Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

इस काम को यूएसडीए राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, हैच परियोजना 1016879 और मैरीलैंड कृषि प्रयोग स्टेशन द्वारा MAES अनुदान संख्या 2956952 के माध्यम से समर्थित किया गया था।

1. प्रभावी mutagenesis के लिए खुराक वक्र की तैयारी
<ol><li>छह 250 एमएल कांच फ्लास्क (100 प्रत्येक फ्लास्क में) में ब्याज के जीनोटाइप के साथ 100 बीज भिगो दें जिसमें 50 एमएल आसुत जल होता है। बीज द्वारा आत्मसात करने के लिए कमरे ?...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING जीन सत्यापन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण है, विशेष रूप से छोटे अनाज के लिए जहां परिवर्तन आधारित दृष्टिकोण गंभीर बाधाओं11है. एक उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक mutagenized आ...

जीनोम में प्वाइंट उत्परिवर्तन शोधकर्ताओं के लिए कई उपयोगी उद्देश्यों की सेवा कर सकते हैं। उनकी प्रकृति और स्थान के आधार पर, इन उत्परिवर्तनों जीन या ब्याज की प्रोटीन के भी अलग डोमेन के लिए कार्य आवंटित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दूसरी ओर, उपन्यास आनुवंशिक भिन्नता के एक स्रोत के रूप में, उपयोगी उत्परिवर्तनों phenotyping स्क्रीन का उपयोग कर वांछित लक्षण के लिए चुना जा सकता है और आगे फसल सुधार में इस्तेमाल किया. TILLING एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण है कि रासायनिक mutagenesis और लक्ष्य जीन में अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने भी शामिल है. सबसे पहले अरिबिडोप्सिस1 और ड्रोसोफिलिया मेलेनोगैस्टर2में विकसित किया गया है , टिलिंग आबादी को विकसित किया गया है और कई छोटे अनाज फसलों जैसे हेक्सागुणित रोटी गेहूं (ट्राइटिकम एस्टिवम)3, जौ (होर्डमवल्गे )4, टेट्रापलॉयड ड्यूरम गेहूं (टी. डाइकोकोइड्स ड्यूरम)5, द्विगुणित गेहूं (टी मोनोकोकम)6 और "डी" जीनोम जनक गेहूं एगिलोप्स टौशीई7 . इन संसाधनों का उपयोग अजैविक और जैविक प्रतिबल सहिष्णुता8को विनियमित करने , फूलों केसमय9को विनियमित करने और पोषण से बेहतर फसल किस्मों के विकास में जीनों की भूमिका को सत्यापित करने के लिए किया गया है .
TILLING, इस तरह के एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस), सोडियम azide, एन-मेथिल-एन-नाइटोसौरिया (एमएनयू), और मिथाइल मीथेनसल्फोनेट (एमएमएस) के रूप में alkylating mutagenic एजेंटों के उपयोग के साथ, कई कारणों के लिए अन्य रिवर्स आनुवंशिकी उपकरण ों पर लाभ है। सबसे पहले, mutagenesis व्यावहारिक रूप से किसी भी प्रजाति या पौधे की विविधता पर आयोजित किया जा सकताहै 10 और परिवर्तन बाधा है, जो छोटे अनाज11के मामले में विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है से स्वतंत्र है. दूसरा, नॉकआउट उत्परिवर्तनों कि अन्य जीन सत्यापन दृष्टिकोण द्वारा प्राप्त किया जा सकता पैदा करने के अलावा, missense और splicing उत्परिवर्तनों की एक श्रृंखला प्रेरित किया जा सकता है, जो ब्याज12के प्रोटीन के व्यक्तिगत डोमेन के कार्यों को समझ सकते हैं. इसके अलावा, TILLING जीनोम भर में उत्परिवर्तनों का एक अमर संग्रह उत्पन्न करता है; इस प्रकार, एक एकल जनसंख्या एकाधिक जीनों के कार्यात्मक सत्यापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके