Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Denna forskning stöddes av ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant nr 1023/18).

1. utformning av microarray
Anmärkning: DNA-sonder representerar anpassade 36-nukleotidsekvenser, bestående av tolknings platsen för T7 DNA-Primase (GTC) som ligger mellan två variabla flanka regioner, följt av en konstant 24-nukleotid sekvens bundna till en glas bild3. Vi använde en 4 x 180 000 microarray format, som möjliggjorde spotting av varje DNA-sekvens i sex replikat, slumpmässigt fördelade på bilden.
<ol><li>
Design av DNA-bibliotek för pri...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

PBM-metoden har ofta använts för att undersöka bindningsegenskaper hos transkriptionsfaktorer och kan även appliceras på DNA-bearbetningsenzymer, såsom DNA-Primase, som binder till DNA med låg affinitet. Emellertid, vissa ändringar av experimentella förfaranden krävs. Microarray experimentet omfattar flera steg: design av DNA-biblioteket, beredning av chip, bindning av proteinet målet, fluorescerande märkning, och skanning. Milda tvättsteg är kritiska, eftersom de långa tvättar med lösningar som innehål...

HTPP använder sig av DNA-bindande Mikroarrayteknik kombinerat med biokemisk analys (figur 1) för att statistiskt identifiera specifika egenskaper hos DNA-mallar som påverkar den enzymatiska AKTIVITETEN hos DNA-Primase. Därför erbjuder HTPP en teknologisk plattform som underlättar ett kunskaps språng på fältet. De klassiska verktyg som används för att bestämma Primase erkännande platser inte har förmågan att ge massiv mängd data, medan HTPP gör.
PBM är en teknik som rutinmässigt används för att bestämma bindnings preferenserna för transkriptionsfaktorerna till DNA1,2; emellertid, det är inte lämpligt för detektion av svag/övergående bindning av proteiner till DNA. Till skillnad från Universal PBM som ger information om genomsnittlig proteinbindnings noggrannhet till alla möjliga sekvenser bestående av åtta bas par, är HTPP baserad på biblioteket av enkelsträngade DNA-mallar som består av unika sekvens element. Sådana DNA-sekvens element innebär tiotusentals korta (några tiotals BP) genomiska sekvenser, samt beräkningsmässigt utformade DNA-sekvenser berikats i vissa DNA repetitiva sekvens element som finns i genomet, som besitter olika genomsnittliga GC innehåll . En sådan hög genomströmning tillvägagångssätt möjliggör bestämning av, på ett systematiskt, kvantitativt och hypotes-driven sätt, sekvens-relaterade egenskaper som är viktiga för Primase bindning och dess enzymatisk aktivitet3. I synnerhet har den viktiga kopplingen mellan Primase-DNA-bindande preferenser (modulerad med DNA-sekvenser som kantas av specifika Tri-nukleotidbindnings ställen) och primasprocessivitet identifierats för detta enzymatiska system4.
Den nya tekniken tillämpades för att åter besöka vår förståelse av Primase erkännande platser även för T7 DNA Primase som har studerats utförligt5. Specifikt, förnyad undersökning av klassiska begrepp, såsom DNA-erkännande platser av T7 DNA Primase (som bestämdes nästan fyra decennier sedan 6) med hjälp av protein-DNA-bindning microarray (PBM) har lett till oöverträffad insikt i funktioner relaterade till den kompletterande sekvens av dessa erkännande platser3. Det förväntades att sekvenserna flanera Tri-nukleotid erkännande plats av T7 DNA Primase (5 '-GTC-3 ') kommer att vara slumpmässigt. Istället fann vi att TG-rika kompletterande sekvenser öka chanserna för T7 DNA Primase att syntetisera längre RNA-primers indikerar en ökning av processivitet.
Andra metoder som kan användas för att studera DNA-bindande egenskaper hos proteiner in vitro inkluderar den elektroforetiska Mobility Shift-analysen (EMSA)7, DNase I fotavtryck8, Surface-Plasmon resonans (SPR)9, och sydvästra blotting 10. dessa är dock låg genomflöde metoder endast tillämpas för att undersöka ett litet antal DNA-sekvenser. Dessutom är precisionen och känsligheten hos vissa av dessa tekniker (t. ex. EMSA) låg. Å andra sidan, in vitro-val11 är en teknik som, på samma sätt som PBM, kan användas för identifiering av många bindnings sekvenser. Låg affinitet sekvenser är dock oftast uteslutna i de flesta tillämpningar av in vitro-val; den här metoden lämpar sig därför inte för att erhålla jämförande bindnings data för alla tillgängliga sekvenser. Universal PBM1,2 används främst för att karakterisera de bindande särdragen hos transkriptionsfaktorerna från prokaryoter och Eukaryoter samt specifika faktorer (t. ex. förekomst av vissa ligander, kofaktorer etc.) som kan påverka denna interaktion12.
HTPP utökar PBM-programmet till DNA-bearbetningsenzymer genom att kombinera oöverträffad statistisk kraft med hög kapacitet med hög precision för att ge information om bindningssekvenskontext. Sådana uppgifter har ännu inte erhållits för primaser och relaterade enzymer (som har svag/övergående bindning till DNA) på grund av ovannämnda tekniska begränsningar för andra tillgängliga tekniker.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA-Primase syntetiserar korta RNA-primrar som initierar DNA-syntes av Okazaki fragment på släpar strand med DNA-polymeras under DNA-replikering. Bindningen av prokaryota DnaG-liknande primaser till DNA sker vid en specifik trinukleotid erkännande sekvens. Det är ett avgörande steg i bildandet av Okazaki fragment. Konventionella biokemiska verktyg som används för att bestämma DNA-igenkänningssekvens av DNA-Primase ger endast begränsad information. Med hjälp av ett mikromatrisbaserat bindnings test med hög kapacitet och konsekutiva biokemiska analyser har det visats att 1) den specifika bindnings kontexten (flanka sekvenser av tolknings platsen) påverkar DNA-priminas bindningsstyrka till dess mall DNA, och 2) starkare bindning av Primase till DNA ger längre RNA-primers, vilket indikerar högre processivitet av enzymet. Denna metod kombinerar PBM och Primase Activity assay och betecknas som High-throughput Primase profilering (HTPP), och det gör karakterisering av specifika sekvens erkännande av DNA-Primase i oöverträffad tid och skalbarhet.

