Name: development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis
Uploaded: 2019-07-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk, Hatch projekt 1016879 och Maryland Agricultural experiment Station via MAES Grant nr 2956952.

1. beredning av doseringskurva för effektiv mutagenes
<ol><li>Blötlägg 100 frön med genotyp av intresse i 6 250 mL glasflaskor (100 i varje kolv) innehållande 50 mL destillerat vatten. Skaka vid 100 rpm för 8 h vid rumstemperatur (RT) för utgjutningar av fröna.</li>
	<li>Bered 50 mL av 0,4%, 0,6%, 0,8%, 1,0% och 1,2% (w/v) etylmetanesulfonat (EMS) lösning genom upplösning av 0,167, 0,249, 0,331, 0,415 och 0,498 mL EMS i destillerat vatten. Anmärkning: EMS är flytande vid RT med en densitet på 1,206 g/mL...

<ol>
	<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+screening+for+induced+mutations.">Targeted screening for induced mutations.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 455-457 (2000).</li><li>Bentley, A., MacLennan, B., Calvo, J., Dearolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Recovery+of+Mutations+in+Drosophila.">Targeted Recovery of Mutations in Drosophila.</a> Genetics. 156 (3), 1169-1173 (2000).</li><li>Tsai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+Rare+Mutations+in+Populations:+TILLING+by+Sequencing.">Discovery of Rare Mutations in Populations: TILLING by Sequencing.</a> Plant Physiology. 156 (3), 1257-1268 (2011).</li><li>Caldwell, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structured+mutant+population+for+forward+and+reverse+genetics+in+Barley+(Hordeum+vulgare+L.).">A structured mutant population for forward and reverse genetics in Barley (Hordeum vulgare L.).</a> The Plant Journal. 40 (1), 143-150 (2004).</li><li>Hazard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Mutations+in+the+Starch+Branching+Enzyme+II+(+SBEII+)+Genes+Increase+Amylose+and+Resistant+Starch+Content+in+Durum+Wheat.">Induced Mutations in the Starch Branching Enzyme II ( SBEII ) Genes Increase Amylose and Resistant Starch Content in Durum Wheat.</a> Crop Science. 52 (4), 1754-1766 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+diploid+wheat+TILLING+resource+for+wheat+functional+genomics.">A diploid wheat TILLING resource for wheat functional genomics.</a> BMC Plant Biology. 12, 205 (2012).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TILL-D:+An+Aegilops+tauschii+TILLING+Resource+for+Wheat+Improvement.">TILL-D: An Aegilops tauschii TILLING Resource for Wheat Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 9, (2018).</li><li>Rawat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+Fhb1+encodes+a+chimeric+lectin+with+agglutinin+domains+and+a+pore-forming+toxin-like+domain+conferring+resistance+to+Fusarium+head+blight.">Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight.</a> Nature Genetics. 48 (12), 1576-1580 (2016).</li><li>Kippes, N., Chen, A., Zhang, X., Lukaszewski, A. J., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+spring+hexaploid+wheat+line+with+no+functional+VRN2+genes.">Development and characterization of a spring hexaploid wheat line with no functional VRN2 genes.</a> Theoretical and Applied Genetics. 129 (7), 1417-1428 (2016).</li><li>Greene, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrum+of+Chemically+Induced+Mutations+From+a+Large-Scale+Reverse-Genetic+Screen+in+Arabidopsis.">Spectrum of Chemically Induced Mutations From a Large-Scale Reverse-Genetic Screen in Arabidopsis.</a> Genetics. 164 (2), 731-740 (2003).</li><li>Harwood, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+remaining+challenges+in+the+transformation+of+barley+and+wheat.">Advances and remaining challenges in the transformation of barley and wheat.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (5), 1791-1798 (2012).</li><li>Henikoff, S., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Nucleotide+Mutations+for+Plant+Functional+Genomics.">Single-Nucleotide Mutations for Plant Functional Genomics.</a> Annual Review of Plant Biology. 54 (1), 375-401 (2003).