Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch Project 1016879 und Maryland Agricultural Experiment Station via MAES Grant No. 2956952 unterstützt.

1. Vorbereitung der Dosierungskurve für eine effektive Mutagenese
<ol><li>100 Samen mit dem Genotyp des Interesses in sechs 250 ml Glaskolben (100 in jedem Kolben) mit 50 ml destilliertem Wasser einweichen. Bei 100 Umdrehungen bei 8 h bei Raumtemperatur (RT) für die Imbibition durch die Samen schütteln.</li>
	<li>In einer Dunstabzugshaube 50 ml mit 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% und 1,2% (w/v) Ethylmethansulfonat (EMS) Lösung durch Auflösen von 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 und 0,498 ml EMS in destilliertem Wasser zubereiten...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING ist ein sehr wertvolles Reverse-Genetik-Tool für die Genvalidierung, insbesondere für kleine Körner, bei denen transformationsbasierte Ansätze gravierende Engpässe haben11. Die Entwicklung einer mutagenisierten Population mit einer hohen Mutationshäufigkeit ist einer der entscheidenden Schritte bei der Durchführung funktioneller Genomstudien. Der wichtigste Schritt bei der Entwicklung einer robusten TILLING-Population ist die Bestimmung der optimalen Konzentration von EMS. Die Über...