Denna tekniska förskott för kartläggning av Primase bindande platser tillåter erhållande av DNA-bindande egenskaper som är svåra, om inte omöjligt, att observera med hjälp av klassiska verktyg. Ännu viktigare, HTPP möjliggör återbesök av den traditionella förståelsen av Primase bindande webbplatser. Specifikt, HTPP avslöjar bindande särdrag utöver kända 5 '-GTC-3 ' erkännande sekvenser, vilket leder till förändringar i funktionella aktiviteter av T7 DNA Primase. Nä...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Proteinbindnings metoder för microarray (PBM) kombinerat med biokemiska analyser binder samman de bindande och katalytiska egenskaperna hos DNA-Primase, ett enzym som syntetiserar RNA-primers på mallDNA. Denna metod, som betecknas som hög genomströmning Primase profilering (HTPP), kan användas för att avslöja DNA-bindande mönster av en mängd olika enzymer.

DNA-sekvens erkännande av DNA-Primase med hög genomströmning Primase profilering

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Detta protokoll beskriver insamling av massiva data från protein-DNA bindande microarray för primas, ett enzym som transiently binder till specifika DNA-sekvenser och i sin tur katalyserar bildandet av RNA-primers. Denna video kommer att omfatta hur microarray teknik kan hjälpa till att omdefiniera primas sekvens erkännande webbplatser och hur en hög genomströmning strategi kan komplettera klassisk biokemi. Denna teknik kombinerar två tillvägagångssätt:primase DNA bindande microarray och primas aktivitet assay.Mikroarrayen ger massiva data av primasebindning till DNA-sekvenser, var som den biochemical analysen ger information på RNA-primerbildande vid DNA-primase. Den testade enzymatiska aktiviteten beror på insikten från mikroarrayexperimentet och dess lägre genomströmning i sin natur. Kopplingen mellan effektiviteten av bindande, DNA-sekvensval och aktiviteten av enzymet är probed.Identifiering av sekvens avskräckande avanst är med hjälp av microarray, gör det möjligt för oss att dra korrekta slutsatser baserade på massiva data av microarray. Detta tillvägagångssätt har hittills använts för att beskriva DNA-bindningssekvenser av transkriptionsfaktorer. Transkriptionsfaktorer är statiska proteiner som binder tätt till DNA.Demonstrerar proceduren blir Stefan Ilic. För att påbörja detta förfarande, pre våt microarray slide genom att placera den i en coplin burk som innehåller 0,01%Triton-X 100. Och rotera på en lab rotator, lägga till 125 rpm i fem minuter.Pipettera blockeringslösningen i en plastlåda. Ta sedan bort microarray-bilden från coplinburken. Använd en fin torka för att driva icke-DNA-sidan och kanterna på bilden.Placera långsamt mikroarrayen i plastlådan. Inkubera i rumstemperatur i en timme med långsam skakning. Efter detta tvättar du skjutglaset en gång med 0,01%Tween-20 i PBS.På en labbrotator vid 125 rpm i fem minuter. Ta bort Tween-20 och skölj av objektglaset en gång med 0,01%Triton-X 100 i PBS på en labrotator vid 125 varv/min i två minuter. Sedan snabbt överföra bilden till en coplin burk som innehåller PBS.Först monterar du PMB-kammaren enligt textprotokollet. Placera in glidbanan i det angivna utrymmet. Använd pincett för att trycka ner den och vänster.Placera silikonpackningen ovanpå, se till att den är väl i linje med den nedre delen av PBM kammaren. Stäng sedan kammaren och dra åt skruvarna diagonalt. Pipettera proteinbindningsblandningen i varje brunn av packningen.Sedan, inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. Till att börja med pipetteras 0,05%Tween-20 i PBS in i PBM-kammaren för att kort tvätta objektglaset. Med hjälp av en vakuumaspirator, ta bort lösningen från brunnarna i kammaren är noga med att inte röra DNA-fläckar.Upprepa detta, tvätta kortfattat glidglaset med PBS. Och använd vakuumet för att ta bort lösningen från brunnarna i kammaren samtidigt som du är noga med att inte röra DNA-fläckarna. Lägg därefter till Alexa 488 konjugerad anti-Hans Antikropp till varje brunn i PBM-kammaren.Inkubera i mörker i rumstemperatur