Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי של משרד החקלאות של מזון וחקלאות, הצוהר פרויקט 1016879 ו מרילנד תחנת הניסוי החקלאי דרך MAES גרנט מס ' 2956952.

1. הכנת עקומת מינון למוטזיס אפקטיבי
<ol><li>להשרות 100 זרעים עם גנוטיפ של הריבית 6 250 mL מבחנות זכוכית (100 בכל בקבוקון) המכיל 50 mL של מים מזוקקים. נענעי ב 100 סל ד עבור 8 h בטמפרטורת החדר (RT) לקבלת שתיית הזרעים.</li>
	<li>בתוך משקה, להכין 50 mL של 0.4%, 0.6%, 0.8%, 1.0%, ו 1.2% (w/v) אתיל מתיאנסולולאט (EMS) פתרון על ידי המסת 0.167, 0.24...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

לעיבוד קרקע הוא כלי גנטיקה הפוכה בעל ערך רב עבור אימות גנים, במיוחד עבור דגנים קטנים שבהם גישות מבוססות שינוי יש צווארי בקבוק רציני11. פיתוח אוכלוסיה מוטדית עם תדר מוטציה גבוהה הוא אחד השלבים הקריטיים בניהול לימודי גנומיקה תפקודית. הצעד החשוב ביותר בפיתוח אוכלוסיית לעיבוד קרק...

מוטציות נקודה גנום יכול לשרת מטרות שימושיות רבות עבור חוקרים. בהתאם הטבע והמיקום שלהם, מוטציות אלה ניתן להשתמש כדי להקצות פונקציות לגנים או תחומים שונים של חלבונים של הריבית. מצד שני, כמקור של וריאציה גנטית הרומן, מוטציות שימושיות ניתן לבחור תכונות הרצוי באמצעות מסכי פנוטיפים ובשימוש נוסף שיפור ביבול. לעיבוד קרקע הוא כלי הגנטיקה הפוכה רבת עוצמה הכוללת מוטזיס כימי ואיתור וריאציה של רצף בגן היעד. פותח לראשונה ב arabidopsis1 ו droסופיזם מלאנוסטר2, אוכלוסיות לעיבוד לקרקע פותחו ומנוצל בגידולי תבואה קטנים רבים כגון חיטה של לחם הקסאפואיד (triticum חיטת)3, שעורה ( הורדאוםוולגאר)4, מחיטה הטטרדואיד (t. חיטת דורום)5, חיטה דידואיד (t. monococcum)6 ו-"D" הגנום מחולל חיטה של אייליאופ . משאבים אלה שימשו כדי לאמת את התפקידים של גנים בוויסות העמידות הביוטית וביוטיים ללחץ8, ויסות הפריחה זמן9, ופיתוח זנים היבול מעולה מבחינה תזונתית5.
לעיבוד קרקע, יחד עם השימוש בסוכני מוטאריים אלקיגונים כגון אתיל מתיונין (EMS), נתרן azide, N-מתיל-N-ניטרוסוראה (MNU), ו מתיל מתיונין (MMS), יש יתרונות על פני כלים אחרים גנטיקה הפוכה מכמה סיבות. ראשית, ניתן לנהל מוטגנזה על כל מין או מגוון של צמחים10 והוא בלתי תלוי בצוואר המרה, שהוא מאתגר במיוחד במקרה של גרגרים קטנים11. שנית, בנוסף ליצירת מוטציות הסתרה שניתן להשיג על ידי גישות אחרות אימות גנים, מגוון של מוטציות מוטעית ושחבור יכול להיגרם, אשר יכול להבחין פונקציות של תחומים בודדים של חלבונים של ריבית12. יתר על כן, לעיבוד קרקע מייצרת אוסף בן אלמוות של מוטציות ברחבי הגנום; לפיכך, ניתן להשתמש באוכלוסיה בודדת לאימות פונקציונלי של גנים מרובים. לעומת זאת, כלים אחרים גנטיקה הפוכה ליצור משאבים ספציפיים רק הגן תחת לימוד13. מוטציות שימושיות שזוהו באמצעות לעיבוד קרקע ניתן לפרוס למטרות רבייה אינם כפופים רגולציה, בניגוד לעריכת גנים, שסיווג לא הטרנסגניים עדיין לא בטוח במדינות רבות. הדבר הופך להיות רלוונטי במיוחד לגרגרים קטנים הנסחרים ברחבי העולם14.
לעיבוד קרקע היא אסטרטגיה פשוטה ויעילה לאימות גנים ודורשת אוכלוסיות מוטשות להתפתח לחקירת גנים מעניינים. פיתוח אוכלוסיה מוטבית יעילה היא המפתח לקביעת היעילות של מחקר ואימות גנים מבוססי לעיבוד קרקע. אוכלוסיית לעיבוד קרקע עם תדר נמוך של מוטציה כוללת מצביעה על כך שאוכלוסיה גדולה מאוד צריכה להיות מוקרן למוטציות הרצויות, בעוד שריכוז מוטאני גבוה מוביל לתמותה גבוהה באוכלוסיה ולמספר לא מספיק של אנשים מוטניים. לאחר התפתחות האוכלוסייה הטובה, קיימות מספר דרכים לזיהוי מוטציות בגנים המעניינים, ובחירת הפלטפורמה תלויה בקנה המידה הניסיוני ובזמינות המשאבים. רצף הגנום כולו רצף exome שימשו כדי לאפיין את כל מוטציות באוכלוסיות לעיבוד הצמחים עם קטן גנום15,16. רצף exome של שתי אוכלוסיות לעיבוד קרקע בוצעה בלחם וחיטה דורום זמין לציבור לזיהוי מוטציות רצויות והזמנת קווי מוטציה של עניין17. זהו משאב ציבורי גדול במונחים של זמינות של מוטציות רצויות; עם זאת, בלימודי האימות הגנטי, קו הטיפוס הפראי צריך להחזיק את גן המועמדים המעניין. למרבה הצער, זה עדיין עלות-אוסרני לרצף את האוכלוסייה של כל אוכלוסיית לעיבוד האוכלוסין כולו עבור הפוך גנטיקה מבוססי אימות של כמה גנים מועמד ברקע אחר. Amplicon רצף ו-Cel-1 מבוססי בחני שימשו בזיהוי מוטציות באוכלוסיות ממוקדות חיטה, ו Cel-1 בחני הם פשוט, לא דורש ידע מחשבתי, והם מתאימים במיוחד לאימות של מספר קטן של גנים עם בסיסי ציוד מעבדה6,18.
במאמר הנוכחי, מתוארים שיטות להתפתחות של אוכלוסיית לעיבוד טוב, כולל הכנת עקומת המינון, מוטגנזה ותחזוקה של אוכלוסיית המוטציות, והקרנת אוכלוסיית המוטציות באמצעות השיטה המבוססת על ה-PCR-1 . פרוטוקול זה כבר יושם בהצלחה בפיתוח וניצול אוכלוסיות מוטשות של triticum חיטת, triticum מונובהצטיינות6, שעורה, אגינה tauchii7, ומספר אחרים. כלולים פרטים מפורשת של שיטות אלה יחד עם טיפים שימושיים שיסייעו לחוקרים לפתח אוכלוסיות לעיבוד קרקע, באמצעות EMS כמוטגן בכל צמח דגן קטן של בחירה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