Punktmutationen in Genomen können vielen nützlichen Zwecken für Forscher dienen. Je nach Art und Standort können diese Mutationen verwendet werden, um Genen oder sogar unterschiedlichen Bereichen von Proteinen von Interesse Funktionen zuzuweisen. Andererseits können als Quelle neuartiger genetischer Variationen nützliche Mutationen für gewünschte Merkmale ausgewählt werden, indem Phänotypisierungssiebe verwendet werden, die weiter bei der Verbesserung der Ernte verwendet werden. TILLING ist ein leistungsstarkes Reverse-Genetik-Tool, das chemische Mutagenese und den Nachweis von Sequenzvariationen im Zielgen umfasst. Zuerst entwickelt in Arabidopsis1 und Drosophilia melanogaster2, TILLING Populationen wurden entwickelt und in vielen kleinen Getreidekulturen wie Hexaploid Brot Weizen (Triticum aestivum)3verwendet Gerste (Hordeum vulgare)4, tetraploider Hartweizen (T. dicoccoides durum)5, diploider Weizen (T. monococcum)6 und der "D" Genom Vorläufer von Weizen Aegilops tauschii7 . Diese Ressourcen wurden verwendet, um die Rolle von Genen bei der Regulierung der abiotischen und biotischen Stresstoleranz8zu validieren, die Blütezeit9zu regulieren und ernährungsphysiologisch überlegene Pflanzensorten zu entwickeln5.
TILLING, zusammen mit der Verwendung von alkyliernden mutagenen Erbgutverändern wie Ethylmetschenulfonat (EMS), Natriumazid, N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU) und Methylmethansulfonat (MMS), hat aus mehreren Gründen Vorteile gegenüber anderen Reverse-Genetik-Werkzeugen. Erstens kann die Mutagenese an praktisch jeder Art oder Sorte der Pflanze10 durchgeführt werden und ist unabhängig vom Transformationsengpass, der bei Kleinkörnern besonders anspruchsvoll ist11. Zweitens können neben der Erzeugung von Knockout-Mutationen, die durch andere Genvalidierungsansätze erreicht werden können, eine Reihe von Missense- und Spleißmutationen induziert werden, die Funktionen einzelner Domänen der von Interesse interessierten Proteine erkennen können12. Darüber hinaus erzeugt TILLING eine unsterbliche Sammlung von Mutationen im gesamten Genom; So kann eine einzige Population für die funktionelle Validierung mehrerer Gene verwendet werden. Im Gegensatz dazu erzeugen andere Reverse-Genetik-Tools Ressourcen, die nur für das in Studie13unterfessliche Gen spezifisch sind. Nützliche Mutationen, die durch TILLING identifiziert werden, können zu Zuchtzwecken eingesetzt werden und unterliegen nicht der Regulierung, im Gegensatz zur Genbearbeitung, deren nicht-transgene Klassifizierung in vielen Ländern noch unsicher ist. Dies wird besonders relevant für kleine Körner, die international gehandelt werden14.
TILLING ist eine einfache und effiziente Genvalidierungsstrategie und erfordert die Entwicklung von mutagenisierten Populationen zur Untersuchung von Genen von Interesse. Die Entwicklung einer effektiven mutagenisierten Population ist der Schlüssel zur Bestimmung der Effizienz einer TILLING-basierten Genvalidierungsstudie. Eine TILLING-Population mit einer niedrigen Gesamtmutationshäufigkeit weist darauf hin, dass eine unpraktisch große Population auf gewünschte Mutationen untersucht werden muss, während eine hohe Mutagenkonzentration zu einer hohen Sterblichkeit in der Bevölkerung und einer unzureichenden Anzahl von mutagenisierte Individuen. Sobald eine gute Population entwickelt ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, Mutationen in den Genen von Interesse zu erkennen, und die Wahl der Plattform hängt von der experimentellen Größe und Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Ganze Genomsequenzierung und Exomsequenzierung wurde verwendet, um alle Mutationen in TILLING-Populationen in Pflanzen mit kleinen Genomen15,16zu charakterisieren. Die Exome-Sequenzierung von zwei TILLING-Populationen wurde in Brot und Hartweizen durchgeführt und steht der Öffentlichkeit zur Verfügung, um wünschenswerte Mutationen zu identifizieren und mutierte Interessenslinien zu ordnen17. Es ist eine große öffentliche Ressource in Bezug auf die Verfügbarkeit von wünschenswerten Mutationen; In Genvalidierungsstudien sollte die Wildtyplinie jedoch das Kandidatengen besitzen, das von Interesse ist. Leider ist es immer noch kostenprohibitiv, das Exom der gesamten TILLING-Population für die umgekehrte genetische Validierung einiger Kandidatengene in einem anderen Hintergrund zu sequenzieren. Amplicon-Sequenzierung und Cel-1-basierte Assays wurden verwendet, um Mutationen in zielgerichteten Populationen im Weizen zu erkennen, und Cel-1-Assays sind einfacher, erfordern keine Computerkenntnisse und eignen sich besonders für die Validierung einer kleinen Anzahl von Genen mit Laborausrüstung6,18.
In diesem Artikel werden Methoden zur Entwicklung einer guten TILLING-Population beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der Dosierungskurve, der Mutagenese und der Erhaltung der mutierten Population und des Screenings der mutierten Population mit dem PCR-basierten Cel-1-Assay. . Dieses Protokoll wurde bereits erfolgreich bei der Entwicklung und Nutzung von mutagenisierten Populationen von Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, Gerste, Aegilops tauchii7und Andere. Enthalten sind explizite Details dieser Methoden zusammen mit nützlichen Tipps, die Forschern helfen, TILLING Populationen zu entwickeln, mit EMS als Mutagen in jeder kleinen Getreidepflanze ihrer Wahl.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) ist ein leistungsstarkes Reverse-Genetik-Tool, das chemische Mutagenese und den Nachweis von Sequenzvariationen in Zielgenen umfasst. TILLING ist ein sehr wertvolles funktionelles Genomik-Tool für die Genvalidierung, insbesondere in kleinen Körnern, bei denen transformationsbasierte Ansätze ernsthafte Grenzen haben. Die Entwicklung einer robusten mutagenisierten Population ist der Schlüssel zur Bestimmung der Effizienz einer TILLING-basierten Genvalidierungsstudie. Eine TILLING-Population mit einer niedrigen Gesamtmutationshäufigkeit weist darauf hin, dass eine unpraktisch große Population untersucht werden muss, um gewünschte Mutationen zu finden, während eine hohe Mutagenkonzentration zu einer hohen Sterblichkeit in der Bevölkerung führt, was zu einer unzureichenden Anzahl der mutagenisierten Personen. Sobald eine effektive Population entwickelt ist, gibt es mehrere Möglichkeiten, Mutationen in einem Gen von Interesse zu erkennen, und die Wahl der Plattform hängt von der experimentellen Größe und Verfügbarkeit von Ressourcen ab. Der Cel-1-Assay- und Agarose-Gel-basierte Ansatz zur mutierten Identifizierung ist bequem, reproduzierbar und eine weniger ressourcenintensive Plattform. Es ist insofern von Vorteil, als es einfach ist, ohne Rechenkenntnisse, und es eignet sich besonders für die Validierung einer kleinen Anzahl von Genen mit grundlegenden Laborgeräten. In diesem Artikel werden die Methoden zur Entwicklung einer guten TILLING-Population beschrieben, einschließlich der Vorbereitung der Dosierungskurve, der Mutagenese und der Erhaltung der mutierten Population und des Screenings der mutierten Population mit dem PCR-basierten Cel-1-Assay. .

Abbildung 2 zeigt die Dosierungskurve von Hexaploid Brot WeizenSorte Jagger, diploid Weizen Triticum monococcum6, und ein Genom Spender von Weizen Aegilops tauschii7. Die EMS-Dosen für die gewünschten 50% Überlebensraten betrugen etwa 0,25%, 0,6% bzw. 0,7% für T. monococcum, Ae. tauschiiund T. aestivum. Die höhere EMS-Toleranz von Hexaploid-Weizen ist auf seine G...

