Name: real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures
Uploaded: 2019-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Department of Neurosurgery, Brown University to N.T. unterstützt.

Die Protokolle für die Sammlung, Isolierung und Ausbreitung von patientenabgeleiteten menschlichen Gliomzellen wurden vom IRB-Ausschuss des Rhode Island Hospital genehmigt. Alle Tiere wurden gemäß dem NIH-Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren gepflegt. Alle Tiernutzungsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Rhode Island Hospital genehmigt.
1. Medien- und Pufferpräparate
<ol><li>Bereiten Sie 50 ml Neurosphäre nimin vor: 1x Neuronales Basa...

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Stupp, R., Weber, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+radio-+and+chemotherapy+in+glioblastoma.">The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma.</a> Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).</li><li>Wick, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+inhibition:+emerging+molecular+targets+for+treating+glioblastoma.">Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).</li><li>Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disguising+adult+neural+stem+cells.">Disguising adult neural stem cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).</li><li>Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+the+origin+of+gliomas.">Neural stem cells and the origin of gliomas.</a> New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).</li><li>Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glioblastoma. , (2017).</li><li>Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+within+the+tumor:+new+roles+for+axon+guidance+molecules+in+cancers.">The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).</li><li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells.">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).</li><li>Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+determines+the+caliber+of+dorsal+root+ganglion+neurons+in+culture.">Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).</li><li>Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+functional+Schwann+cells+and+neurons+from+normal+peripheral+nerve+tissue.">Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue.</a> Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).</li><li>Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+demyelination+by+Mycobacterium+leprae+in+the+absence+of+immune+cells.">Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells.</a> Science. 296 (5569), 927-931 (2002).</li><li>Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+receptor+tyrosine+kinase+signaling+mediates+early+demyelination+induced+by+leprosy+bacilli.">ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli.</a> Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation.">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li><li>Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+properties+of+human+adult+brain-derived+myelin+progenitor+cells.">Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells.</a> American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).</li><li>Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+glioma+cell+migration,+tumor+growth,+and+stemness+gene+expression+using+a+Lck+targeted+inhibitor.">Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor.</a> Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+glioma+cell+migration+on+collagen+and+astrocytes.">A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).</li><li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+three-dimensional+collagen+scaffolds+on+the+expression+profiles+and+biological+functions+of+glioma+cells.">Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells.</a> International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).</li><li>Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+and+pharmacological+regulation+of+glioblastoma+cell+migration+in+3D+matrices.">The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).</li><li>Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+in+vivo-like+plasticity+of+glioma+cell+invasion+along+blood+vessels+and+in+astrocyte-rich+stroma.">Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).</li><li>Gritsenko, P. G., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+adhesion+systems+mediate+glioma+cell+invasion+in+complex+environments.">Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments.</a> Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).</li><li>Kaur, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11,+a+marker+of+the+mesenchymal+phenotype,+regulates+glioblastoma+cell+migration+and+survival+in+vivo.">Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo.</a> Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+hydrogel+is+suitable+for+targeted+investigation+of+amoeboid+migration+of+glioma+cells.">Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).</li></ol>

Migrationsstudien für hGCs können mit Boyden-Kammersystemen oder Scratch-Assays durchgeführt werden. Während diese Experimente jedoch keine Informationen über die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit anderen umgebenden Geweben geben, kann das gegenwärtige System GC-Wechselwirkungen mit myelinierten und nicht myelinierten Fasern rekapitulieren. Darüber hinaus wurden zur Untersuchung der Tumorbildung und Endpunktmigration, organotypischer Scheibenkulturen des Nagetierhirns oder der In-vivo-Implantation von Gliomzell...