विपरीत, अन्य रिवर्स जेनेटिक्स उपकरण केवल अध्ययन13के अधीन जीन के लिए विशिष्ट संसाधन उत्पन्न करते हैं। TILLING के माध्यम से पहचान े लिए गए उपयोगी उत्परिवर्तनों को प्रजनन उद्देश्यों के लिए तैनात किया जा सकता है और जीन संपादन के विपरीत विनियमन के अधीन नहीं हैं, जिनका गैर-ट्रांसजेनिक वर्गीकरण कई देशों में अभी भी अनिश्चित है। यह विशेष रूप से छोटे अनाजों के लिए प्रासंगिक हो जाता है जो अंतर्राष्ट्रीय स्तर पर14का व्यापार करते हैं .
TILLING एक सरल और कुशल जीन सत्यापन रणनीति है और ब्याज के जीन की जांच के लिए विकसित किया जा करने के लिए mutagenized आबादी की आवश्यकता है. एक प्रभावी mutagenized आबादी का विकास एक TILLING आधारित जीन सत्यापन अध्ययन की दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक TILLING जनसंख्या इंगित करता है कि एक अव्यावहारिक बड़ी आबादी वांछित उत्परिवर्तनों के लिए जांच की जानी चाहिए, जबकि एक उच्च mutagen एकाग्रता जनसंख्या में उच्च मृत्यु दर और की एक अपर्याप्त संख्या की ओर जाता है mutagenized व्यक्तियों. एक बार एक अच्छी आबादी विकसित की है, वहाँ ब्याज के जीन में उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, और मंच का चुनाव प्रयोगात्मक पैमाने और संसाधनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण और बाह्य अनुक्रमण का प्रयोग पौधों में पौधों में सभी उत्परिवर्तनों को छोटे जीनोम ों के साथ15,16में बदलने के लिए किया गया है . दो टिलरिंग आबादी का एकोम अनुक्रमण रोटी और ड्यूरम गेहूं में किया गया है और वांछनीय उत्परिवर्तनों की पहचान करने और ब्याज की उत्परिवर्ती लाइनों के आदेश के लिए जनता के लिए उपलब्ध है17. यह वांछनीय उत्परिवर्तनों की उपलब्धता के संदर्भ में एक महान सार्वजनिक संसाधन है; हालांकि, जीन सत्यापन अध्ययन में, जंगली प्रकार लाइन ब्याज की उम्मीदवार जीन के अधिकारी होना चाहिए. दुर्भाग्य से, यह अभी भी एक और पृष्ठभूमि में कुछ उम्मीदवार जीन के रिवर्स आनुवंशिकी आधारित सत्यापन के लिए पूरे TILLING आबादी के exome अनुक्रम करने के लिए लागत-निरोधी है. Amplicon अनुक्रमण और Cel-1 आधारित परख गेहूं में लक्षित आबादी में उत्परिवर्तनों का पता लगाने में इस्तेमाल किया गया है, और Cel-1 परख सरल कर रहे हैं, कोई कम्प्यूटेशनल ज्ञान की आवश्यकता होती है, और बुनियादी के साथ जीन की एक छोटी संख्या के सत्यापन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं प्रयोगशाला उपकरण6,18.
वर्तमान लेख में, वर्णित एक अच्छा TILLING आबादी के विकास के लिए तरीके हैं, खुराक वक्र की तैयारी सहित, mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव, और पीसीआर आधारित Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्ती आबादी की स्क्रीनिंग . इस प्रोटोकॉल को पहले से ही ट्राइटिकम एस्टिवमकी म्यूटेजेनीकृत आबादी के विकास और उपयोग में सफलतापूर्वक लागू किया गया है , ट्राइटिकम मोनोकोकम6, जौ , एजिलॉप्स टाउचीई7, और कई दूसरों. शामिल उपयोगी सुझाव है कि शोधकर्ताओं की आबादी को विकसित करने में मदद मिलेगी के साथ इन तरीकों का स्पष्ट विवरण कर रहे हैं, पसंद के किसी भी छोटे अनाज संयंत्र में एक mutagen के रूप में ईएमएस का उपयोग कर.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

