Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (subvenção n º 1023/18).

1. projeto do microarray
Nota: as sondas de DNA representam sequências 36-nucleotídicas personalizadas, consistindo no local de reconhecimento para a primase de DNA T7 (GTC) localizada entre duas regiões de flanqueamento variáveis, seguidas por uma sequência de 24 nucleotídeo constante presa a uma lâmina de vidro3. Utilizou-se um formato de Microarray de 4 x 180.000, que permitiu detectar cada sequência de DNA em seis repetições, distribuídas aleatoriamente no ...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

O método de PBM tem sido amplamente utilizado para investigar as propriedades vinculativas dos fatores de transcrição e também pode ser aplicado a enzimas de processamento de DNA, como a primase do DNA, que se ligam ao DNA com baixa afinidade. No entanto, certas modificações dos procedimentos experimentais são necessárias. A experimentação do microarray envolve diversas etapas: projeto da biblioteca do ADN, preparação da microplaqueta, emperramento do alvo da proteína, rotulagem fluorescente, e exploração....

O HTPP faz uso da tecnologia de Microarray de ligação ao DNA combinada com a análise bioquímica (Figura 1) para identificar estatisticamente as características específicas dos modelos de DNA que afetam a atividade enzimática da PRIMASE do DNA. Portanto, a HTPP fornece uma plataforma tecnológica que facilita um salto de conhecimento no campo. As ferramentas clássicas usadas para determinar os locais do reconhecimento do primase não têm a habilidade de render a quantidade maciça de dados, visto que HTPP faz.
A PBM é uma técnica rotineiramente utilizada para determinar as preferências vinculativas dos fatores de transcrição ao DNA1,2; Entretanto, não é apropriado para a deteção da ligação fraca/transiente das proteínas ao ADN. Ao contrário do universal PBM que fornece informações sobre a especificidade de ligação de proteínas média para todas as seqüências possíveis consistindo de oito pares de base, HTPP é baseado na biblioteca de modelos de DNA single-encalhado compreendendo elementos de seqüência única. Tais elementos de sequência de DNA envolvem dezenas de milhares de sequências genómicas curtas (poucas dezenas de BP), bem como sequências de DNA computacionalmente projetadas enriquecidas em determinados elementos de seqüência repetitiva de DNA presentes no genoma, que possuem diferentes conteúdos médios de GC . Essa abordagem de alta taxa de transferência permite a determinação de, de forma sistemática, quantitativa e orientada por hipóteses, as propriedades relacionadas à seqüência que são importantes para a vinculação de primase e sua atividade enzimática3. Em particular, a ligação importante entre as preferências de encadernação do primase-DNA, (modulada por sequências de DNA flanqueando sítios de ligação de Tri-nucleotídeo específicos) e a processividade de primase foi identificada para este sistema enzimático4.
A nova tecnologia foi aplicada para rever a nossa compreensão de sítios de reconhecimento de primase, mesmo para a primase de DNA T7 que tem sido extensivamente estudada5. Especificamente, o reexame de conceitos clássicos, tais como sítios de reconhecimento de DNA da primase de DNA T7 (que foram determinados há quase quatro décadas atrás 6) usando microarray de ligação de DNA de proteína (PBM) levou a uma visão sem precedentes sobre as características relacionadas com a seqüência de flanquear esses sites de reconhecimento3. Esperava-se que as sequências flanqueando o local de reconhecimento Tri-nucleotídeo de T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') será aleatório. Em vez disso, descobrimos que sequências de flanqueamento ricas em TG aumentam as chances de a primase do DNA T7 sintetizar primers de RNA mais longos, indicando um aumento na processividade.
Outros métodos que podem ser usados para estudar Propriedades de ligação de DNA de proteínas in vitro incluem o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA)7, DNase I footprinting8, ressonância de superfície-Plasmon (SPR)9, e blotting do sudoeste 10. These são, entretanto, métodos Low-Throughput somente aplicáveis a investigar um número pequeno de seqüências do ADN. Além disso, a precisão e a sensibilidade de algumas dessas técnicas (por exemplo, EMSA) é baixa. Por outro lado, a seleção in vitro11 é uma técnica que, da mesma forma que a PBM, pode ser utilizada para a identificação de numerosas sequências vinculativas. No entanto, as sequências de baixa afinidade geralmente são excluídas na maioria das aplicações de seleção in vitro; Portanto, essa abordagem não é adequada para a obtenção de dados de vinculação comparativa para todas as seqüências disponíveis. O PBM universal1,2é usado principalmente para caracterizar as especificidades vinculativas dos fatores de transcrição de procariontes e eucariontes, bem como fatores específicos (por exemplo, presença de certos ligantes, cofatores, etc.) que podem afetam essa interação12.
HTPP expande a aplicação de PBM às enzimas de processamento do ADN combinando o poder estatístico sem precedentes da elevado-produção com a elevada precisão para fornecer a informação no contexto obrigatório da seqüência. Tais dados ainda não foram obtidos para primases e enzimas relacionadas (que têm ligação fraca/transitória ao DNA) devido a limitações técnicas acima mencionadas de outras técnicas disponíveis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