</li><li>Uauy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+TILLING+approach+to+detect+induced+mutations+in+tetraploid+and+hexaploid+wheat.">A modified TILLING approach to detect induced mutations in tetraploid and hexaploid wheat.</a> BMC Plant Biology. 9 (1), 115 (2009).</li><li>Uauy, C., Wulff, B. B. H., Dubcovsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Traditional+Mutagenesis+with+New+High-Throughput+Sequencing+and+Genome+Editing+to+Reveal+Hidden+Variation+in+Polyploid+Wheat.">Combining Traditional Mutagenesis with New High-Throughput Sequencing and Genome Editing to Reveal Hidden Variation in Polyploid Wheat.</a> Annual Review of Genetics. 51 (1), 435-454 (2017).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequences+of+1504+Mutants+in+the+Model+Rice+Variety+Kitaake+Facilitate+Rapid+Functional+Genomic+Studies.">The Sequences of 1504 Mutants in the Model Rice Variety Kitaake Facilitate Rapid Functional Genomic Studies.</a> The Plant Cell. 29 (6), 1218-1231 (2017).</li><li>Jiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Sorghum+Mutant+Resource+as+an+Efficient+Platform+for+Gene+Discovery+in+Grasses.">A Sorghum Mutant Resource as an Efficient Platform for Gene Discovery in Grasses.</a> The Plant Cell. 28 (7), 1551-1562 (2016).</li><li>Krasileva, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncovering+hidden+variation+in+polyploid+wheat.">Uncovering hidden variation in polyploid wheat.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201619268 (2017).</li><li>Dong, C., Dalton-Morgan, J., Vincent, K., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+TILLING+Method+for+Wheat+Breeding.">A Modified TILLING Method for Wheat Breeding.</a> The Plant Genome. 2 (1), 39-47 (2009).</li><li>Till, B. J., Zerr, T., Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+TILLING+and+Ecotilling+in+plants+and+animals.">A protocol for TILLING and Ecotilling in plants and animals.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2465-2477 (2006).</li><li>Wu, J. -. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical-+and+Irradiation-induced+Mutants+of+Indica+Rice+IR64+for+Forward+and+Reverse+Genetics.">Chemical- and Irradiation-induced Mutants of Indica Rice IR64 for Forward and Reverse Genetics.</a> Plant Molecular Biology. 59 (1), 85-97 (2005).</li><li>Feldman, M., Levy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Evolution+Due+to+Allopolyploidization+in+Wheat.">Genome Evolution Due to Allopolyploidization in Wheat.</a> Genetics. 192 (3), 763-774 (2012).</li><li>Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+advantages+and+disadvantages+of+being+polyploid.">The advantages and disadvantages of being polyploid.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 836-846 (2005).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+High-Efficient+Mutation+Resource+with+Phenotypic+Variation+in+Hexaploid+Winter+Wheat+and+Identification+of+Novel+Alleles+in+the+TaAGP.L-B1+Gene.">Development of a High-Efficient Mutation Resource with Phenotypic Variation in Hexaploid Winter Wheat and Identification of Novel Alleles in the TaAGP.L-B1 Gene.</a> Frontiers in Plant Science. 8, (2017).</li><li>Rakszegi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+agronomic+and+morphological+traits+in+a+mutant+population+of+bread+wheat+studied+in+the+Healthgrain+program.">Diversity of agronomic and morphological traits in a mutant population of bread wheat studied in the Healthgrain program.</a> Euphytica. 174 (3), 409-421 (2010).</li><li>Tsai, H., Ngo, K., Lieberman, M., Missirian, V., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tilling+by+Sequencing.">Tilling by Sequencing.</a> Plant Functional Genomics: Methods and Protocols. , 359-380 (2015).</li></ol>

TILLING är en mycket värdefull omvänd genetik verktyg för gen validering, särskilt för små korn där omvandling-baserade metoder har allvarliga flaskhalsar11. Att utveckla en mutageniserad population med hög mutationsfrekvens är ett av de kritiska stegen vid genomförandet av funktionsgenomiska studier. Det viktigaste steget i att utveckla en robust TILLING population är att bestämma den optimala koncentrationen av EMS. Den 40%-60% överlevnad i M1 har visat sig vara en bra i...

