Name: real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures
Uploaded: 2019-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

この研究は、ブラウン大学脳神経外科の内部資金によって支援されました。

患者由来ヒトグリオーマ細胞の採取、単離、伝播のためのプロトコルは、ロードアイランド病院のIRB委員会によって承認された。すべての動物は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って維持されました。すべての動物使用プロトコルは、ロードアイランド病院の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. メディアおよびバッファの準備
<ol><li>...

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Stupp, R., Weber, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+radio-+and+chemotherapy+in+glioblastoma.">The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma.</a> Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).</li><li>Wick, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+inhibition:+emerging+molecular+targets+for+treating+glioblastoma.">Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).</li><li>Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disguising+adult+neural+stem+cells.">Disguising adult neural stem cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).</li><li>Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+the+origin+of+gliomas.">Neural stem cells and the origin of gliomas.</a> New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).</li><li>Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glioblastoma. , (2017).</li><li>Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+within+the+tumor:+new+roles+for+axon+guidance+molecules+in+cancers.">The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).</li><li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells.">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).</li><li>Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+determines+the+caliber+of+dorsal+root+ganglion+neurons+in+culture.">Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).</li><li>Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+functional+Schwann+cells+and+neurons+from+normal+peripheral+nerve+tissue.">Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue.</a> Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).</li><li>Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+demyelination+by+Mycobacterium+leprae+in+the+absence+of+immune+cells.">Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells.</a> Science. 296 (5569), 927-931 (2002).</li><li>Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+receptor+tyrosine+kinase+signaling+mediates+early+demyelination+induced+by+leprosy+bacilli.">ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli.</a> Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation.">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li><li>Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+properties+of+human+adult+brain-derived+myelin+progenitor+cells.">Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells.</a> American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).</li><li>Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+glioma+cell+migration,+tumor+growth,+and+stemness+gene+expression+using+a+Lck+targeted+inhibitor.">Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor.</a> Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+glioma+cell+migration+on+collagen+and+astrocytes.">A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).</li><li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+three-dimensional+collagen+scaffolds+on+the+expression+profiles+and+biological+functions+of+glioma+cells.">Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells.</a> International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).</li><li>Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+and+pharmacological+regulation+of+glioblastoma+cell+migration+in+3D+matrices.">The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).</li><li>Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+in+vivo-like+plasticity+of+glioma+cell+invasion+along+blood+vessels+and+in+astrocyte-rich+stroma.">Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).</li><li>Gritsenko, P. G., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+adhesion+systems+mediate+glioma+cell+invasion+in+complex+environments.">Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments.</a> Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).</li><li>Kaur, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11,+a+marker+of+the+mesenchymal+phenotype,+regulates+glioblastoma+cell+migration+and+survival+in+vivo.">Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo.</a> Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+hydrogel+is+suitable+for+targeted+investigation+of+amoeboid+migration+of+glioma+cells.">Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).</li></ol>

hGCの移行研究は、ボイデンチャンバーシステムまたはスクラッチアッセイを使用して行うことができる。しかしながら、これらの実験は、腫瘍細胞と他の周囲組織との相互作用に関する情報を与えることができないが、本系は、骨髄化および非骨髄性繊維とのGC相互作用を再現することができる。さらに、腫瘍形成および終点移動を研究するために、げっ歯類脳の組織学的スライス培養物ま?...