O primase do ADN sintetiza os primers curtos do RNA que iniciam a síntese do ADN de fragmentos de Okazaki na costa retardamento pela polimerase do ADN durante a replicação do ADN. A ligação de procarióticas dnaG-como primases ao ADN ocorre em uma seqüência específica do reconhecimento do trinucleotide. É um passo crucial na formação de fragmentos de Okazaki. As ferramentas bioquímicas convencionais que são usadas para determinar a seqüência do reconhecimento do ADN do primase do ADN fornecem somente a informação limitada. Usando um ensaio de ligação baseado em microarray de alta taxa de transferência e análises bioquímicas consecutivas, foi demonstrado que 1) o contexto de ligação específico (seqüências de flanqueamento do local de reconhecimento) influencia a força de ligação da primase do DNA ao seu modelo DNA, e 2) o emperramento mais forte do primase ao ADN rende uns primers mais longos do RNA, indicando o processivity mais elevado da enzima. Este método combina o ensaio da atividade de PBM e de primase e é designado como o perfilamento do primase da elevado-produção (HTPP), e permite a caracterização do reconhecimento de seqüência específico pelo primase do ADN no tempo e na escalabilidade sem precedentes.

Este avanço tecnológico para mapear os sítios de encadernação primase permite a obtenção de propriedades de ligação de DNA que são difíceis, se não impossíveis, de observar usando ferramentas clássicas. Mais importante, HTPP permite a revisitação da compreensão tradicional de sítios de encadernação primase. Especificamente, o HTPP revela especificidades vinculativas, além das conhecidas sequências de reconhecimento 5 '-GTC-3 ', o que leva a alterações nas atividade...

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Experimentos de Microarray de ligação proteica (PBM) combinados com ensaios bioquímicos ligam as propriedades vinculativas e catalíticas da primase do DNA, uma enzima que sintetiza os primers de RNA no DNA do modelo. Este método, designado como o perfilamento do primase da elevado-taxa de transferência (HTPP), pode ser usado para revelar testes padrões DNA-Binding de uma variedade de enzimas.

Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Este protocolo descreve a coleta de dados maciços da microarray de ligação proteína-DNA para primase, uma enzima que se liga transitóriamente a sequências específicas de DNA e, por sua vez, catalisa a formação de primers de RNA. Este vídeo abordará como a tecnologia de microarray pode ajudar a redefinir sites de reconhecimento de sequências primase e como uma abordagem de alto rendimento pode complementar a bioquímica clássica. Esta técnica combina duas abordagens: microarray de ligação de DNA primase e ensaio de atividade primase.A microarray fornece dados maciços de ligação primase às sequências de DNA, enquanto o ensaio bioquímico fornece informações sobre a formação de primer de RNA por primase de DNA. A atividade enzimática testada depende da percepção do experimento de microarray e de sua menor produção em sua natureza. A ligação entre a eficiência da ligação, a seleção da sequência de DNA e a atividade da enzima é sondada.A identificação da determinação sequencial usando microarray, nos permite tirar conclusões precisas baseadas em dados maciços da microarray. Esta abordagem tem sido usada até agora para descrever sequências de vinculação de DNA de fatores de transcrição. Fatores de transcrição são proteínas estáticas que se ligam firmemente ao DNA.Demonstrando o procedimento será Stefan Ilic. Para iniciar este procedimento, pré molhe o slide de microarray colocando-o em um frasco de coplin contendo 0,01% Triton-X 100. E girando em um rotador de laboratório, adicione 125 rpm por cinco minutos.Pipetar a solução de bloqueio em uma caixa de plástico. Em seguida, remova o slide de microarray do frasco de coplin. Use uma limpeza fina para conduzir o lado não-DNA e as bordas do slide.Coloque lentamente a microarray na caixa de plástico. Incubar em temperatura ambiente por uma hora com agitação lenta. Depois disso, lave o slide uma vez com 0,01% Tween-20 em PBS.Em um rotador de laboratório a 125 rpm por cinco minutos. Remova o Tween-20 e enxágue o slide uma vez com 0,01% Triton-X 100 em PBS em um rotador de laboratório a 125 rpm por dois minutos. Em seguida, transfira rapidamente o slide para um frasco de coplin contendo PBS.Primeiro, montar a câmara do PMB conforme descrito no protocolo de texto. Coloque o slide no espaço designado. Use pinças para empurrá-la para baixo e para a esquerda.Coloque a junta de silício por cima, certificando-se de que está bem alinhada com a parte inferior da câmara PBM. Em seguida, feche a câmara e aperte os parafusos na diagonal. Pipeta a mistura de ligação de proteína em cada poço da junta.Em seguida, incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Para começar, pipeta 0,05% Tween-20 em PBS na câmara PBM para lavar brevemente o slide. Usando um aspirador de vácuo, remova a solução dos poços da câmara tendo o cuidado de não tocar nos pontos de DNA.Repita isso, lave brevemente o slide com PBS. E use o vácuo para remover a solução dos poços da câmara enquanto tome cuidado para não tocar nos pontos de DNA. Em seguida, adicione Alexa 488 anticorpo conjugado a cada poço da câmara PBM.Incubar no escuro à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, lave brevemente o slide dentro da câmara PBM adicionando algumas gotas de 0,05% Tween-20 em PBS em cada poço. E use o aspirador de vácuo para remover a solução dos poços da câmara, tomando cuidado para não tocar nos pontos de DNA.Desmonte a câmara PBM e remova o slide. Enxágüe os slides duas vezes em 0,05% Tween-20 em PBS, com cada enxágue durando três minutos. Em seguida, enxágue os slides duas vezes em PBS, com cada enxágue durando três minutos cada.E uma vez em água dupla destilada por três minutos. Seque as lâminas com ar comprimido. E armazená-los em uma caixa de slides escuro até estar pronto para digitalizar.Quando estiver pronto, use um scanner de microarray para escanear o chip com uma excitação de 495 nanômetros e uma emissão de 19 nanômetros. E coletar a intensidade mediana da fluorescência. Neste estudo, o perfil de primase pi é usado para mapear os locais de ligação primase, incluindo aqueles que são difíceis, se não impossíveis de serem observados usando ferramentas clássicas.É importante ressaltar que o perfil de primase pi permite a revisitação da compreensão tradicional dos locais de ligação primase. Especialmente o perfil de primase pi throughput revela especificidades vinculantes, além das sequências de reconhecimento conhecidas de 5'GTC3', o que leva a mudanças nas atividades funcionais do primase de DNA T7. Ou seja, dois grupos de sequências são identificados.Fortes sequências de DNA de ligação que continham TG nos flancos e sequências de DNA de ligação fraca que continham AG nos flancos. Nenhuma ligação primase aos modelos de DNA que faltavam 5'GTC3'dentro de suas sequências foi detectada. Os locais de reconhecimento de DNA primase que contêm características específicas, como flancos ricos em TG, aumentam a ligação de DNA primase em até 10 vezes.Surpreendentemente, eles também aumentam o comprimento do RNA recém-formado. É importante ressaltar que o perfil primase de alto rendimento nos permite observar e quantificar a variabilidade no comprimento do primer em relação à sequência do modelo de DNA. Ao realizar este procedimento, as etapas de lavagem devem ser sutis.E os buffers devem conter componentes que registraram o primase no DNA. Também é determinado um limiar de eventos de ligação fúteis bioquimicamente. Portanto, a análise da microarray é insuficiente.Métodos como ressonância de plasma superficial e ensaios de mudança de gel podem determinar a afinidade vinculante do primase para selecionar as sequências de DNA. Meu laboratório implementa modelos de previsão de aprendizado de máquina para detectar determinantes de sequência de primase que produzem primers produtivos que podem ser estendidos pela polimerase de DNA. Na era do big data, uma implementação de métodos estatísticos para analisar big data, a técnica definitivamente ajudará a caracterizar melhor sequências específicas de DNA e vincular o reconhecimento de sequência à atividade de primase.Qualquer pessoa que trabalhe com radiação deve ter uma compreensão completa das regulamentações e perigos associados ao uso de radiação ionizante. Deve passar por treinamento e deve trabalhar com equipamentos de segurança.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Bioquímica

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Ensaio da atividade de DNA polimerase usando infravermelho fluorescente etiquetado DNA visualizado pela electroforese do Gel do acrilamido

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Observação em tempo real da reação de troca de fita de DNA mediada por Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Eletroforese de DNA usando tiazol laranja em vez de brometo de etídio ou corantes alternativos

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Perfil e identificação de nitropeptídeos ilustrados pela angiotensina II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...