Glioblastom ist einer der aggressivsten und tödlichsten Tumoren des menschlichen Gehirns. Der aktuelle Standard der Behandlung umfasst die chirurgische Resektion des Tumors gefolgt von Strahlung1 plus gleichzeitige und adjuvante Verabreichung von Temozolomid2. Selbst mit diesem multitherapeutischen Ansatz ist ein Tumorrezidiv unvermeidlich3. Dies ist teilweise auf die ausgedehnte Migrationsnatur der Tumorzellen zurückzuführen, die in das Gehirnparenchym eindringen und mehrere fingerähnliche Projektionen innerhalb des Gehirns4 erzeugen, die eine vollständige Resektion unwahrscheinlich machen.
In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Aggressivität des Glioblastoms zum Teil auf das Vorhandensein einer Population von Krebsstammzellen innerhalb der Tumormasse5,6zurückzuführen ist, die ein hohes Migrationspotenzialaufweisen 7,8, Resistenz gegen Chemotherapie und Bestrahlung9,10 und die Fähigkeit, sekundäre Tumoren zu bilden11. GSCs sind in der Lage, ursprüngliche polyklonale Tumoren zu rekapitulieren, wenn xenografted zu nackten Mäusen5.
Trotz des Wissens über den genetischen Hintergrund von Glioblastomen werden Studien zur Gliomzellmigration (GC) derzeit durch einen Mangel an effizienten In-vitro- oder In-vivo-Migrationsmodellen behindert. Bemerkenswert ist, dass, während gliomzellaxonale Wechselwirkungen, moduliert durch zelluläre und Umweltfaktoren, ein Kernbestandteil der Gliominvasion sind, gibt es nach unserem Wissen derzeit kein experimentelles System mit der Fähigkeit, diese Wechselwirkungen zu modellieren12,13,14. Um diesen Mangel zu beheben, entwickelten wir ein ex vivo-Kultursystem von primären hGCs, die mit gereinigten DRG-Axon-Oligodendrozyten kokultiviert werden, was zu einer erhöhten Expression differenzierter Tumormarker sowie einer umfangreichen Migration und Interaktion von hGCs mit myelinierten und nicht myelinierten Fasern führt. Diese ex vivo-Plattform eignet sich aufgrund ihres unterteilten Layouts für die Erprobung der Auswirkungen neuartiger Therapeutika auf hGC-Migrationsmuster.,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5S NGF</td>
			<td>ENVIGO</td>
			<td>B.5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>Concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campenot Chamber</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>35mm X 10mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>30 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUDR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1190081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns plus tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ordinary forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Sprague Dawley Rat Pups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Rake</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrine Grease Applicator</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-GLSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures

Glioblastom ist eine der aggressivsten menschlichen Krebsarten aufgrund der umfangreichen zellulären Heterogenität und der Migrationseigenschaften von hGCs. Um die molekularen Mechanismen, die der Gliomzellmigration zugrunde liegen, besser zu verstehen, ist die Möglichkeit, die Wechselwirkung zwischen hGCs und Axonen innerhalb der Tumormikroumgebung zu untersuchen, unerlässlich. Um diese zelluläre Interaktion zu modellieren, haben wir ein Gemischtes Kultursystem entwickelt, das aus hGCs und dorsalen Wurzelganglien (DRG) Axon-Oligodendrozyten-Kokulturen besteht. DRG-Kulturen wurden ausgewählt, weil sie effizient isoliert werden können und die langen, umfangreichen Projektionen bilden können, die für Migrationsstudien dieser Art ideal sind. Gereinigte Rattenoligodendrozyten wurden dann auf gereinigten Ratten-DRG-Axonen zugegeben und zu Myelinat induziert. Nach der Bestätigung der Bildung von kompaktem Myelin wurden hGCs schließlich der Kokultur hinzugefügt und ihre Wechselwirkungen mit DRG-Axonen und Oligodendrozyten wurden in Echtzeit mittels Zeitraffermikroskopie überwacht. Unter diesen Bedingungen bilden hGCs tumorähnliche Aggregatstrukturen, die GFAP und Ki67 exprimieren, sowohl myelinierte als auch nicht myelinierte axonale Spuren migrieren und mit diesen Axonen durch die Bildung von Pseudopodien interagieren. Unser Ex-vivo-Cokultursystem kann verwendet werden, um neuartige zelluläre und molekulare Mechanismen der hGC-Migration zu identifizieren und könnte potenziell für In-vitro-Arzneimittel-Wirksamkeitstests verwendet werden.