Punktmutationer i genom kan tjäna många användbara syften för forskare. Beroende på deras beskaffenhet och läge, kan dessa mutationer användas för att tilldela funktioner till gener eller till och med distinkta områden av proteiner av intresse. Å andra sidan, som en källa till ny genetisk variation, användbara mutationer kan väljas för önskade egenskaper med hjälp av fenotypning skärmar och ytterligare används i gröda förbättring. TILLING är ett kraftfullt verktyg för omvänd genetik som inkluderar kemisk mutagenes och detektion av sekvensvariation i målgenen. Först utvecklades i Arabidopsis1 och drosophilia melanogaster2, tilling populationer har utvecklats och utnyttjas i många små spannmålsgrödor såsom hexaploid bröd vete (Triticum aestivum)3, korn (Hordeum vulgare)4, gräsart durumvete (t. dicoccoides durumvete)5, diploida vete (t. monococcum)6 och "D" Genome progenitorceller av vete Aegilops Auktor7 . Dessa resurser har använts för att validera rollerna av gener i regleringen abiotiska och biotiska stresstolerans8, reglerar blommande tid9, och utveckla näringsmässigt överlägsen gröda sorter5.
TILLING, tillsammans med användning av alkylerande mutagena ämnen såsom etylmetanesulfonat (EMS), natriumazid, N-metyl-N-nitrosourea (MNU), och metylmetansulfonat (MMS), har fördelar jämfört med andra omvänd genetik verktyg av flera skäl. För det första kan mutagenes utföras på praktiskt taget alla arter eller olika typer av växt10 och är oberoende av omvandlings flaskhalsen, vilket är särskilt utmanande när det gäller små korn11. För det andra, förutom att generera knockout-mutationer som kan erhållas genom andra gen validering metoder, kan en rad genom och skarvning mutationer induceras, som kan urskilja funktioner av enskilda domäner av proteiner av intresse12. Dessutom genererar JORDbearbetning en odödlig samling av mutationer i hela genomet. Således kan en enda population användas för funktionell validering av flera gener. Däremot andra omvänd genetik verktyg generera resurser som är specifika för endast genen under studie13. Användbara mutationer som identifierats genom TILLING kan sättas in för avelsändamål och omfattas inte av reglering, till skillnad från genredigering, vars icke-transgena klassificering fortfarande är osäker i många länder. Detta blir särskilt relevant för små korn som handlas internationellt14.
TILLING är en enkel och effektiv gen validering strategi och kräver mutagenized populationer utvecklas för att undersöka gener av intresse. Att utveckla en effektiv mutageniserad population är avgörande för att fastställa effektiviteten hos en TILLING-baserad genvalideringsstudie. En TILLING population med en låg övergripande mutationsfrekvens indikerar att en impraktiskt stor population måste undersökas för önskade mutationer, medan en hög mutagen koncentration leder till hög dödlighet i befolkningen och ett otillräckligt antal mutageniserade individer. När en bra population utvecklas, det finns flera sätt att upptäcka mutationer i gener av intresse, och valet av plattform beror på experimentell skala och tillgång till resurser. Hela Genomsekvensering och Helexomanalyserna-sekvensering har använts för att karakterisera alla mutationer i tilling populationer i växter med små genomer15,16. Exome sekvensering av två TILLING populationer har utförts i bröd och durumvete och är tillgänglig för allmänheten för att identifiera önskvärda mutationer och beställa Mutant linjer av intresse17. Det är en stor offentlig resurs när det gäller tillgängligheten av önskvärda mutationer; emellertid, i gen validering studier, Wild-typ linjen bör inneha den kandidat gen av intresse. Tyvärr är det fortfarande kostnads oöverkomliga att sekvensera Helexomanalyserna av hela TILLING befolkningen för omvänd genetik-baserad validering av några kandidat gener i en annan bakgrund. Amplikon sekvensering och cel-1-baserade analyser har använts för att upptäcka mutationer i riktade populationer i vete, och cel-1-analyser är enklare, kräver ingen beräknings kunskap, och är särskilt lämpade för validering av ett litet antal gener med grundläggande laboratorieutrustning6,18.
I den här artikeln beskrivs metoder för utveckling av en bra TILLING population, inklusive beredning av doseringskurvan, mutagenicitet och underhåll av den muterade populationen, och screening av den mutanta populationen med hjälp av PCR-baserade cel-1-analysen . Detta protokoll har redan genomförts framgångsrikt i att utveckla och utnyttja mutagenized populationer av Triticum aestivum, Triticum monoccocum6, korn, Aegilops tauchii7, och flera Andra. Inkluderat är explicita Detaljer om dessa metoder tillsammans med användbara tips som hjälper forskarna att utveckla TILLING populationer, med hjälp av EMS som mutagen i någon liten spannmåls fabrik val.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well 1.1 ml microtubes in microracks</td>
			<td>National Scientific</td>
			<td>TN0946-08R</td>
			<td>For collecting leaf tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose I biotechnology grade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0710-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosprint 96 DNA Plant Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>941558</td>
			<td>Kit for DNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cel-1 endonuclease</td>
			<td>Extracted as described by Till et al 2006</td>
			<td></td>
			<td>Single strand specific endonuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl methanesulfonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M-0880-25G</td>
			<td>EMS, Chemical mutagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze Dry/Shell freeze system</td>
			<td>Labconco</td>
			<td></td>
			<td>For lyophilization of leaf tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kingfisher Flex purification system</td>
			<td>Thermo fisher scientific</td>
			<td>5400610</td>
			<td>High throughput DNA extraction robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>My Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-21107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>W4502-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius gel imaging system</td>
			<td>Syngene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbit Environ-shaker</td>
			<td>Lab-line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPECTROstar Nano</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td>Nano drop for DNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal cycler</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of targeting induced local lesions in genomes (tilling) populations in small grain crops by ethyl methanesulfonate mutagenesis

