Name: dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

Bu araştırma İsRAİl Bİlİm VAKFI (hibe no. 1023/18) tarafından desteklenmiştir.

1. Mikrodizi tasarımı
NOT: DNA probları, iki değişken yan bölge arasında yer alan T7 DNA primazının (GTC) tanıma bölgesinden oluşan özel 36 nükleotit dizilerini temsil eder ve ardından cam birslayt3'ebağlı sabit 24 nükleotit dizisi bulunur. 4 x 180.000 mikrodizi formatı kullandık, bu da her DNA dizisinin altı kopyada tespit ini sağladı, slaytta rastgele dağıtıldı.
<ol><li>
Bilinen tanıma dizilerine sahip primases için DNA kitaplı?...

<ol>
	<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+binding+microarrays+(PBMs)+for+rapid,+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins.">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors.">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li><li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase.">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li><li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition.">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site.">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7.">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li><li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis.">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+(real+time+kinetics).">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).</li><li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting.">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li><li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides:+analysis+of+yeast+GCN4+protein.">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li><li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition.">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li></ol>

PBM yöntemi transkripsiyon faktörlerinin bağlayıcı özelliklerini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır ve düşük afinite ile DNA'ya bağlanan DNA primazgibi DNA işleme enzimlerine de uygulanabilir. Ancak, deneysel prosedürlerin bazı değişiklikler gereklidir. Mikrodizi deneyi birkaç adım içerir: DNA kütüphanesinin tasarımı, çipin hazırlanması, protein hedefinin bağlanması, floresan etiketleme ve tarama. Deterjan içeren solüsyonlar ile uzun yıkamalar zayıf/geçici bağlanma modu ...