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Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Described ist ein Protokoll zur Entwicklung einer Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Population in Kleinkornkulturen mit Verwendung von Ethylmethansulfonat (EMS) als Mutagen. Ebenfalls zur Verfügung gestellt wird ein Protokoll zur Mutationsdetektion mit dem Cel-1-Assay.

Entwicklung von Targeting Induzierte lokale Läsionen IN Genomen (TILLING) Populationen in Kleinkornkulturen durch Ethylmethansulfonat-Mutagenese

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung robuster TILLING-Populationen mit hoher Mutationshäufigkeit durch EMS-Mutagenese in Kleingetreidekulturen. TILLING Populationen können für die funktionelle Genomik sowie für die Entdeckung genetischer Weltraumgene in kleinen Getreidepflanzen verwendet werden. Die TILLING-Populationen, die mit dieser Technik entwickelt wurden, weisen hohe Mutationsfrequenzen auf, und dieses Protokoll kann auf jeden Genotyp angewendet werden.Die Cel-1-Assay-basierte Mutationsdetektion kann mit grundlegenden Laborgeräten durchgeführt werden. Der wichtigste Schritt ist die Bestimmung der optimalen EMS-Konzentration. Daher sollte eine EMS-Dosierungskurve speziell für die individuelle Population erstellt werden.Zunächst 100 Samen mit dem Genotyp des Interesses in sechs 250-Milliliter-Glaskolben einweichen, die 50 Milliliter destilliertes Wasser enthalten. Bei 100 Umdrehungen pro Minute acht Stunden bei Raumtemperatur für imbibition schütteln. Dann, in einer Dunstabzugshaube, 50 Milliliter EMS-Lösungen in fünf verschiedenen Konzentrationen durch Mischen von EMS-Flüssigkeit und destilliertem Wasser vorbereiten.Nach der Imbibition dekantiert das Wasser aus fünf Kolben. Fügen Sie 50 Milliliter EMS-Lösung in jede der fünf Kolben mit imprägnierten Samen. Schütteln Sie die Kolben für 16 Stunden bei 75 U/min und Raumtemperatur.Dekantieren Sie nun die EMS-Lösung in eine leere Abfallflasche und gießen Sie die behandelten Samen auf Käsetücher, die auf eine leere Abfallflasche gelegt werden, um sie für jede Behandlung separat zu sammeln. Verwenden Sie zusätzliches Wasser, um das Gießen der Samen zu helfen. Sprühen Sie auch mehrere Milliliter EMS-Inaktivierungslösung auf die Wand von kontaminierten Kolben.Und tauchen Sie gebrauchte Pipettenspitzen für 24 Stunden in die Lösung ein. Inaktiv die verwendete EMS-Lösung durch Hinzufügen eines Volumens von EMS-Inaktivierender Lösung für 24 Stunden zu behandeln. Mit einer Twist-Krawatte die EMS-behandelten Samen in das Käsetuch stecken und zwei Stunden unter fließendem Leitungswasser waschen.Nach dem Waschen jedes Saatgut einzeln in Wurzeltrainer mit Blumenerde transplantieren. Wachsen Sie Pflanzen bei 20 bis 25 Grad Celsius für eine 16-stündige Lichtperiode. Überprüfen Sie nach 15 Tagen Transplantation die Pflanzen und zählen Sie die Anzahl der Samen, die nicht gekeimt haben.Aufzeichnung von Daten über das Überleben von Pflanzen. Wenn die Überlebensrate nicht innerhalb von 40 bis 60% liegt, führen Sie eine zweite Runde der Dosierungsoptimierung mit einer modifizierten Konzentration durch, bis sie die gewünschte Letalitätsrate von 40 bis 60% nach dem Mutagenese-Experiment erreicht hat, sammeln Sie das Blattgewebe von M2-Pflanzen in einer 96-Well-Gewebe-Sammelbox. Gewebe wird aus M2-Pflanzen gesammelt, die aus selbst gezüchteten M1-Pflanzen angebaut wurden.Aus jeder M1-Anlage wird eine M2-Anlage gezeigt. Extrahieren Sie DNA mit einem Pflanzlichen DNA-Extraktionskit mit einem DNA-Reinigungssystem nach den Empfehlungen des Herstellers. Dann laden Sie zwei Mikroliter des DNA-Extrakts in LV-Platten mit 16 Schlitzen.Quantifizieren Sie die DNA mit einem Spektralphotometer bei Wellenlängen von 260 und 280 Nanometern. Verdünnen Sie die DNA-Konzentration auf 25 Nanogramm pro Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser. Erstellen Sie viermal DNA-Pools von 