Att rikta inducerade lokala lesioner i genom (TILLING) är ett kraftfullt verktyg för omvänd genetik som omfattar kemisk mutagenes och detektion av sekvens variation i målgener. TILLING är en mycket värdefull funktionell genomik verktyg för gen validering, särskilt i små korn där omvandling-baserade metoder hålla allvarliga begränsningar. Att utveckla en robust mutageniserad population är avgörande för att fastställa effektiviteten hos en TILLING-baserad genvalideringsstudie. En TILLING population med en låg övergripande mutationsfrekvens indikerar att en impraktiskt stor population måste undersökas för att hitta önskade mutationer, medan en hög mutagen koncentration leder till hög dödlighet i befolkningen, vilket leder till en otillräcklig antal mutageniserade individer. När en effektiv population utvecklas, det finns flera sätt att upptäcka mutationer i en gen av intresse, och valet av plattform beror på experimentell skala och tillgång till resurser. Cel-1-analysen och agaros gel-baserade metod för Mutant identifiering är bekvämt, reproducerbar och en mindre resurskrävande plattform. Det är fördelaktigt eftersom det är enkelt, kräver ingen beräknings kunskap, och det är särskilt lämpligt för validering av ett litet antal gener med grundläggande laboratorieutrustning. I den här artikeln beskrivs metoderna för utveckling av en bra TILLING-population, inklusive beredning av doseringskurvan, mutagenes och upprätthållande av den muterade populationen, samt screening av den mutanta populationen med hjälp av PCR-baserade cel-1-analysen .

Figur 2 visar dosering kurvan för hexaploid bröd vete sort Jagger, diploida vete Triticum monococcum6, och en genom givare av vete Aegilops Auktor7. EMS doser för önskad 50% överlevnad var cirka 0,25%, 0,6% och 0,7% för t. monococcum, AE. Auktor, och t. aestivum, respektive. Den högre EMS-toleransen för hexaploid vete beror på dess genombuffrande kapacitet. M...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis at JoVE.com

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes TILLING Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Beskrivs är ett protokoll för att utveckla en inriktning inducerade lokala lesioner i Genomes (TILLING) population i små spannmålsgrödor med användning av etylmetanesulfonat (EMS) som mutagen. Det finns också ett protokoll för Mutations detektering med hjälp av cel-1-analysen.