פילוח המושרה נגעים מקומיים Genomes (לעיבוד קרקע) הוא כלי הגנטיקה הפוכה רבת עוצמה הכוללת מוטזיס כימי וגילוי של וריאציה רצף בגנים היעד. לעיבוד קרקע הוא כלי גנומיקה פונקציונלי רב ערך עבור אימות גנים, במיוחד בגרגרים קטנים בהם גישות מבוססות שינוי להחזיק מגבלות חמורות. פיתוח אוכלוסיית מוטייציה חזקה הוא המפתח לקביעת היעילות של מחקר ואימות גנים מבוססי לעיבוד קרקע. אוכלוסיית לעיבוד קרקע עם תדר נמוך של מוטציה כוללת מצביעה על כך שאוכלוסיה גדולה מאוד צריכה להיות מוקרן כדי למצוא מוטציות רצויות, בעוד שריכוז מוטפן גבוה מוביל לתמותה גבוהה באוכלוסייה, המובילה ל ספר אנשים מוטניים. לאחר שפותחה אוכלוסייה יעילה, קיימות מספר דרכים לזיהוי מוטציות בגנים של עניין, והבחירה בפלטפורמה תלויה בקנה המידה הניסיוני ובזמינות המשאבים. שיטת Cel-1 וגישה מבוססת ג'ל לזיהוי מוטציה היא נוחה, מנויית ופלטפורמה פחות אינטנסיבית למשאבים. זה יתרון בכך שהוא פשוט, שאינו דורש ידע מעמיק, והוא מתאים במיוחד לאימות של מספר קטן של גנים עם ציוד מעבדה בסיסי. במאמר הנוכחי, מתוארים השיטות לפיתוח של אוכלוסיית לעיבוד טוב, כולל הכנת עקומת המינון, מוטגנזה ותחזוקה של אוכלוסיית המוטציות, והקרנת אוכלוסיית המוטציות באמצעות הטיפול המבוסס על ה-PCR-1 .

