Name: real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures
Uploaded: 2019-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por fondos internos del Departamento de Neurocirugía de la Universidad De Brown a N.T.

Los protocolos para la recolección, aislamiento y propagación de células de glioma humano derivadas del paciente fueron aprobados por el comité de IRB del Hospital Rhode Island. Todos los animales fueron mantenidos de acuerdo con la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los protocolos de uso de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Rhode Island.
1. Preparaciones de medios y tampón
<ol><li>Pr...

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Stupp, R., Weber, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+radio-+and+chemotherapy+in+glioblastoma.">The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma.</a> Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).</li><li>Wick, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+inhibition:+emerging+molecular+targets+for+treating+glioblastoma.">Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).</li><li>Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disguising+adult+neural+stem+cells.">Disguising adult neural stem cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).</li><li>Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+the+origin+of+gliomas.">Neural stem cells and the origin of gliomas.</a> New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).</li><li>Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glioblastoma. , (2017).</li><li>Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+within+the+tumor:+new+roles+for+axon+guidance+molecules+in+cancers.">The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).</li><li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells.">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).</li><li>Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+determines+the+caliber+of+dorsal+root+ganglion+neurons+in+culture.">Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).</li><li>Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+functional+Schwann+cells+and+neurons+from+normal+peripheral+nerve+tissue.">Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue.</a> Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).</li><li>Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+demyelination+by+Mycobacterium+leprae+in+the+absence+of+immune+cells.">Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells.</a> Science. 296 (5569), 927-931 (2002).</li><li>Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+receptor+tyrosine+kinase+signaling+mediates+early+demyelination+induced+by+leprosy+bacilli.">ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli.</a> Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation.">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li><li>Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+properties+of+human+adult+brain-derived+myelin+progenitor+cells.">Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells.</a> American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).</li><li>Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+glioma+cell+migration,+tumor+growth,+and+stemness+gene+expression+using+a+Lck+targeted+inhibitor.">Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor.</a> Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+glioma+cell+migration+on+collagen+and+astrocytes.">A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).</li><li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+three-dimensional+collagen+scaffolds+on+the+expression+profiles+and+biological+functions+of+glioma+cells.">Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells.</a> International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).</li><li>Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+and+pharmacological+regulation+of+glioblastoma+cell+migration+in+3D+matrices.">The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).</li><li>Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+in+vivo-like+plasticity+of+glioma+cell+invasion+along+blood+vessels+and+in+astrocyte-rich+stroma.">Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).</li><li>Gritsenko, P. G., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+adhesion+systems+mediate+glioma+cell+invasion+in+complex+environments.">Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments.</a> Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).</li><li>Kaur, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11,+a+marker+of+the+mesenchymal+phenotype,+regulates+glioblastoma+cell+migration+and+survival+in+vivo.">Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo.</a> Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+hydrogel+is+suitable+for+targeted+investigation+of+amoeboid+migration+of+glioma+cells.">Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).</li></ol>

Los estudios de migración para hGCs se pueden realizar mediante el uso de sistemas de cámara Boyden o ensayos de arañazos. Sin embargo, mientras que estos experimentos no proporcionan ninguna información sobre las interacciones de las células tumorales con otros tejidos circundantes, el sistema actual puede recapitular las interacciones de GC con fibras mielinadas y no mielinizadas. Además, para estudiar la formación de tumores y la migración de punto final, cultivos de rodajas organotípicas del cerebro de roedo...