200 Mikrolitern, indem Sie die DNA aus jedem Brunnen in den vier 96 Brunnenblöcken zu einer Poolplatte kombinieren und dabei die Zeilen- und Spaltenidentität jeder Probe beibehalten.Als nächstes bereiten Sie eine PCR-Master-Mischröhre für genspezifische Primer vor, indem Sie in jede Röhre PCR-Puffer, Vorwärts- und Rückwärtsprimer und DNA-Polymerase gemäß dem Manuskript hinzufügen. Aliquot die Master-Mix in die Brunnen einer 96 gut PCR Platte. Fügen Sie dann die gepoolte DNA-Vorlage hinzu.Laden Sie die PCR-Röhren in einen thermischen Cycler, und verwenden Sie ein Touchdown-Profil, um die PCR-Reaktion auf dem Thermischen Cycler auszuführen. Um Heteroduplexe zwischen nicht übereinstimmenden DNAs zu erzeugen, inkubieren Sie PCR-Produkte im thermischen Cycler in einem anderen Programm. Dann fügen Sie 2,5 Mikroliter hausgemachte Cel-1 Endonuklease zu jedem der heteroduplexierten PCR-Produkte hinzu.45 Minuten bei 45 Grad Celsius inkubieren. Danach beenden Sie die Cel-1-Reaktion, indem Sie 2,5 Mikroliter 0,5 Mol EDTA bei pH 8 hinzufügen. 30,5 Mikroliter jedes mit Cel-1 behandelten Produktes mit fünf MikroliterFarbstoff auf ein 3%Agarose-Gel aufladen und zweieinhalb Stunden lang bei 100 Volt laufen.Um mutierte Pools zu dekonvolute, bestimmen Sie die Zygosität von Mutanten durch zwei PCR-Reaktionen für einzelne M2-DNA, in denen die erste Reaktion enthält 2,5 Mikroliter M2-DNA und 2,5 Mikroliter wildTyp-DNA und die zweite Reaktion enthält nur fünf Mikroliter M2-DNA. Dieses Protokoll zeigt die EMS-Mutagenisierung von Kleingetreidekulturen und die Charakterisierung von Mutanten. Die Dosierungskurve zeigt optimale EMS-Dosen für die gewünschten 50%-Überlebensraten für drei verschiedene Weizenarten an.Das Vorhandensein leicht identifizierbarer Phänotypen in der M2-Population bestätigt die Wirksamkeit der Mutagenese in kleinen Getreidepopulationen. Hier sind vier Beispiele für die mutierten Phänotypen in M2 TILLING Populationen, ein Albino-Mutant in einer Gersten-M2-Population, ein Chlorina-Mutant in einer Gersten-M2-Population, ein bunt gefärbter Mutant mit rosa Verfärbung in einer Aegiltauschi M2-Population und ein bodenniedriger Mutant in einer Triticum monococcum M2-Population. Eine mutierte Identifizierung mit Cel-1 auf Agarose-Gel-Plattformen zeigt einen potenziellen Mutantenpool, der aus 12 mutierten Pools durch einzigartige Spaltenbänder identifiziert wurde.Die Dekonvolution von mutierten Pools bestimmte die Zygosität der Mutation und half, die Mutation bis zu einzelnen Proben zu verfolgen. Der A4-Pool hatte heterozygote Mutationen, die durch Spaltenbänder in Box 4 und Box 4 Wild-Typ-DNA-Proben angezeigt wurden. Der H5-Pool enthielt homozygote Mutationen, da einzigartige Spaltenbänder nur in Box 5 H5 Wildtyp-DNA-Proben vorhanden waren.Der wichtigste Schritt besteht darin, die optimale Konzentration von EMS zu bestimmen, um eine Tödliche itätsrate von 40 bis 60 % zu erreichen. Sobald eine TILLING-Population mit einer hohen Mutationshäufigkeit entwickelt wurde, kann sie zur funktionellen Charakterisierung jedes Gens von Interesse verwendet werden. Darüber hinaus kann die Population eine Quelle nützlicher genetischer Variationen zur Verbesserung der Ernte sein.TILLING wurde ausgiebig für funktionelle Genomstudien in Modell- und Kulturpflanzen eingesetzt. Der Bereich der erhaltenen Mutationen kann Fehl-, Knockouts, stille oder sogar falsch ergänzte Formen sein. EMS ist ein Mutagen.Verwenden Sie daher beim Umgang mit dem EMS geeignete persönliche Schutzausrüstung. Dekontaminieren Sie Restlösungen und verwendete Pipettenspitzen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em&gt; In Vivo</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrolliertes kortikales Wirkungsmodell der Maushirnverletzung mit therapeutischer Transplantation von humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuralzellen

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...