HTPP, DNA primazının enzimatik aktivitesini etkileyen DNA şablonlarının belirli özelliklerini istatistiksel olarak belirlemek için biyokimyasal analizle birlikte DNA bağlayıcı mikrodizi teknolojisini(Şekil 1)kullanır. Bu nedenle HTPP, bu alanda bilgi sıçramasını kolaylaştıran teknolojik bir platform sağlamaktadır. Primaz tanıma sitelerini belirlemek için kullanılan klasik araçlar büyük miktarda veri verme yeteneğine sahip değildir, oysa HTPP bunu yapar.
PBM, transkripsiyon faktörlerinin DNA1,2'yebağlanma tercihlerini belirlemek için rutin olarak kullanılan bir tekniktir; ancak proteinlerin DNA'ya zayıf/geçici bağlanmasının saptanması için uygun değildir. Sekiz baz çiftinden oluşan tüm olası dizilere ortalama protein bağlama özgüllüğü hakkında bilgi sağlayan evrensel PBM'nin aksine, HTPP benzersiz dizi öğelerinden oluşan tek iplikli DNA şablonlarının kitaplığına dayanır. Bu tür DNA dizisi elemanları on binlerce kısa (birkaç on bp) genomik dizinin yanı sıra genomda bulunan ve farklı ortalama GC içeriğine sahip olan bazı DNA tekrarlayan dizi elementlerinde zenginleştirilmiş hesaplamalı olarak tasarlanmış DNA dizilerini içerir. . Böyle bir yüksek iş ilişkisi yaklaşımı, sistematik, nicel ve hipotez odaklı bir şekilde, ilkel bağlama ve enzimatik aktivitesi için önemli olan diziile ilgili özelliklerin belirlenmesine olanak sağlar3. Özellikle, primase-DNA bağlama tercihleri arasındaki önemli bağlantı, (spesifik üç nükleotit bağlama siteleri çevreleyen DNA dizileri tarafından modüle) ve primase prosesivite bu enzimatik sistem için tespit edilmiştir4.
Yeni teknoloji kapsamlı 5çalışılmıştırT7 DNA primase için bile primase tanıma siteleri anlayışımızı yeniden ziyaret etmek için uygulanmıştır. Özellikle, t7 DNA primase DNA tanıma siteleri gibi klasik kavramların yeniden incelenmesi (yaklaşık 40 yıl önce tespit edildi 6) protein-DNA bağlayıcı mikrodizi (PBM) ile ilgili özellikleri daha önce görülmemiş bir anlayış yol açmıştır bu tanıma sitelerinin yan sırası3. T7 DNA primazının (5'-GTC-3') üç nükleotid tanıma bölgesini çevreleyen sekansların rastgele olması beklenmektedir. Bunun yerine, TG açısından zengin yan dizilerin T7 DNA primazının daha uzun RNA astarlarını sentezleme şansını artırdığını ve proseste bir artış olduğunu gördük.
Proteinlerin DNA bağlayıcı özelliklerini in vitro incelemek için kullanılabilecek diğer yöntemler arasında elektroforetik hareketlilik değişim testi (EMSA)7, DNase I ayak izi8, yüzey plazmon rezonans (SPR)9ve Güneybatı blotting 10. Ancak bunlar, düşük iş verme yöntemleridir, sadece az sayıda DNA dizisinin araştırılması için geçerlidir. Buna ek olarak, bu tekniklerden bazılarının (örneğin, EMSA) hassasiyeti ve hassasiyeti düşüktür. Diğer taraftan, in vitro selection11, PBM'ye benzer şekilde, çok sayıda bağlama dizisinin tanımlanmasında kullanılabilecek bir tekniktir. Ancak, düşük yakınlık dizileri genellikle in vitro seçimi nin çoğu uygulamasında dışlanır; bu nedenle, bu yaklaşım tüm kullanılabilir diziler için karşılaştırmalı bağlama verileri elde etmek için uygun değildir. Evrensel PBM1,2 esas olarak prokaryotlar ve ökaryotlar dan transkripsiyon faktörlerin bağlayıcı özellikleri yanı sıra belirli faktörler (örneğin, bazı ligands varlığı, kofactors, vb) karakterize etmek için kullanılır bu etkileşimi etkiler12.
HTPP, ciltleme sırası bağlamı hakkında bilgi sağlamak için eşi görülmemiş yüksek iş letiye istatistiksel gücü yüksek hassasiyetle birleştirerek PBM uygulamasını DNA işleme enzimlerine genişletir. Bu tür veriler, mevcut diğer tekniklerin yukarıda belirtilen teknik sınırlamaları nedeniyle primases ve ilgili enzimler (DNA'ya zayıf/geçici bağlayıcılığı olan) için henüz elde edilmemiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1006401000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated anti-his antibody</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>35310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonuium persulfate (APS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP, [&#945;-32P] &#8211; 3000 Ci/mmol</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG003H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid, granular</td>
			<td>Glentham Life Sciences</td>
			<td>GE4425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA microarray</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>4x180K (AMADID #78366) 
			https://www.agilent.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC118430010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fujifilm FLA-5100 phosphorimager</td>
			<td>FUJIFILM Life Science</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide staining rack</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12869995</td>
			<td>If several slides are used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab rotator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63064-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray Hybridization Chamber</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2534A</td>
			<td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microarray scanner (GenePix 4400A)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium glutamate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A172232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0466S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmon testes DNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skim milk powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70166-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12657696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93362-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B21530</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna sequence recognition by dna primase using high-throughput primase profiling

DNA primazı, DNA replikasyonu sırasında DNA polimeraz tarafından gecikmeli iplikçikteki Okazaki parçalarının DNA sentezini başlatan kısa RNA astarları sentezler. Prokaryotik DnaG benzeri primazların DNA'ya bağlanması belirli bir trinükleotid tanıma dizisinde gerçekleşir. Okazaki parçalarının oluşumunda önemli bir adımdır. DNA primazlarının DNA tanıma dizilimini belirlemek için kullanılan konvansiyonel biyokimyasal araçlar sadece sınırlı bilgi sağlar. Yüksek iş gücü mikrodizi tabanlı bağlayıcı test ve ardışık biyokimyasal analizler kullanılarak, 1) spesifik bağlayıcı bağlamın (tanıma alanının yan dizileri) DNA primazının şablonuna bağlanma gücünü etkilediği gösterilmiştir. DNA, ve 2) DNA primase daha güçlü bağlanması daha uzun RNA astarları verir, enzimin daha yüksek prosesini gösterir. Bu yöntem PBM ve primaz aktivite testi birleştirir ve yüksek iş itfa primase profilleme (HTPP) olarak belirlenmiş ve dna primaz tarafından benzeri görülmemiş zaman ve ölçeklenebilirlik belirli dizi tanıma karakterizasyonu sağlar.