i 30 minuter. Efter detta, kort tvätta bilden inuti PBM kammaren genom att lägga till några droppar av 0,05%Tween-20 i PBS i varje brunn. Och använd vakuumaspiratorn för att ta bort lösningen från brunnarna i kammaren, var noga med att inte röra DNA-fläckarna.Ta isär PBM-kammaren och ta bort objektglaset. Skölj objektglasen två gånger i 0,05%Tween-20 i PBS, var och en sköljning varar tre minuter. Skölj sedan bilderna två gånger i PBS, med varje sköljning som varar tre minuter vardera.Och en gång i dubbelt destillerat vatten i tre minuter. Torka objektglasen med tryckluft. Och förvara dem i en mörk ruta tills redo att skanna.När du är klar, använd en mikroarrayskanner för att skanna chipet med en excitation av 495 nanometer och ett utsläpp av 19 nanometer. Och samla medianen fluorescens intensitet. I denna studie pi genomströmning primase profilering används för att kartlägga primase bindning platser, inklusive de som är svåra om inte omöjligt att observera med hjälp av klassiska verktyg.Viktigt, pi genomströmning primase profilering möjliggör återbesök av den traditionella förståelsen av primase bindande platser. Speciellt pi genomströmning primase profilering avslöjar bindande särdrag utöver kända 5'GTC3'recognition sekvenser, vilket leder till förändringar i funktionella aktiviteter av T7 DNA primase. Nämligen två grupper av sekvenser identifieras.Starka bindande DNA-sekvenser som innehöll TG i flankerna och svaga bindande DNA-sekvenser som innehöll AG i flankerna. Ingen primase bindning till DNA-mallar som saknades 5'GTC3'within deras sekvenser upptäcktes. De primase DNA-igenkänningsplatserna som innehåller specifika funktioner som TG-rika flanker, ökar primas DNA-bindning upp till 10 gånger.Överraskande nog ökar de också längden på nybildade RNA. Viktigt, hög genomströmning primase profilering tillåter oss att observera och kvantifiera variationer i primer längd i förhållande till sekvensen av DNA-mallen. När du utför denna procedur tvättstegen bör vara subtila.Och buffertar ska innehålla komponenter som loggade primas på DNA. Också en tröskel av fruktlösa bindande händelser bestäms biokemiskt. Därför är analys av microarrayen otillräcklig.Metoder som en ytplasmaresonans och gelskiftanalyser kan bestämma bindningsaffiniteten hos primas för att välja DNA-sekvenserna. Mitt labb implementerar modeller för maskininlärning förutsägelse för att upptäcka primas sekvens bestämningsfaktorer som ger produktiva primers som kan förlängas med DNA-polymeras. I en tid präglad av stordata, ett genomförande av statistiska metoder för att analysera stordata, tekniken kommer definitivt att bidra till att bättre karakterisera specifika DNA-sekvenser och koppla sekvensigenkänning till aktiviteten av primase.Alla som arbetar med strålning bör ha grundlig förståelse för föreskrifter och faror i samband med användning av joniserande strålning. Bör genomgå utbildning och bör arbeta med säkerhetsutrustning.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

En enkel, Robust och hög genomströmning enda molekyl Flow Stretching Assay genomförandet för att studera Transport av molekyler längs DNA

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Spårning i realtid av DNA-fragment separering av smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA-polymeras aktivitet Assay använder infrarött fluorescerande märkt DNA visualiseras med akrylamid gelelektrofores

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA färgning metod baserad på Formazan nederbörd induceras av blå ljus exponering

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Realtid Observation av DNA Strand Exchange reaktionen medieras av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA elektrofores med Thiazole Orange istället för etidiumbromid eller alternativa färgämnen

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering och identifiering illustrerad av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för DNA-metyltransferashämmare

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...