El glioblastoma es uno de los tumores más agresivos y letales del cerebro humano. El estándar actual de atención incluye la resección quirúrgica del tumor seguida de la radiación1 más la administración concomitante y adyuvante de temozolomida2. Incluso con este enfoque multiterapéutico, la recurrencia tumoral es inevitable3. Esto se debe en parte a la naturaleza migratoria extensa de las células tumorales, que invaden el parénquima cerebral creando múltiples proyecciones similares a los dedos dentro del cerebro4 que hacen improbable la resección completa.
En los últimos años, se ha puesto de manifiesto que la agresividad del glioblastoma se debe, en parte, a la presencia de una población de células madre cancerosas dentro de la masa tumoral5,6,que presentan un alto potencial migratorio7,8,resistencia a la quimioterapia y la radiación9,10 y la capacidad de formar tumores secundarios11. Los SSG son capaces de recapitular tumores policlonales originales cuando se xenoinjertan en ratones desnudos5.
A pesar de la riqueza de conocimientos sobre los antecedentes genéticos de los glioblastomas, los estudios sobre la migración de células gliomas (GC) se ven obstaculizados actualmente por la falta de modelos eficientes de migración in vitro o in vivo. En particular, mientras que las interacciones célula-axonal glioma moduladas por factores celulares y ambientales son un componente central de la invasión del glioma, hasta nuestro conocimiento actualmente no existe un sistema experimental con la capacidad de modelar estas interacciones12,13,14. Para hacer frente a esta deficiencia, desarrollamos un sistema de cultivo ex vivo de hGCs primarios co-cultivados con axon-oligodendrocitos DRG purificados que resulta en la expresión elevada de marcadores tumorales diferenciados, así como una amplia migración e interacción de hGCs con fibras mielinadas y no mielinizadas. Esta plataforma ex vivo, debido a su disposición compartimentada, es adecuada para probar los efectos de las nuevas terapias en los patrones de migración de hGC.,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5S NGF</td>
			<td>ENVIGO</td>
			<td>B.5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>Concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campenot Chamber</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>35mm X 10mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>30 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUDR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1190081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns plus tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ordinary forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Sprague Dawley Rat Pups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Rake</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrine Grease Applicator</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-GLSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures

El glioblastoma es uno de los cánceres humanos más agresivos debido a la extensa heterogeneidad celular y las propiedades migratorias de los hGCs. Con el fin de comprender mejor los mecanismos moleculares subyacentes a la migración de células glioma, es esencial una capacidad para estudiar la interacción entre los hGCs y los axones dentro del microambiente tumoral. Con el fin de modelar esta interacción celular, desarrollamos un sistema de cultivo mixto que consiste en hGCs y ganglios de raíz dorsal (DRG) co-cultivos de axondrocitos. Las culturas DRG fueron seleccionadas porque pueden ser aisladas eficientemente y pueden formar las proyecciones largas y extensas que son ideales para estudios migratorios de esta naturaleza. Luego se añadieron oligodendrocitos de rata purificados en axones DRG de rata purificada e inducidos a mielinato. Después de confirmar la formación de mielina compacta, los hG ctuó finalmente se añadieron al cocultivo y sus interacciones con axones DRG y oligodendrocitos fueron monitoreados en tiempo real usando microscopía de lapso de tiempo. En estas condiciones, los hGCs forman estructuras agregadas similares a tumores que expresan GFAP y Ki67, migran a lo largo de pistas axonales mielinadas y no mielinizadas e interactúan con estos axones a través de la formación de pseudopodia. Nuestro sistema de cocultivo ex vivo se puede utilizar para identificar nuevos mecanismos celulares y moleculares de la migración de hGC y podría utilizarse potencialmente para pruebas in vitro de eficacia de fármacos.

Con el fin de estudiar la interacción de hGCs con axons, generamos axónDRes DRG purificados como se describió anteriormente15,16,17,18. Estos axones DRG purificados fueron sembrados con hGCs, que formaron estructuras tipo tumor GFAP+/Ki67+ integradas dentro de la red axonal, mientras que los hCC individuales migraron en asociación o entre los axones (Figura 2). Para determi...

