Name: thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat
Uploaded: 2019-06-26T14:30:00
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Ces travaux ont été appuyés par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC; MOP-142288) à M.M. M.M. a été appuyé par une bourse salariale du Fonds de Recherche Québec Santé (FRQS), et A.R.B a été soutenu par une bourse de FRQS.

Les expériences décrites dans cet article ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux et ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Montréal.
1. Chirurgie de l'hémisection thoracique
<ol><li>Portez l'équipement de protection approprié (gants, masque et robe) pour maintenir un environnement aseptique pour la chirurgie. Nettoyez la zone chirurgicale avec des lingettes d'alcool, et placez des rideaux chi...

Une force majeure de la technique d'hémisection est la sélectivité et la reproductibilité de la lésion qui conduit à une variabilité réduite dans les phénotypes histologiques et comportementaux entre les animaux25. Afin d'assurer une lésion unilatérale au niveau spinal approprié, l'identification précise du segment vertébral approprié et de la ligne médiane de moelle épinière est critique. Comme il peut y avoir une tendance pour la moelle épinière à tourner dans la direction d...

Les dommages de moelle épinière (SCI) sont associés aux perturbations graves dans la fonction motrice, sensorielle, et autonome. Les modèles animaux expérimentaux de SCI sont des outils précieux pour comprendre les événements anatomiques et physiologiques impliqués dans la pathologie de SCI, pour étudier les mécanismes neuronaux dans la réparation et la récupération, et pour dépister l'efficacité et l'innocuité de la thérapeutique potentielle Interventions. Le rat est l'espèce la plus couramment utilisée dans la recherche SCI1. Les modèles de rat sont peu coûteux, faciles à reproduire, et une grande batterie de tests comportementaux sont disponibles pour évaluer les résultats fonctionnels2. Malgré quelques différences dans l'emplacement des voies, la moelle épinière du rat partage des fonctions sensorimotrices similaires globales avec les grands mammifères, y compris les primates3,4. Les rats partagent également des conséquences physiologiques et comportementales analogues à l'ICS qui se rapportent aux humains5. Les primates non humains et les grands modèles animaux peuvent fournir une approximation plus proche de l'homme SCI6 et sont essentiels pour prouver l'innocuité et l'efficacité du traitement avant l'expérimentation humaine, mais sont moins couramment utilisés en raison de l'éthique et le bien-être animal considérations, dépenses et exigences réglementaires7.
Les modèles de SCI de transection de rat sont exécutés par l'interruption ciblée de la moelle épinière avec une lésion sélective utilisant un couteau de dissection ou des ciseaux d'iridectomy après une laminectomy. Comparé à une transection complète, la transection partielle dans le rat a comme conséquence des dommages moins graves, le soin postopératoire plus facile d'animal, le rétablissement locomoteur spontané, et plus étroitement des modèles SCI chez l'homme qui est principalement incomplet avec l'épargnant partiel de tissu reliant la moelle épinière et les structures supraspinales8. Une hémisection unilatérale perturbe toutes les voies ascendantes et descendantes d'un seul côté, et produit des déficits locomoteurs quantifiables et hautement reproductibles, améliorant l'exploration des mécanismes biologiques sous-jacents. La conséquence fonctionnelle la plus importante de l'hémisection est une paralysie initiale de membre du même côté et au-dessous du niveau de la lésion avec le rétablissement spontané gradué de la fonction locomotrice sur plusieurs semaines9,10, 11 Ans, états-unis ( , 12. Le modèle d'hémisection est particulièrement utile pour étudier la plasticité neuronale des voies et circuits endommagés et résiduels liés à la récupération fonctionnelle9,11,12, 13,14,15,16,17,18. Plus précisément, l'hémisection effectuée au niveau thoracique, c'est-à-dire au-dessus des circuits spinaux qui contrôlent la locomotion de l'arrière-pays, est particulièrement utile pour étudier les changements dans le contrôle locomoteur. Comme une relation non linéaire existe entre la sévérité des lésions et la récupération locomotrice après SCI19, des tests comportementaux appropriés pour évaluer les résultats fonctionnels sont primordiaux dans les modèles expérimentaux.
Une batterie complète de tests comportementaux sont disponibles pour évaluer les aspects spécifiques de la récupération locomotrice fonctionnelle chez le rat2,20. Beaucoup de tests locomoteurs ne fournissent pas de mesures fiables tôt après SCI que les rats sont trop handicapés pour soutenir leur poids corporel. Une mesure de la performance locomotrice spontanée qui est sensible aux déficits tôt après une blessure, et ne nécessite pas de formation préopératoire ou d'équipement spécialisé, est bénéfique afin de surveiller la récupération locomotrice pour les points de temps appropriés dans lesquels compléter les tests comportementaux spécialisés. Le score d'évaluation en champ ouvert10de Martinez, initialement développé pour évaluer la performance locomotrice après l'IC cervicale chez le rat, est un score ordinal de 20 points évaluant la performance locomotrice globale pendant la locomotion spontanée au-dessus du sol dans un champ ouvert. La notation est effectuée séparément pour chaque membre à l'aide d'une rubrique qui évalue les paramètres spécifiques d'une gamme de mesures locomotrices, y compris le mouvement des membres articulaires, le soutien du poids, la position des chiffres, les capacités de pas, la coordination avant-membre et le membre postérieur, et la queue position. Le score d'évaluation est dérivé de l'échelle d'évaluation en champ ouvert de Basso, Beattie et Bresnahan (BBB) conçue pour évaluer les performances locomotrices après contusion thoracique21. Il est adapté pour évaluer avec précision et fiabilité à la fois la fonction locomotrice des membres antérieurs et des membres postérieurs, permet une évaluation indépendante des différents paramètres de notation qui ne sont pas adaptés à la notation hiérarchique du BBB, et fournit une récupération linéaire profil10. En outre, par rapport à la BBB, le score d'évaluation est sensible et fiable dans les modèles de blessures plus graves10,11,20,22. Le score d'évaluation a été utilisé pour évaluer l'affaiblissement locomoteur chez le rat suivant cervical10,12 et thoracique9 SCI seul et en combinaison avec des lésions cérébrales traumatiques23.