Primase bağlama alanlarının haritalanmasındaki bu teknolojik ilerleme, klasik aletler kullanılarak gözlemlemek imkansız olmasa da, zor olan DNA bağlama özelliklerinin elde edilmesine olanak sağlar. Daha da önemlisi, HTPP primase bağlayıcı sitelerin geleneksel anlayış yeniden ziyaret sağlar. Özellikle HTPP, bilinen 5'-GTC-3 tanıma dizilerine ek olarak bağlayıcı özellikleri ortaya çıkarır ve bu da T7 DNA primazının fonksiyonel aktivitelerinde değişikliklere yol...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling at JoVE.com

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

Protein bağlayıcı mikrodizi (PBM) deneyleri biyokimyasal tahlillerle birleşince, şablon DNA üzerinde RNA astarlarını sentezleyen bir enzim olan DNA primazının bağlayıcı ve katalitik özelliklerini birbirine bağlar. Yüksek iş itrifli primase profilleme (HTPP) olarak tanımlanan bu yöntem, çeşitli enzimlerin DNA bağlayıcı desenlerini ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Bu protokol, belirli DNA dizilerine geçici olarak bağlanan ve rna astarlarının oluşumunu katalizler eden bir enzim olan primaz için protein-DNA bağlayıcı mikrodiziden büyük veri toplanmasını tanımlar. Bu video, mikrodizi teknolojisinin primaz dizisi tanıma sitelerinin yeniden tanımlanmasına nasıl yardımcı olabileceğini ve yüksek iş artışı yaklaşımının klasik biyokimyaya nasıl iltifat edebileceğini kapsayacak. Bu teknik iki yaklaşımı birleştirir: primaz DNA bağlayıcı mikrodizi ve primaz aktivitesi testi.Mikrodizi, DNA dizilerine bağlanan primazın büyük verisini sağlarken, biyokimyasal satok DNA primazı ile RNA astar oluşumu hakkında bilgi sağlar. Test edilen enzimatik aktivite, mikrodizi deneyinin içgörüsünü ve doğasındaki düşük iş baçısından değişir. Bağlanmanın etkinliği, DNA dizisi seçimi ve enzimin aktivitesi arasındaki bağlantı incelenir.Mikrodizi kullanarak dizi determinansının tanımlanması, mikrodizinin devasa verilerine dayanarak doğru sonuçlar çıkarmamızı sağlar. Bu yaklaşım şimdiye kadar transkripsiyon faktörlerinin DNA bağlayıcı dizilerini tanımlamak için kullanılmıştır. Transkripsiyon faktörleri DNA'ya sıkıca bağlanan statik proteinlerdir.Prosedürü gösteren Stefan Iliç olacaktır. Bu yordamı başlatmak için, %0.01 Triton-X 100 içeren bir coplin kavanozuna yerleştirerek mikrodizi kaydırasını önceden ıslayın. Ve bir laboratuvar rotator üzerinde dönen, beş dakika için 125 rpm ekleyin.Pipet plastik bir kutu içine engelleme çözeltisi. Sonra coplin kavanozundan mikrodizi slayt kaldırın. Slaydın DNA olmayan tarafını ve kenarlarını sürmek için ince bir silme kullanın.Mikrodiziyi yavaşça plastik kutuya yerleştirin. Yavaş sallayarak bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, pbs% 0.01 Tween-20 ile slayt bir kez yıkayın.125 rpm'de bir laboratuar rotatöründe beş dakika lığına. Tween-20'yi çıkarın ve 125 rpm'de pbs'de %0,01 Triton-X 100 ile kaydırağı iki dakika boyunca 125 rpm'de durulayın. Ardından slaytı hızlıbir şekilde PBS içeren bir kopya kavanozuna aktarın.İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi PMB odasını monte edin. Slaytı belirlenen alana yerleştirin. Aşağı itmek ve solcırkullanın.Silikon contayı üzerine yerleştirin, PBM haznesinin alt kısmıyla iyi hizalandığından emin olun. Sonra odayı kapatın ve çapraz vidaları sıkın. Pipet conta her kuyuiçine protein bağlayıcı karışımı.Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yat. Başlamak için, pipet 0.05%Tween-20 PBS pbm odasına kısaca slayt yıkamak için. Bir vakum aspiratör kullanarak, DNA lekeleri dokunmamaya dikkat olmak odanın kuyularından çözelti kaldırın.Bunu tekrarlayın, slaytı kısaca PBS ile yıkayın. Ve DNA lekeleri dokunmamaya dikkat ederken odanın kuyularından çözelti kaldırmak için vakum kullanın. Sonra, Alexa 488 Ekle SBM odasının her bir kuyuya, Onun Antikor'u konjuge.30 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçka. Bundan sonra, kısaca her kuyuiçine PBS 0.05% Tween-20% birkaç damla ekleyerek PBM odası içinde slayt yıkayın. Ve vakum aspiratörü kullanarak çözeltiyi odanın kuyularından çıkartın, DNA noktalarına dokunmamaya dikkat edin.PBM odasını sökün ve kaydırağı çıkarın. Slaytları PBS'de %0,05'lik Tween-20'de iki kez durulayın ve her bir durulama üç dakika sürer. Daha sonra, slaytları PBS'de iki kez durulayın ve her biri üçer dakika boyunca durulayın.Ve bir keresinde üç dakika boyunca çift distile suda. Slaytları basınçlı hava ile kurulayın. Ve onları tarayıp hazır olana kadar koyu bir slayt kutusunda saklayın.Hazır olduğunuzda, 495 nanometre uyarma ve 19 nanometre emisyon ile çiptarartiçin bir mikrodizi tarayıcı kullanın. Ve ortanca floresan yoğunluğunu toplayın. Bu çalışmada pi iş başı primase profilleme klasik araçlar kullanarak gözlemlemek imkansız değilse de zor olanlar da dahil olmak üzere primase bağlama siteleri, harita için kullanılır.Daha da önemlisi, pi iş başı primase profilleme primase bağlama sitelerinin geleneksel anlayış revisiting sağlar. Özellikle pi iş başı primaz profilleme bilinen 5'GTC3'recognition dizilerine ek olarak bağlayıcı özellikleri ortaya çıkarır, bu da T7 DNA primazının fonksiyonel aktivitelerinde değişikliklere yol açar. Yani, dizileri iki grup tanımlanır.Yanlarda TG içeren güçlü bağlayıcı DNA dizileri ve yanlarda AG içeren zayıf bağlayıcı DNA dizileri. 5'GTC3'in dizileri eksik olan DNA şablonlarına primas bağlanmadı. TG zengin yanları gibi özel özellikler içeren primase DNA tanıma siteleri, 10 kata kadar primase DNA bağlama artırmak.Şaşırtıcı bir şekilde, yeni oluşan RNA'nın uzunluğunu da arttırırlar. Daha da önemlisi, yüksek iş yapma primaz profilleme bize gözlemlemek ve DNA şablonu dizisi ile ilgili olarak astar uzunluğu değişkenlik ölçmek için izin verir. Bu işlemi gerçekleştirirken yıkama adımları ince olmalıdır.Ve arabellekler DNA'ya primase kaydetmiş bileşenler içermelidir. Ayrıca beyhude bağlama olaylarının eşiği biyokimyasal olarak belirlenir. Bu nedenle mikrodizinin analizi yetersizdir.Yüzey plazma rezonansı ve jel kayması tahlilleri gibi yöntemler, DNA dizilerini seçmek için primazın bağlayıcı afinitesini belirleyebilir. Laboratuvarım, DNA polimeraz tarafından uzatılabilen üretken astarlar veren primase dizi belirleyicilerini tespit etmek için makine öğrenimi tahmin modellerini uygular. Büyük veri çağında, büyük verileri analiz etmek için istatistiksel yöntemlerin uygulanması, teknik kesinlikle daha iyi belirli DNA dizileri karakterize etmek ve primase aktivitesi için dizi tanıma bağlantı yardımcı olacaktır.Radyasyon ile çalışan herkes iyonlaştırıcı radyasyon kullanımı ile ilgili düzenlemeler ve tehlikeleri ayrıntılı bir anlayışa sahip olmalıdır. Eğitimden geçilmeli ve güvenlik ekipmanları ile çalışmalıdır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek bir molekül akışı germe tahlil uygulama boyunca DNA moleküllerinin taşıma eğitimi için

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

DNA Staining Method Based on Formazan Precipitation Induced by Blue Light Exposure

DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama

DNA staining methods are very important for biomedical research. We designed a simple method that allows DNA visualization to the naked eye by the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Rad51 tarafından aracılı DNA Strand Exchange tepki gerçek zamanlı gözlem

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...