जीनोम्स में प्रेरित स्थानीय लेसेंस को लक्षित करना (TILLING) एक शक्तिशाली रिवर्स जेनेटिक्स उपकरण है जिसमें रासायनिक उत्परिवर्तन और लक्ष्य जीनों में अनुक्रम भिन्नता का पता लगाना शामिल है। TILLING जीन सत्यापन के लिए एक अत्यधिक मूल्यवान कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण है, विशेष रूप से छोटे अनाज में जिसमें परिवर्तन आधारित दृष्टिकोण गंभीर सीमाओं पकड़. एक मजबूत mutagenized आबादी का विकास एक TILLING आधारित जीन सत्यापन अध्ययन की दक्षता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक कम समग्र उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक TILLING आबादी इंगित करता है कि एक अव्यावहारिक बड़ी आबादी वांछित उत्परिवर्तनों को खोजने के लिए जांच की जानी चाहिए, जबकि एक उच्च mutagen एकाग्रता जनसंख्या में उच्च मृत्यु दर की ओर जाता है, एक अपर्याप्त करने के लिए अग्रणी mutagenized व्यक्तियों की संख्या. एक बार एक प्रभावी जनसंख्या विकसित की है, वहाँ ब्याज की एक जीन में उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कई तरीके हैं, और मंच का चुनाव प्रयोगात्मक पैमाने और संसाधनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है. उत्परिवर्ती पहचान के लिए Cel-1 परख और agarose जेल आधारित दृष्टिकोण सुविधाजनक है, reproduible, और एक कम संसाधन गहन मंच. यह फायदेमंद है कि यह सरल है, कोई गणना ज्ञान की आवश्यकता होती है, और यह बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों के साथ जीन की एक छोटी संख्या के सत्यापन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. वर्तमान लेख में, वर्णित एक अच्छा TILLING आबादी के विकास के लिए तरीके हैं, खुराक वक्र की तैयारी सहित, mutagenesis और उत्परिवर्ती आबादी के रखरखाव, और पीसीआर आधारित Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्ती आबादी की स्क्रीनिंग .