Nous présentons ici un protocole détaillé étape par étape pour effectuer une sCI d'hémisection thoracique au niveau vertébral de T8 dans le rat long-Evans femelle, et pour évaluer la récupération locomotrice de membre arrière dans le champ ouvert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1489px;" width="1489">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Baytril</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td style="width:294px;">11242</td>
			<td style="width:502px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Blunt dissection scissors</td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td>503669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Buprenorphine hydrochoride</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td style="width:294px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Camera lens</td>
			<td style="width:227px;">Pentax</td>
			<td>C31204TH</td>
			<td>12.5-75mm, f1.8, 2/3&#34; format, C-mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">CMOS video camera</td>
			<td style="width:227px;">Basler</td>
			<td>acA2000-165uc</td>
			<td>2/3&#34; format, 2048 x 1088 pixels, up to 165 fps, C-mount, USB3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Compressed oxygen gas</td>
			<td style="width:227px;">Praxair</td>
			<td style="width:294px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Cotton tipped applicators</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>108703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Delicate bone trimmers</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>16109-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Dissecting knife</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10055-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont fine forceps (#5)</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethicon Vicryl 4/0 Violet Braided FS-2&#160; suture (J392H)</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td style="width:294px;">111689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Feedback-controlled heating pad</td>
			<td style="width:227px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>55-7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Female Long-Evans rats</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:294px;">Strain code: 006</td>
			<td>225-250g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Gelfoam</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>102348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Curved hemostat forceps</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hot bead sterilizer</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Hydrogel</td>
			<td style="width:227px;">70-01-5022</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>118740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Lactated Ringer&#39;s solution</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>116373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Lidocaine (2%)</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>123684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Needle 30 ga</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>4799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Open-field area</td>
			<td style="width:227px;">Custom</td>
			<td style="width:294px;"></td>
			<td>Circular Plexiglas arena 96 cm diameter, 40 cm wall height</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Opthalmic ointment</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>110704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Personal computer&#160;</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td style="width:294px;"></td>
			<td>With USB3 connectivity to record video with the listed camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Physiological saline</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Proviodine</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>4568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rodent Liquid Diet</td>
			<td style="width:227px;">Bioserv</td>
			<td style="width:294px;">F1268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Scalpal blade #11</td>
			<td style="width:227px;">CDMV</td>
			<td>6671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Self-retaining retractor</td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td>14240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas iridectomy spring scissors</td>
			<td style="width:227px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">Veterinary Anesthesia Machine and isofluarane vaporizer</td>
			<td style="width:227px;">Dispomed</td>
			<td style="width:294px;">975-0510-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:468px;">VLC media player</td>
			<td style="width:227px;">VideoLAN</td>
			<td style="width:294px;"></td>
			<td>videolan.org/vlc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thoracic spinal cord hemisection surgery and open-field locomotor assessment in the rat