Um die Wechselwirkung von hGCs mit Axonen zu untersuchen, erzeugten wir gereinigte DRG-Axone wie zuvor beschrieben15,16,17,18. Diese gereinigten DRG-Axone wurden dann mit hGCs gesät, die GFAP+/Ki67+ tumorähnliche Strukturen bildeten, die in das axonale Netzwerk integriert waren, während einzelne hGCs entweder in Assoziation oder zwischen den Axonen migrierten (Abbildung 2). ...

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Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Hier präsentieren wir ein ex-vivo gemischtes monolayer Kultursystem zur Erforschung der Migration menschlicher Gliomzellen (hGC) in Echtzeit. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen hGCs und myelinierten und nicht myelinierten Axonen innerhalb einer abgeteilten Kammer zu beobachten.

Echtzeit-Überwachung der Migration menschlicher Gliom-Zell auf Dorsalwurzel Ganglion Axon-Oligodendrozyten-Ko-Kulturen

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Dieses ex vivo Co-Kultursystem kann verwendet werden, um neuartige zelluläre und molekulare Mechanismen der Migration menschlicher Gliomzellen zu identifizieren und könnte potenziell für In-vitro-Arzneimittel-Wirksamkeitstests verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Wechselwirkungen zwischen menschlichen Glioblastomzellen und Axonen in Echtzeit zu untersuchen. Demonstrieren sie das Verfahren wird John Zepecki, ein Student aus meinem Labor.Um fachkundige Kulturgerichte zusammenzubauen, verdünnen Sie die Kollagen-Lagerlösung auf 500 Mikrogramm pro Milliliter in sterilem destilliertem Wasser und mischen Sie sie gründlich. Mit einer sterilen Transferpipette eine 35 Millimeter große Kulturschale mit zwei Millilitern der verdünnten Kollagenlösung füllen. Dann leicht kippen Sie die Schale und entfernen Sie die Lösung einen dünnen Film von Kollagen zurück.Geben Sie die Lösung in die nächste 35-Millimeter-Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie bei Bedarf weitere Kollagenlösung hinzufügen, bis alle Gerichte beschichtet sind. Um das Kollagen in einer laminaren Strömungshaube zu polymerisieren, nasse Gazepads mit drei Millilitern konzentriertem Ammoniumhydroxid und bedecken sie die Schalen für 15 Minuten.Entfernen Sie Gaze-Pads und lassen Sie die 35-Millimeter-Geschirr trocknen. Als Nächstes verwenden Sie eine Metalldatei, um den Punkt einer 18-Spur-Nadel zu speichern, um eine stumpfe Spitze zu machen. Die Nadel in 70% Ethanol einweichen, um sie zu sterilisieren.Tragen Sie Silikonfett auf die Unterseite der Fachkammer auf. Stellen Sie sicher, dass das Fett sauber platziert ist und sich an allen Ecken überlappt. Diese Technik kann sehr anspruchsvoll sein, daher empfehlen wir Ihnen, sich zusätzliche Zeit zu nehmen, um die richtige Menge fett zu üben, bevor Sie die einteilen Kammern aufstellen, um ein hervorragendes Wachstum zu gewährleisten.Es ist auch sehr wichtig, langsam zu arbeiten. Richten Sie mehr Kammern ein, als Sie denken, damit Sie Extras haben, sollte etwas schief gehen. Entfernen Sie den Deckel von einer 35-Millimeter-Schale, invertieren Sie die Schale und legen Sie die Kratzer über die Kammer.Tippen Sie vorsichtig mit einem Paar Zangen auf die Unterseite der Schale. Wenn Sie die Fettkammern auf die Schale auftragen, tippen Sie nicht zu hart. Andernfalls können die Axone nicht in die angrenzende Kammer hineinwachsen.Verwenden Sie die hämostatischen Zangen, um die Schale sanft umzudrehen. Lassen Sie die Zange los. Legen Sie einen Fetthaufen an die Basis des Mittelfachs.Füllen Sie jede Kammer mit ergänzten neuronalen Basalmedium. Prüfen Sie bei Bedarf auf