איור 2 מראה את עקומת המינון של לחם הקסואיד לזנים חיטה ג ' וליד, דיפלואידי חיטה triticum מmonococcum6, ותורם הגנום של החיטה אייילאופים tauschii7. מינונים EMS עבור הרצוי 50% שיעורי ההישרדות היו כ 0.25%, 0.6% ו 0.7% עבור T. monococcum, Ae. tauschii, ו- <...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

המתואר הוא פרוטוקול לפיתוח נגעים מקומיים המושרה הנגרמת בידי האוכלוסייה Genomes (לעיבוד קרקע) בגידולי תבואה קטנים עם שימוש אתיל מתיונין (EMS) כמו מוטגן. כמו כן, מסופק הוא פרוטוקול לגילוי מוטציה באמצעות שיטת Cel-1.

פיתוח מיקוד המושרה נגעים מקומיים בשנת Genomes (לעיבוד קרקע) אוכלוסיות בגידולים גרעינים קטנים על ידי אתיל מתיונין מוטאנזיס

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

פרוטוקול זה מפרט את הפיתוח של אוכלוסיות TILLING חזקות עם תדירות מוטציה גבוהה על ידי MUTAGENESIS EMS בגידולי תבואה קטנים. אוכלוסיות TILLING יכולות לשמש לגנומיקה תפקודית, כמו גם לגילוי גנים של חלל גנטי קדימה בגידולי תבואה קטנים. לאוכלוסיות TILLING שפותחו באמצעות טכניקה זו יש תדרי מוטציה גבוהים, ופרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל גנוטיפ.זיהוי מוטציה מבוססת בדיקה Cel-1 יכול להתבצע באמצעות ציוד מעבדה בסיסי. הצעד החשוב ביותר הוא לקבוע את הריכוז ה-EMS האופטימלי. לכן, עקומת מינון EMS צריך להתבצע במיוחד עבור האוכלוסייה הבודדת.כדי להתחיל, להשרות 100 זרעים עם גנוטיפ של עניין בכל אחד שישה 250 בקבוקי זכוכית מיליליטר, המכיל 50 מיליליטר של מים מזוקקים. יש לנער ב-100 סל"ד במשך שמונה שעות בטמפרטורת החדר לצורך אימביציה. לאחר מכן, במכסה המנוע אדים, להכין 50 מיליליטר של פתרונות EMS של חמישה ריכוזים שונים על ידי ערבוב נוזל EMS ומים מזוקקים.לאחר ההתגלות, מפענחים את המים מתוך חמישה בקבוקונים. הוסף 50 מיליליטר של פתרון EMS בכל אחד מחמשת הבקבוקים המכילים זרעים בלתי מומרים. לנער את flasks במשך 16 שעות ב 75 סל"ד וטמפרטורת החדר.עכשיו, decant פתרון EMS לתוך בקבוק פסולת ריקה ויוצקים את הזרעים המטופלים על cheesecloth להציב על בקבוק פסולת ריק לאסוף בנפרד עבור כל טיפול. השתמש במים נוספים כדי לעזור לשפוך את הזרעים. כמו כן, לרסס כמה מיליליטר של EMS השבתת פתרון על הקיר של בקבוקונים מזוהמים.ולטבול טיפים פיפטה משומשים בתסרון במשך 24 שעות. לא פעיל פתרון EMS בשימוש על ידי הוספת אמצעי אחסון אחד של EMS השבתת פתרון לטיפול במשך 24 שעות. באמצעות עניבת טוויסט, להחזיק את הזרעים שטופלו EMS בתוך מטלית הגבינה ולשטוף תחת מי ברז זורמים במשך שעתיים.לאחר הכביסה, להשתיל כל זרע בנפרד לתוך מאמני שורש המכיל אדמה השתילה. לגדל צמחים ב 20 עד 25 מעלות צלזיוס לתקופת אור של 16 שעות. לאחר 15 ימים של השתלה, לבדוק את הצמחים ולספר את מספר הזרעים שלא הצליח לנבוט.נתוני שיא של הישרדות צמחים. אם שיעור ההישרדות הוא לא בתוך 40 כדי 60%לנהל סיבוב שני של אופטימיזציה המינון עם ריכוז שונה עד להשגת שיעור הקטלניות הרצוי של 40 עד 60% לאחר הניסוי mutagenesis, לאסוף את רקמת העלה של צמחים M2 בתיבה 96 גם איסוף רקמות. רקמה נאספת מצמחי M2 אשר גדלו מצמחים M1 עצמית.צמח M2 אחד מוצג מכל צמח M1. לחלץ DNA באמצעות ערכת מיצוי DNA צמח עם מערכת טיהור DNA בעקבות המלצות היצרן. לאחר מכן, לטעון שני microliters של תמצית ה-DNA לתוך לוחות LV עם 16 חריצים.