Les lésions de la moelle épinière (SCI) causent des perturbations dans la fonction motrice, sensorielle et autonome au-dessous du niveau de la lésion. Les modèles animaux expérimentaux sont des outils précieux pour comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans la récupération locomotrice après SCI et pour concevoir des thérapies pour les populations cliniques. Il existe plusieurs modèles expérimentaux de SCI, y compris la contusion, la compression et les blessures par transsection qui sont utilisés dans une grande variété d'espèces. Une hémisection implique la transection unilatérale de la moelle épinière et perturbe toutes les voies ascendantes et descendantes d'un seul côté. L'hémisection spinale produit une blessure fortement sélective et reproductible par rapport aux techniques de contusion ou de compression qui est utile pour étudier la plasticité neurale dans les voies épargnées et endommagées liées à la récupération fonctionnelle. Nous présentons un protocole étape par étape détaillé pour effectuer une hémisection thoracique au niveau vertébral de T8 dans le rat qui a comme conséquence une paralysie initiale du membre postérieur sur le côté de la lésion avec le rétablissement spontané gradué de la fonction locomotrice au-dessus de plusieurs Semaines. Nous fournissons également un protocole de notation locomoteur pour évaluer la récupération fonctionnelle dans le champ ouvert. L'évaluation locomotrice fournit un profil de récupération linéaire et peut être effectuée à la fois tôt et à plusieurs reprises après les blessures afin de filtrer avec précision les animaux pour les points de temps appropriés dans lesquels effectuer des tests comportementaux plus spécialisés. La technique d'hémisection présentée peut être facilement adaptée à d'autres modèles et espèces de transection, et l'évaluation locomotrice peut être utilisée dans une variété de SCI et d'autres modèles de blessures pour marquer la fonction locomotrice.

Des lésions reproductibles avec un degré élevé de cohérence peuvent être générées avec la technique d'hémisection. Pour évaluer et comparer des tailles de lésions entre les groupes expérimentaux, la zone maximale de la lésion en pourcentage de la section transversale totale de la moelle épinière peut être facilement calculée avec la coloration histologique des sections de moelle épinière. La figure 1 montre une lésion représentative de l'hémicorde gauche et une couche ...

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Thoracic Spinal Cord Hemisection Surgery and Open-Field Locomotor Assessment in the Rat

L'hémisection spinale thoracique de rat est un modèle valable et reproductible des dommages unilatéraux de moelle épinière pour étudier les mécanismes neurals de la récupération locomotrice et de l'efficacité de traitement. Cet article comprend un guide détaillé étape par étape pour effectuer la procédure d'hémisection et d'évaluer les performances locomotrices dans une arène de champ ouvert.

Chirurgie de l'hémisection de la moelle épinière thoracique et évaluation locomotrice à champ ouvert chez le rat

Spinal cord injury (SCI) causes disturbances in motor, sensory, and autonomic function below the level of the lesion. Experimental animal models are ...