Utveckling av riktade inducerade lokala lesioner i genomer (TILLING) populationer i små spannmålsgrödor med Etylmetanesulfonatmuta Genes

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) is a powerful reverse genetics tool that includes chemical mutagenesis and detection of sequence ...

Detta protokoll detaljer utvecklingen av robusta TILLING populationer med hög mutation frekvens av EMS mutagenesis i små korn grödor. TILLING populationer kan användas för funktionell genomik, samt för framåt genetiska rymdgen upptäckt i små säd grödor. DE TILLING-populationer som utvecklats med hjälp av denna teknik har höga mutationsfrekvenser, och detta protokoll kan tillämpas på vilken genotyp som helst.Cel-1-analysen baserad mutation upptäckt kan genomföras med hjälp av grundläggande lab utrustning. Det viktigaste steget är att bestämma den optimala EMS-koncentrationen. Därför bör en EMS doseringskurva göras speciellt för den enskilda befolkningen.Till att börja med blöt 100 frön med genotypen av intresse i var och en av sex 250 milliliter glaskolvar, som innehåller 50 milliliter destillerat vatten. Skaka vid 100 RPM i åtta timmar vid rumstemperatur för imbibition. Sedan, i en rökhuva, förbered 50 milliliter EMS-lösningar av fem olika koncentrationer genom att blanda EMS-vätska och destillerat vatten.Efter imbibition, dekantera vattnet ur fem kolvar. Tillsätt 50 milliliter EMS-lösning i var och en av de fem kolvar som innehåller imbibed frön. Skaka kolvarna i 16 timmar vid 75 RPM och rumstemperatur.Nu, dekantera EMS-lösningen i en tom avfallsflaska och häll de behandlade fröna på cheesecloth placeras på en tom avfallsflaska för att samla separat för varje behandling. Använd extra vatten för att hjälpa hälla av fröna. Spruta också flera milliliter AV EMS-inaktiverande lösning på väggen av förorenade kolvar.Och sänk ner använda pipettspetsar i lösningen i 24 timmar. Inaktiv den använda EMS-lösningen genom att lägga till en volym EMS-inaktiverande lösning för att behandla i 24 timmar. Med hjälp av en twist tie, håll EMS behandlade frön inuti cheesecloth och tvätta under rinnande kranvatten i två timmar.Efter tvätt, transplantera varje frö individuellt till rot utbildare som innehåller krukväxtjord. Odla växter vid 20 till 25 grader Celsius under en 16 timmars ljusperiod. Efter 15 dagars transplantation, kontrollera växterna och räkna antalet frön som misslyckades med att gro.Registrera data över växtöverlevnad. Om överlevnaden inte är inom 40 till 60%genomföra en andra omgång av dosering optimering med en modifierad koncentration tills uppnå den önskade dödligheten på 40 till 60%Efter mutagenesis experimentet, samla bladvävnaden av M2 växter i en 96 väl vävnad insamling låda. Vävnad samlas in från M2 växter som odlades från selfed M1 växter.En M2-anläggning visas från varje M1-anläggning. Extrahera DNA med hjälp av en anläggning DNA extraktionssats med ett DNA-reningssystem efter tillverkarens rekommendationer. Därefter, ladda två mikroliter av DNA-extraktet i LV-plattor med 16 platser.Kvantifiera DNA med hjälp av en spektrofotometer vid våglängder på 260 och 280 nanometer. Späd DNA-koncentrationen till 25 nanogram per mikroliter med kärnansfritt vatten. Skapa fyra gånger DNA-pooler av 200 mikroliter genom att kombinera DNA från varje brunn i de fyra 96 brunnsblocken i en poolplatta samtidigt som rad- och kolumnidentiteten för varje prov bibehålls.Därefter förbereda en PCR master mix tube för genspecifika primers genom att lägga till i varje rör PCR buffert, framåt och omvänd primers, och DNA polymeras enligt manuskriptet. Aliquot befälhavaren blanda in brunnarna i en 96 väl PCR-platta. Lägg sedan till den poolade DNA-mallen.Ladda PCR-rören i en termisk cycler, och använd en touchdown-profil för att köra PCR-reaktionen på termiskcykleren. För att generera heteroduplex mellan missmatchade DNAs, inkubera PCR-produkter