Leckagen und Dichtungslecks mit Silikonfett. Setzen Sie die Montage aller Kulturgerichte fort und lagern Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Die fachliche Kammer ermöglicht die Verwendung verschiedener pharmakologischer Reagenzien sowie die Möglichkeit, Ergebnisse zwischen zwei Brunnen auf derselben Platte zu vergleichen und zu kontrastieren. Um die vorbereiteten Kulturen zu säen, die eine GBM-Neurosphäre enthalten, ersetzen Sie zuerst das Medium durch ergänzte NBF, die 10%FBS in jeder distalen Kammer enthalten. Als nächstes, mit einer P20 Pipette auf 10 Mikroliter eingestellt, ziehen Sie eine GBM Neurosphäre aus der Kulturschale.Legen Sie die Spitze der Pipette in die distale Kammer, die der Mittelkammer am nächsten liegt, ohne das Axon zu berühren, und vertreiben Sie die GBM-Neurosphäre langsam, so dass sie sanft auf die Axone fällt. Lassen Sie die Kultur im Biosicherheitsschrank für eine Stunde bei Raumtemperatur, damit die GBM-Neurosphäre befestigt werden kann. Diese Methode könnte verwendet werden, um pharmakologische Verbindungen für die Behandlung von Hirntumoren zu testen.Diese Methode könnte auch auf andere Erkrankungen des peripheren und zentralen Nervensystems wie demyelinierende Neuropathien und Multiple Sklerose angewendet werden. In diesem Protokoll wurden gereinigte DRG-Axone mit HCGs gesät, die doppelt positive GFAP- und KI67-tumorähnliche Strukturen bildeten, die in das axonale Netzwerk integriert waren, die durch die roten Tumormarker GFAP angezeigt wurden, während einzelne HGCs, die das grüne fluoreszierende Protein exezieren, entweder in Verbindung oder zwischen den Axonen migrierten. Die Zugabe von HGCs an den myelinierten DRG-Oligodendrozyten-Kokulturen zeigte, dass HGCs in Verbindung mit den rot gebeizten myelinierten Axonen wandern und durch die Bildung von Pseudopodien von der Tumormasse weg wandern.Sobald diese Technik perfektioniert wurde, konnten wir sie nutzen, um die Migration menschlicher GBM-Stammzellen in Echtzeit zu untersuchen. Wir waren auch in der Lage, Effekte auf die Zellmigration nach Zugabe von neuartigen therapeutischen kleinen Molekülinhibitoren zu untersuchen. Die GBM-Kugel, die in eine myelinierte Oligodendrozyten-DRG-Axonkultur eindringt, wird hier gezeigt.Das hier beschriebene Protokoll könnte als Grundlage für andere biomimetische dreidimensionale Ex-vivo-Systeme dienen, die die Auswirkungen neuartiger Arzneimittelbehandlungen bewerten sollen. Beim Umgang mit vom Menschen abgeleiteten Zellen sollte man immer Vorsicht walten lassen. Entsprechende PSA sollten getragen und blutübertragene Krankheitserreger-Schulungen abgeschlossen werden, damit man die Risiken der Arbeit mit patientenabgeleiteten Geweben versteht.Ammoniumhydroxid sollte mit Vorsicht behandelt werden und Sie sollten Handschuhe, einen Labormantel tragen und in einer Kapuze arbeiten, um eine Exposition gegenüber dieser Chemikalie zu verhindern.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Forschung

Krebsforschung

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

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Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

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Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

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Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

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Time-Lapse 2D Imaging der phagozytischen Aktivität in M1 Macrophage-4T1 Maus-Mammary Karzinom-Zellen in Kokulturen

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