L’hémisection spinale produit des déficits locomoteurs quantifiables et reproductibles idéaux qui peuvent être capturés avec l’échelle de la locomotive que nous avons développée. Le principal avantage de cette technique est la sélectivité et la reproductibilité de la lésion, ce qui conduit à une variabilité réduite des phénotypes comportementaux entre les animaux. Après avoir confirmé un manque de réponse à la pincement des pieds chez un rat adulte anesthésié, faire une incision de 2,5 centimètres dans la peau rasée au-dessus des vertèbres T-6 à T-10 et utiliser des ciseaux contondants pour rétracter la peau et la graisse superficielle.Utilisez des ciseaux de dissection contondants et un rétracteur auto-retenant pour séparer les muscles paravertébraux, en insérant sur l’aspect dorsale des vertèbres T-7 à T-9 et utilisez des forceps fins et des applicateurs à pointe cotonnière pour débrider et effacer tout tissu restant pour exposer les processus épineux et le lamina vertébral. Placez le taux sous un microscope stéréo et utilisez des taille-os délicats pour couper soigneusement les facettes bilatéralement sur les vertèbres T-7 et T-8. Utilisez un scalpel pour faire une coupe superficielle d’un millimètre dans le tissu conjonctif dorsal entre les laminaires vertébraux T-8 et T-9, en prenant soin de ne pas blesser le cordon sous-jacent et d’utiliser des taille-os pour enlever le processus épineux de la vertèbre T-8.Avec des forceps hémostatiques incurvés soigneusement serrés sur le processus épineux T-7, faites pivoter l’extrémité caudale de la laminae T-8 légèrement rostrally approximativement 20 degrés et insérez les taille-os sous le lamina T-8. Faire une coupe médiane s’étendant le long de la lamina, en continuant la laminectomie en répétant les coupures sur le côté gauche et droit de la médiale vertébrale lamina aux processus transversaux pour exposer la moelle épinière. Égoutter 100 microlitres de 2% de lidocaïne dans le canal rachidien exposé et utiliser des forceps fins et ciseaux iridectomy pour enlever le dura superposant le segment spinal T-8.Répétez l’administration de lidocaïne au cordon exposé et identifiez la ligne médiane du cordon par visualisation d’une ligne centrale créée entre les processus épineux s’étendant entre la vertèbre T-7 à T-9 exposée. À l’aide de forceps fins pour stabiliser la moelle épinière, utilisez un couteau dissecting pour hémisquer la moelle épinière de la ligne médiane vers un côté de l’animal, en prenant soin de ne pas couper à travers l’artère spinale antérieure sur le côté ventral. À l’aide de ciseaux iridectomy, couper soigneusement tous les tissus restants du côté de lésion de la moelle épinière pour s’assurer que le quadrant ventral-latéral est correctement transected et placer un stérile, environ six par deux millimètres éponge hémostatique trempée dans la cavité exposée au-dessus de la moelle épinière.Ensuite, utilisez des sutures 4-O polyglactine 910 pour fermer les couches musculaires et la peau autour du site d’incision et placer le rat dans un environnement chaud sous une lampe thermique avec surveillance jusqu’à une récupération complète. Au moment expérimental approprié pour les tests comportementaux, après que les rats ont été habitués à l’arène, commencer l’enregistrement vidéo et placer un rat au centre de l’arène, dans des conditions de faible lumière pour encourager l’activité locomotrice. Laissez le rat explorer pendant au moins quatre minutes, en déplaçant le rat vers le centre de l’arène quand il reste stationnaire pendant plus de 20 secondes pour promouvoir la locomotion.Ensuite, marquez les performances locomotrices de la session de test enregistrée. Pour les mouvements des membres articulaires, marquer les mouvements articulaires postérieurs pendant la locomotion spontanée séparément pour la cheville, le genou et la hanche, comme étant normaux, légers ou absents. Pour le soutien du poids, évaluez la capacité des muscles extenseurs de l’interurbe à se contracter et à soutenir le poids corporel chargé lorsque le membre est au sol pour le moment où le rat est stationnaire, ainsi que pendant la locomotion active.Pour la position numérique, évaluez la position des chiffres de l’arrière-corps pendant que le rat est stationnaire et pendant la locomotion. Remplissez le paramètre de marche seulement si le rat peut soutenir son poids corporel pendant le pas en adjugeant l’orientation du placement de la patte arrière au moment du contact initial et au décollage du sol en plus de la fluidité de la phase de balançoire pendant le pas. Remplissez le paramètre de coordination avant/postérie seulement si quatre étapes consécutives se produisent pendant l’essai et si les membres peuvent soutenir activement le poids corporel.Évaluez la position de la queue pendant la locomotion comme étant à la hausse ou à la baisse. Ajoutez ensuite les scores individuels de chaque paramètre pour fournir un total pour chaque limite arrière à un maximum de 20 points. Pour évaluer et comparer des tailles de lésion entre les groupes expérimentaux, la zone maximale de la lésion en pourcentage de la section transversale totale de la moelle épinière peut être facilement calculée avec la coloration histologique des sections de moelle épinière.Par exemple, cette lésion représentative de l’hémicord gauche avec une superposition de la proportion de zone maximale de lésion partagée entre les rats a démontré la taille moyenne de lésion d’approximativement 47% de la zone transversale de corde. Ces changements représentatifs dans la performance locomotrice dans l’état intact au cours des cinq premières semaines après l’hémisection gauche démontrent une affaiblissement significative de locomotion dans l’arrière gauche de l’animal pendant les trois premières semaines après la chirurgie. Une amélioration du niveau de locomotion est observée dans l’arrière-plan droit par deux semaines après la procédure.Les choses les plus importantes à retenir sont qu’une identification précise de la ligne médiane spinale pour l’hémisection et le soin et la surveillance appropriés d’animal post-chirurgical sont essentiels pour un protocole réussi. Cette évaluation comportementale fournit un protocole idéal pour dépister les indices parétrecorviaux supérieurs pour compléter avec des tests spécialisés pour répondre à une question spécifique d’intérêt sur la récupération locomotrice.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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