לכמת דנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר באורכי גל של 260 ו-280 ננומטר. מדללים את ריכוז הדנ"א ל-25 ננוגרם למיקרוליטר עם מים נטולי גרעין. צור ארבע פעמים מאגרי DNA של 200 microliters על ידי שילוב ה-DNA מכל באר בארבעה 96 בלוקים היטב לתוך צלחת הבריכה תוך שמירה על זהות השורה והעמודה של כל מדגם.לאחר מכן, הכינו צינור ערבוב ראשי של PCR עבור פריימרים ספציפיים לגנים על ידי הוספה לכל מאגר PCR צינור, פריימרים קדימה ואחוריים, ופולימראז DNA על פי כתב היד. Aliquot את התערובת הראשית לתוך בארות של צלחת PCR 96 היטב. לאחר מכן, הוסף את תבנית הדנ"א המפולגת.טען את צינורות PCR לתוך מחזור תרמי, ולהשתמש בפרופיל טאצ'דאון כדי להפעיל את תגובת PCR על האופניים התרמיים. כדי ליצור הטרודופלקסים בין DNAs לא תואמים, דגירה מוצרי PCR במחזור התרמי בתוכנית אחרת. לאחר מכן, להוסיף 2.5 microliters של אנדונוקלאז Cel-1 תוצרת בית לכל אחד מוצרי PCR heteroduplexed.דגירה במשך 45 דקות ב 45 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לסיים את תגובת Cel-1 על ידי הוספת 2.5 microliters של 0.5 EDTA טוחן ב pH שמונה. טוענים 30.5 מיקרוליטרים של כל מוצר שטופל ב-Cel-1 מעורבב עם חמישה מיקרוליטרים של צבע על ג'ל 3%agarose ורץ ב-100 וולט למשך שעתיים וחצי.כדי deconvolute בריכות מוטנטים, לקבוע את הזיגוסיטיות של מוטנטים על ידי הפעלת שתי תגובות PCR עבור DNA M2 בודדים שבו התגובה הראשונה מכילה 2.5 microliters של M2 DNA ו 2.5 microliters של סוג הבר DNA ואת התגובה השנייה מכילה רק חמישה microliters של M2 DNA. פרוטוקול זה מראה מוטציה EMS של גידולי תבואה קטנים ואת האפיון של מוטציה. עקומת המינון מצביעה על מינוני EMS אופטימליים עבור שיעורי ההישרדות הרצויים של 50% עבור שלושה מינים שונים של חיטה.נוכחותם של פנוטיפים הניתנים לזיהוי בקלות באוכלוסיית M2 מאשרת את האפקטיביות של mutagenesis באוכלוסיות תבואה קטנות. להלן ארבע דוגמאות של פנוטיפים מוטנטים באוכלוסיות M2 TILLING, מוטנט לבקן באוכלוסיית שעורה M2, מוטציית כלורינה באוכלוסיית שעורה M2, מוטציה מגוונת עם שינוי צבע ורוד באוכלוסיית Aegilops tauschii M2, ומוטנט נמוך ב- Triticum monococcum M2 אוכלוסייה. זיהוי מוטנטים באמצעות Cel-1 על פלטפורמות ג'ל אגרוז מראה בריכת מוטנטים פוטנציאלית שזוהתה מתוך 12 בריכות מוטנטים על ידי להקות מחשוף ייחודיות.פירוק בריכות המוטנטים קבע את הזיגוסיטיות של המוטציה ועזר לאתר את המוטציה לדגימות בודדות. בבריכת A4 היו מוטציות הטרוזיגיות, שצוינו על ידי להקות מחשוף הן בתיבה 4 והן בתיבה 4 דגימות DNA מסוג פראי. בריכת H5 הכילה מוטציות הומוזיגניות כמו להקות מחשוף ייחודיות היו נוכחים רק בתיבה 5 H5 סוג הבר דגימת DNA.הצעד החשוב ביותר הוא לקבוע את הריכוז האופטימלי של EMS כדי להשיג 40 עד 60% קטלניות שיעור. לאחר שאוכלוסיית TILLING עם תדר מוטציה גבוה פותחה ניתן להשתמש בה לאפיון תפקודי של כל גן מעניין. בנוסף, האוכלוסייה יכולה להיות מקור של וריאציה גנטית שימושית לשיפור היבול.TILLING שימש בהרחבה למחקרים גנומיים פונקציונליים בצמחי מודל ויבול. מגוון המוטציות המתקבלות יכול להיות מיסנטים, נוקאאוטים, צורות שקטות או אפילו מוטעות. EMS הוא מוטגאן.לכן, השתמש בציוד מגן אישי מתאים בעת הטיפול ב- EMS. לטהר שאריות פתרונות והשתמש טיפים פיפטה.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...