium Bromide eller alternativ fargestoffer

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...