神経膠芽腫は、人間の脳の最も積極的で致死的な腫瘍の一つです。現在の治療基準は、腫瘍の外科的切除に続いて、放射線1プラステモゾロミド2の付随およびアジュバント投与を含む。この多治療的アプローチであっても、腫瘍の再発は避けられない3.これは、完全な切除を行う可能性が低い脳4内に複数の指状の突起を作成する脳の毛腫に侵入する腫瘍細胞の広範な移動性によるものである。
近年、神経膠芽腫の攻撃性は、部分的には、腫瘍塊5、6内の癌幹細胞の集団の存在に起因していることが明らかになり、高い回遊性電位を示す7、8、化学療法および放射線9、10および二次腫瘍11を形成する能力を示す。GSCは、ヌードマウス5に異種移植された場合に元のポリクローナル腫瘍を再現することができる。
神経膠芽腫の遺伝的背景に関する豊富な知識にもかかわらず、グリオーマ細胞(GC)移行に関する研究は、現在、効率的なインビトロまたはインビボ移行モデルの欠如によって妨げられます。特に、細胞および環境因子によって調節される神経膠腫細胞軸索相互作用はグリオーマ浸潤の中核的な構成要素であるが、我々の知る限りでは、これらの相互作用をモデル化する能力を有する実験システムは現在存在しない12、13、14である。この欠乏に対処するために、精製されたDRG軸索オリゴデンドロサイトと共培養した一次hGCのex vivo培養システムを開発し、分化した腫瘍マーカーの発現の上昇、ならびに筋リチン化および非骨髄性繊維とのhGCの広範な移行および相互作用をもたらす。このex vivoプラットフォームは、その区画化されたレイアウトのために、hGC移行パターンに対する新規治療の効果をテストするのに適しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5S NGF</td>
			<td>ENVIGO</td>
			<td>B.5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>Concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campenot Chamber</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>35mm X 10mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>30 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUDR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1190081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns plus tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ordinary forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Sprague Dawley Rat Pups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Rake</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrine Grease Applicator</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-GLSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures

神経膠芽腫は、広範な細胞不均一性およびhGCの移行特性による最も積極的なヒト癌の1つである。グリオーマ細胞遊走の基礎となる分子機構をより深く理解するためには、腫瘍微小環境内のhGCと軸索との相互作用を研究する能力が不可欠である。この細胞相互作用をモデル化するために、hGCと後根神経節(DRG)軸索オリゴデンドロサイト共培養からなる混合培養システムを開発しました。DRG培養は、効率的に隔離することができ、この性質の移行研究に最適な長く広範な突起を形成することができるので選択されました。精製されたラットオリゴデンドロサイトを精製ラットDRG軸索に添加し、骨髄ネートに誘導した。コンパクトミエリンの形成を確認した後、hGCを最終的に共培養に加え、DRG軸索およびオリゴデンドロサイトとの相互作用をタイムラプス顕微鏡を用いてリアルタイムでモニタリングした。これらの条件下で、hGCはGFAPおよびKi67を発現する腫瘍様凝集体構造を形成し、骨髄化軸索および非骨髄性軸索トラックの両方に沿って移動し、擬似ポジアの形成を通じてこれらの軸索と相互作用する。当社のex vivo共培養システムは、hGC移行の新しい細胞および分子メカニズムを同定するために使用することができ、潜在的にインビトロ薬効性試験に使用することができます。

軸索とのhGCの相互作用を調べるために、前述の15、16、17、18に従って精製されたDRG軸索を生成した。これらの精製されたDRG軸索は、軸索ネットワーク内に統合されたGFAP+/Ki67+腫瘍様構造を形成したhGCで播種され、個々のhGCはアキソン間または軸索間で移行した(図2)。hGCが骨髄化軸索と?...

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Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

ここでは、ヒトグリオーマ細胞(hGC)移行をリアルタイムで研究するためのex-vivo混合単層培養システムを提示する。このモデルは、区画化されたチャンバー内のhGCと骨髄化した軸索と非骨髄化軸の間の相互作用を観察する能力を提供する。