चित्र 2 षट्गुणित रोटी गेहूं की खेती, द्विगुणित गेहूं ट्राइटिकम मोनोकोकम6और गेहूं एजिलॉप्स टौशीई7 के जीनोम दाता की खुराक वक्र को दर्शाता है। वांछित 50% जी?...

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Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

एथिल मेथेनसल्फोनेट (ईएमएस) को म्यूटेजन के रूप में उपयोग के साथ छोटी अनाज फसलों में लक्षित प्रेरित स्थानीय लेसेंस (TILLING) जनसंख्या विकसित करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। इसके अलावा प्रदान की Cel-1 परख का उपयोग उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल है.

एथिल मिथेनसल्फोनेट म्यूटजेनेसिस द्वारा छोटे अनाज फसलों में जीनोम्स (TILLING) जनसंख्या में स्थानीय लेसेंस को लक्षित करने का विकास

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

यह प्रोटोकॉल छोटे अनाज फसलों में ईएमएस म्यूटेनेसिस द्वारा उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ मजबूत जुताई आबादी के विकास का विवरण देता है। जुताई आबादी कार्यात्मक जीनोमिक्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही छोटे अनाज फसलों में आगे आनुवंशिक अंतरिक्ष जीन की खोज के लिए । इस तकनीक का उपयोग करके विकसित जुताई आबादी में उच्च उत्परिवर्तन आवृत्तियों हैं, और इस प्रोटोकॉल को किसी भी जीनोटाइप पर लागू किया जा सकता है।बेसिक लैब उपकरणों का उपयोग करके सीईएल-1 परख आधारित म्यूटेशन डिटेक्शन कराया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण कदम इष्टतम ईएमएस एकाग्रता का निर्धारण करना है। इसलिए, विशेष रूप से व्यक्तिगत आबादी के लिए एक ईएमएस खुराक वक्र बनाया जाना चाहिए।शुरू करने के लिए, छह 250 मिलीलीटर ग्लास फ्लास्क में से प्रत्येक में ब्याज के जीनोटाइप के साथ 100 बीज ों को भिगोएं, जिसमें 50 मिलीलीटर आसुत पानी होता है। आत्मसात करने के लिए कमरे के तापमान पर आठ घंटे के लिए १०० आरपीएम पर हिलाओ । फिर, एक धूम हुड में, ईएमएस तरल और आसुत पानी को मिलाकर पांच अलग-अलग सांद्रता के ईएमएस समाधानों के 50 मिलीलीटर तैयार करें।आत्मसात करने के बाद, पांच फ्लास्क में से पानी को डिकेंट करें। आत्मसात बीज युक्त पांच फ्लास्क में से प्रत्येक में ईएमएस समाधान के 50 मिलीलीटर जोड़ें। 75 आरपीएम और कमरे के तापमान पर 16 घंटे के लिए फ्लैक्स हिलाएं।अब, एक खाली बेकार की बोतल में ईएमएस समाधान decant और एक खाली अपशिष्ट बोतल पर रखा चीज़क्लोथ पर इलाज बीज डालना प्रत्येक उपचार के लिए अलग से इकट्ठा करने के लिए । बीज डालने में मदद करने के लिए अतिरिक्त पानी का उपयोग करें। इसके अलावा, दूषित फ्लास्क की दीवार पर ईएमएस निष्क्रिय समाधान के कई मिलीलीटर स्प्रे करें।और 24 घंटे के लिए समाधान में इस्तेमाल किया पिपेट सुझावों विसर्जित कर दिया। निष्क्रिय 24 घंटे के लिए इलाज के लिए ईएमएस निष्क्रिय समाधान की एक मात्रा जोड़कर इस्तेमाल किया ईएमएस समाधान। एक मोड़ टाई का उपयोग करना, चीज़क्लोथ के अंदर ईएमएस इलाज बीज पकड़ो और दो घंटे के लिए चल नल के पानी के नीचे धोने ।धोने के बाद, प्रत्येक बीज को व्यक्तिगत रूप से रूट प्रशिक्षकों में ट्रांसप्लांट करें जिसमें पॉटिंग मिट्टी होती है। 16 घंटे की हल्की अवधि के लिए 20 से 25 डिग्री सेल्सियस पर पौधों को उगाएं। प्रत्यारोपण के 15 दिनों के बाद, पौधों की जांच करें और उन बीजों की संख्या गिनें जो अंकुरित करने में विफल रहे।पौधों के अस्तित्व का रिकॉर्ड डेटा। यदि जीवित रहने की दर 40 से 60% के भीतर नहीं है, तो म्यूटेनेसिस प्रयोग के बाद 40 से 60% की वांछित घातकता दर को प्राप्त करने तक संशोधित एकाग्रता के साथ खुराक अनुकूलन का दूसरा दौर संचालित करें, तो एम 2 पौधों के पत्ते के ऊतकों को 96 अच्छी तरह से ऊतक संग्रह बॉक्स में एकत्र करें। ऊतक M2 पौधों से एकत्र किया जाता है जो स्वेड एम 1 पौधों से उगाए गए थे।प्रत्येक एम 1 पौधे से एक एम 2 संयंत्र दिखाया गया है। निर्माता की सिफारिशों के बाद डीएनए शुद्धिकरण प्रणाली के साथ एक संयंत्र डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर डीएनए निकालें। फिर, डीएनए निकालने के दो माइक्रोलीटर को 16 स्लॉट के साथ एलवी प्लेटों में लोड करें।260 और 280 नैनोमीटर की तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके डीएनए की मात्रा निर्धारित करें। नाभिक मुक्त पानी के साथ डीएनए एकाग्रता को 25 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर तक पतला करें। प्रत्येक नमूने की पंक्ति और कॉलम पहचान को बनाए रखते हुए चार ९६ अच्छी तरह से ब्लॉक में प्रत्येक कुएं से डीएनए को एक पूल प्लेट में मिलाकर २०० माइक्रोलीटर के चार गुना डीएनए पूल बनाएं ।इसके बाद, प्रत्येक ट्यूब पीसीआर बफर, फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर, और पांडुलिपि के अनुसार डीएनए पॉलीमरेज में जोड़कर जीन विशिष्ट प्राइमर के लिए एक पीसीआर मास्टर मिक्स ट्यूब तैयार करें। एक ९६ अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के कुओं में मास्टर मिश्रण Aliquot । इसके बाद पूल्ड डीएनए टेम्पलेट डालें।