i termisk cycler i ett annat program. Lägg sedan till 2,5 mikroliter av hemlagad Cel-1 endonuclease till var och en av de heteroduplexade PCR-produkterna.Inkubera i 45 minuter vid 45 grader Celsius. Därefter avslutar du Cel-1-reaktionen genom att tillsätta 2,5 mikroliter på 0,5 molar EDTA vid pH åtta. Ladda 30,5 mikroliter av varje Cel-1-behandlad produkt blandad med fem mikroliter färgämne på en 3%agarosgel och kör på 100 volt i två och en halv timme.För att deconvolute mutant pooler, bestämma zygosity mutanter genom att köra två PCR reaktioner för enskilda M2 DNA där den första reaktionen innehåller 2,5 mikroliter av M2 DNA och 2,5 mikroliter av vilda typ DNA och den andra reaktionen innehåller endast fem mikroliter M2 DNA. Detta protokoll visar EMS mutagenizing av små säd grödor och karakterisering av mutant. Doseringskurvan indikerar optimala EMS-doser för de önskade 50%-överlevnadsgraderna för tre olika arter av vete.Förekomsten av lätt identifierbara fenotyper i M2 befolkningen bekräftar effektiviteten av mutagenes i små korn populationer. Här är fyra exempel på de muterade fenotyper i M2 TILLING populationer, en albino mutant i en korn M2 befolkning, en klorina mutant i en korn M2 befolkning, en brokig mutant med rosa missfärgning i en Aegilops tauschii M2 population, och en låg-tillering mutant i en Triticum monococcum M2 population. En mutant identifiering med Cel-1 på agarrose gel plattformar visar en potentiell mutant pool identifieras av 12 mutant pooler av unika cleaved band.Deconvolution av mutant pooler bestäms zygosity av mutation och hjälpte till att spåra mutationen ner till enskilda prover. A4 poolen hade heterozygous mutationer, som anges av klyvade band i både Box 4 och Box 4 vilda typ DNA-prover. H5 poolen innehöll homozygous mutationer som unika cleaved band var endast närvarande i Box 5 H5 vild typ DNA-prov.Det viktigaste steget är att bestämma den optimala koncentrationen av EMS för att uppnå 40 till 60%dödlighet. När en TILLING befolkning med en hög mutation frekvens har utvecklats det kan användas för funktionella karakterisering av någon gen av intresse. Dessutom kan befolkningen vara en källa till användbar genetisk variation för gröda förbättring.TILLING har använts i stor utsträckning för funktionella genomiska studier i modell- och grödor. Den rad av mutationer som erhållits kan vara felents, knockouts, tyst, eller ens misspliced former. EMS är en mutagen.Använd därför lämplig personlig skyddsutrustning medan du hanterar EMS. Dekontaminera överblivna lösningar och använda pipettspetsar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Development of Targeting Induced Local Lesions IN Genomes (TILLING) Populations in Small Grain Crops by Ethyl Methanesulfonate Mutagenesis

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Njure Regeneration i vuxen Zebrafish av Gentamicin inducerad skada

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em&gt; In Vivo</em&gt; Och<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknik till Target mikroinjektion till utvecklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Njure

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utveckling av en etanol-inducerad Fibrotisk Lever modell i Zebrafish att studera stamceller-medierad Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Tillämpningen av RNAi och värme-chock-inducerad transkription faktorn uttryck att omprogrammera könsceller att nervceller i C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation analyser att utvärdera bindningen av Drosophila skåran med Trans-ligander och dess hämning av Cis-ligander

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Kontrollerad kortikal effekt modell av mus hjärnskada med terapeutisk transplantation av humana inducerade pluripotenta stamceller-härledda neurala celler

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...