後根神経節軸軸索-オリゴデンドロサイト共培養におけるヒトグリオーマ細胞移動のリアルタイムモニタリング

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

このex vivo共培養システムは、ヒトグリオーマ細胞遊走の新しい細胞および分子機構を同定するために使用することができ、インビトロ薬有効性試験に使用される可能性がある。この技術の主な利点は、ヒト神経膠芽腫細胞と軸索の相互作用をリアルタイムで研究する能力である。この手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の大学院生であるジョン・ゼペリです。コンパートメントされた培養皿を組み立てるには、無菌蒸留水中の1ミリリットル当たり500マイクログラムにコラーゲンストック溶液を希釈し、十分に混ぜます。滅菌移管ピペットで、希釈したコラーゲン溶液の2ミリリットルで35ミリメートル培養皿を充填します。その後、皿を少し傾け、後ろにコラーゲンの薄いフィルムを残して溶液を取り除きます。次の35ミリメートル皿に溶液を分配します。このプロセスを繰り返し、必要に応じてすべての料理がコーティングされるまでコラーゲン溶液を追加します。コラーゲンを重合するために、ラミナルフローフードで、水酸化アンモニウムアンモニウムを3ミリリットルで濡れたガーゼパッドで、トレイを15分間覆う。ガーゼパッドを取り外し、35ミリメートルの皿を乾燥させます。次に、金属ファイルを使用して18ゲージ針のポイントを取り除き、鈍い先端を作ります。70%エタノールに針を浸して滅菌します。コンパートメントされたチャンバーの底部にシリコーングリースを塗布します。グリスがきれいに配置され、すべてのコーナーで重なっていることを確認します。この技術は非常に困難な場合があるので、優れた成長を確実にするために、コンパートメントされたチャンバーを設定する前に、適切な量のグリースを適用する練習に余分な時間を要することをお勧めします。ゆっくり働くことも非常に重要です。あなたが何かがうまくいかない場合にエキストラを持っているので、あなたが必要と思うよりも多くの部屋を設定します。35ミリメートル皿から蓋を取り出し、皿を反転させ、部屋の上に傷を置きます。皿の底を軽くタップして鉗子を付きます。グリースチャンバーを皿に塗布する際は、強くたたすぎないでください。それ以外の場合、軸索は隣接するチャンバーの下に成長することはできません。静血鉗子を使用して、皿をひっくり返します。鉗子を解放する。中央コンパートメントの基部にグリースのマウンドを置きます。各チャンバーに補い付けられた神経基底核培地を充填します。必要に応じて、シリコーングリースで漏れやシール漏れを確認します。すべての文化料理を組み立て続け、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩保管してください。コンパートメントされた部屋は異なった薬理学的試薬の使用および同じ版の2つの井戸間の結果を比較し、対比する機能を可能にする。GBM神経球を含む調製された培養物をシードするには、まず各遠位コンパートメントチャンバに10%FBSを含む補充されたNBFで培地を交換する。次に、P20ピペットを10マイクロリットルにセットして、培養皿から1GBM神経球を引き出す。軸索に触れることなく、中心室に最も近い遠位チャンバーにピペットの先端を置き、GBM神経球をゆっくりと排出して、軸索にそっと落ちるようにします。GBM神経球が付着できるように、培養液を常温で1時間、バイオセーフティキャビネットに残します。この方法は、脳腫瘍の治療のための薬理学的化合物をテストするために使用することができます。この方法は、脱髄性神経障害および多発性硬化症などの末梢および中枢神経系の他の疾患にも適用することができる。このプロトコルでは、精製されたDRG軸索に、赤い腫瘍マーカーGFAPによって示された軸索ネットワーク内に統合された二重陽性GFAPおよびKI67腫瘍様構造を形成するHCGを播種し、緑色蛍光タンパク質を発現する個々のHGCは関連または軸索間で移動した。髄膜化されたDRGオリゴデンドロシテの共培養物にHGCを添加すると、HGCは赤い染色されたミエリン軸索と関連して移動し、疑似ポディアの形成を通じて腫瘍塊から離れて移動することを示した。この技術が完成すると、ヒトGBM幹細胞の移動をリアルタイムで研究することができました。また、新しい治療用低分子阻害剤を添加した後の細胞遊びへの影響を研究することができました。髄膜化されたオリゴデンドロシテDRG軸索培養物に侵入するGBM球をここに示す。ここで説明するプロトコルは、新しい薬物治療の効果を評価するために設計された他のバイオミメティック3次元ex vivoシステムの基礎として役立つ可能性があります。人間由来の細胞を扱うときは、常に注意を払う必要があります。適切なPPEを着用し、血液媒介病原体のトレーニングを完了して、患者由来の組織で作業するリスクを理解する必要があります。水酸化アンモニウムは注意して取り扱う必要があり、手袋、ラボコートを着用し、この化学物質への暴露を防ぐためにフードで作業する必要があります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

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Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

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