पीसीआर ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में लोड करें, और थर्मल साइकिल चालक पर पीसीआर प्रतिक्रिया को चलाने के लिए टचडाउन प्रोफाइल का उपयोग करें। बेमेल डीएनए के बीच हेट्रोडुलेक्स उत्पन्न करना, थर्मल साइकिलर में पीसीआर उत्पादों को एक अलग कार्यक्रम में इनक्यूबेट करना। फिर, प्रत्येक हेट्रोड्यूप्लेक्स्ड पीसीआर उत्पादों में होममेड सेल-1 एंडोन्यूक्लिज के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें।45 मिनट तक 45 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। उसके बाद, पीएच आठ पर 0.5 मोलर EDTA के 2.5 माइक्रोलीटर जोड़कर सेल-1 प्रतिक्रिया समाप्त करें। प्रत्येक सेल-1 उपचारित उत्पाद के 30.5 माइक्रोलीटर लोड करें जो 3% एगर उठे जेल पर डाई के पांच माइक्रोलीटर के साथ मिश्रित होता है और ढाई घंटे तक 100 वोल्ट पर चलता है।उत्परिवर्ती पूल को अलग करने के लिए, व्यक्तिगत एम 2 डीएनए के लिए दो पीसीआर प्रतिक्रियाओं को चलाकर म्यूटेंट की जाइगोसिटी का निर्धारण करें जिसमें पहली प्रतिक्रिया में एम2 डीएनए के २.५ माइक्रोलीटर और जंगली प्रकार के डीएनए के २.५ माइक्रोलीटर होते हैं और दूसरी प्रतिक्रिया में एम 2 डीएनए के केवल पांच माइक्रोलीटर होते हैं । यह प्रोटोकॉल ईएमएस को छोटी अनाज फसलों के उत्परिवर्तन और उत्परिवर्ती के लक्षण वर्णन से पता चलता है। खुराक वक्र गेहूं की तीन विभिन्न प्रजातियों के लिए वांछित 50% जीवित रहने की दरों के लिए इष्टतम ईएमएस खुराक इंगित करता है।M2 आबादी में आसानी से पहचाने जाने योग्य फेनोटाइप की उपस्थिति छोटे अनाज आबादी में म्यूटेनेसिस की प्रभावशीलता की पुष्टि करती है। यहां M2 जुताई आबादी में उत्परिवर्ती फेनोटाइप के चार उदाहरण दिए गए हैं, जौ एम 2 आबादी में एक एल्बिनो उत्परिवर्ती, जौ एम 2 आबादी में एक क्लोरीना उत्परिवर्ती, एक एगिलोप्स तौस्चिई M2 आबादी में गुलाबी मलिनकिरण के साथ एक विविध उत्परिवर्ती, और एक ट्राइटिकम मोनोकॉकुम M2 आबादी में कम-जुताई उत्परिवर्ती। एगर उठे जेल प्लेटफार्मों पर सेल-1 का उपयोग करके एक उत्परिवर्ती पहचान अद्वितीय क्लीव्ड बैंड द्वारा 12 उत्परिवर्ती पूल से पहचाने गए संभावित उत्परिवर्ती पूल को दर्शाती है।उत्परिवर्ती पूल के deconvolution उत्परिवर्तन की zygosity निर्धारित किया है और व्यक्तिगत नमूनों के लिए नीचे उत्परिवर्तन ट्रैक करने में मदद की । A4 पूल विषम उत्परिवर्तन था, दोनों बॉक्स 4 और बॉक्स 4 जंगली प्रकार डीएनए नमूनों में cleaved बैंड द्वारा संकेत दिया । H5 पूल अद्वितीय क्लीव्ड बैंड के रूप में होमोज़िगस म्यूटेशन निहित केवल बॉक्स 5 H5 जंगली प्रकार डीएनए नमूने में मौजूद थे ।सबसे महत्वपूर्ण कदम 40 से 60% घातक दर प्राप्त करने के लिए ईएमएस की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करना है। एक बार एक उच्च उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ एक जुताई आबादी विकसित किया गया है यह ब्याज के किसी भी जीन के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, जनसंख्या फसल सुधार के लिए उपयोगी आनुवंशिक भिन्नता का स्रोत हो सकती है।मॉडल और फसल पौधों में कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए जुताई का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। प्राप्त उत्परिवर्तनों की सीमा मिसेंट, नॉकआउट, चुप, या यहां तक कि गलत रूपों हो सकती है। ईएमएस एक म्यूटेन है।इसलिए, ईएमएस को संभालते समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें। बचे हुए समाधानों को दूषित करें और पिपेट टिप्स का उपयोग किया।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamicin प्रेरित चोट से वयस्क zebrafish में किडनी पुनर्जनन

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

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Thymic की विशेषता का उपयोग कर माउस भ्रूण में progenitors निपटाने<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

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विकसित करने के लिए Microinjection लक्ष्य करने के लिए तकनीक<em&gt; Xenopus</em&gt; किडनी

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebrafish में एक इथेनॉल प्रेरित fibrotic लिवर मॉडल के विकास का अध्ययन करने के पूर्वज सेल की मध्यस्थता Hepatocyte पुनर्जनन

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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वयस्क Drosophila melanogaster दिमाग में मशरूम शरीर और Photoreceptor न्यूरॉन्स के विच्छेदन और Immunofluorescent धुंधला

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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RNAi और हीट शॉक-प्रेरित प्रतिलेखन कारक अभिव्यक्ति के आवेदन के लिए सी. एलिगेंस में न्यूरॉन्स के लिए रोगाणु कोशिकाओं reprogram

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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सेल एकत्रीकरण परख सीआईएसद्वारा ट्रांस-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ Drosophila पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं के चिकित्सीय प्रत्यारोपण के साथ माउस मस्तिष्क चोट के नियंत्रित Cortical प्रभाव मॉडल

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...