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Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Este sistema de co-cultivo ex vivo se puede utilizar para identificar nuevos mecanismos celulares y moleculares de la migración de células de glioma humano y podría ser utilizado potencialmente para pruebas de eficacia de fármacos in vitro. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar las interacciones entre las células humanas del glioblastoma y los axones en tiempo real. Demostrando el procedimiento estará John Zepecki, un estudiante graduado de mi laboratorio.Para ensamblar platos de cultivo enpartados, diluir la solución de colágeno a 500 microgramos por mililitro en agua destilada estéril y mezclar bien. Con una pipeta de transferencia estéril, llene un plato de cultivo de 35 milímetros con dos mililitros de la solución de colágeno diluida. A continuación, incline ligeramente el plato y retire la solución dejando atrás una fina película de colágeno.Dispensar la solución en el siguiente plato de 35 milímetros. Repita este proceso, añadiendo más solución de colágeno según sea necesario hasta que todos los platos hayan sido recubiertos. Para polimerizar el colágeno, en una campana de flujo laminar, las almohadillas húmedas de gasa con tres mililitros de hidróxido de amonio concentrado y cubrir las bandejas durante 15 minutos.Retire las gasas y deje que los platos de 35 milímetros se sequen. A continuación, utilice un archivo de metal para archivar el punto de una aguja de calibre 18 para hacer una punta contundente. Remoje la aguja en 70%etanol para esterilizar.Aplique grasa de silicona en la parte inferior de la cámara compartida. Asegúrese de que la grasa esté bien colocada y se superponga en todas las esquinas. Esta técnica puede ser muy difícil, por lo que le sugerimos que se tome más tiempo para practicar la aplicación de la cantidad correcta de grasa antes de configurar las cámaras compartidas con el fin de garantizar un excelente crecimiento.También es muy importante trabajar lentamente. Configura más cámaras de las que crees que necesitarás para que tengas extras en caso de que algo salga mal. Retire la tapa de un plato de 35 milímetros, invierta el plato y coloque los arañazos sobre la cámara.Toque hacia abajo en la parte inferior del plato suavemente con un par de fórceps. Al aplicar las cámaras de grasa en el plato, no toque demasiado fuerte. De lo contrario, los axones no podrán crecer debajo de la cámara adyacente.Use los fórceps hemostáticos para voltear suavemente el plato. Suelta los fórceps. Coloque un montículo de grasa en la base del compartimiento central.Llene cada cámara con un medio basal neuronal suplementado. Compruebe si hay fugas y selle las fugas con grasa de silicona según sea necesario. Continúe ensamblando todos los platos de cultivo y almacene durante la noche a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.La cámara compartida permite el uso de diferentes reactivos farmacológicos, así como la capacidad de comparar y contrastar los resultados entre dos pozos en la misma placa. Para sembrar los cultivos preparados que contienen una neuroesfera GBM, primero reemplace el medio con NBF suplementado que contiene 10%FBS en cada cámara compartida distal. A continuación, con una pipeta P20 establecida en 10 microlitros, extraiga una neuroesfera GBM del plato de cultivo.Coloque la punta de la pipeta en la cámara distal más cercana a la cámara central sin tocar el axón y expulse lentamente la neurosfera GBM para que caiga suavemente sobre los axones. Deje el cultivo en el gabinete de bioseguridad durante una hora a temperatura ambiente para permitir que la neurosfera GBM se adjunte. Este método podría utilizarse para probar compuestos farmacológicos para el tratamiento de tumores cerebrales.Este método también podría aplicarse a otras enfermedades del sistema nervioso periférico y central como las neuropatías desmielinizantes y la esclerosis múltiple. En este protocolo, se sembraron a los axones DRG purificados con HCG que formaron estructuras de doble positivo GFAP y KI67 similares a tumores integradas dentro de la red axonal indicada por los marcadores tumorales rojos GFAP, mientras que los HGC individuales expresaron la proteína fluorescente verde migrada ya sea en asociación o entre los axones. La adición de HGCs en las coculturas mielinadas de oligodendrocitos DRG mostró que los HGCs migran en asociación con los axones mielinados teñidos de rojo y lejos de la masa tumoral a través de la formación de pseudopodia.Una vez perfeccionada esta técnica, pudimos utilizarla para estudiar la migración de células madre GBM humanas en tiempo real. También pudimos estudiar los efectos sobre la migración celular después de la adición de nuevos inhibidores terapéuticos de moléculas pequeñas. Aquí se muestra la esfera GBM que invade una cultura de axón DRG de oligodendrocitos mielinado.El protocolo descrito aquí podría servir como base para otros sistemas biomiméticos tridimensionales ex vivo diseñados para evaluar los efectos de nuevos tratamientos farmacológicos. Siempre se debe tener cuidado al manipular células derivadas del ser humano. Se debe usar un EPP adecuado y completar la formación de patógenos transmitidos por la sangre para que se comprenda los riesgos de trabajar con tejidos derivados del paciente.El hidróxido de amonio debe manipularse con cuidado y debe usar guantes, una capa de laboratorio y trabajar en una capucha para evitar la exposición a este producto químico.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

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Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Suero y Plasma copia número detección mediante PCR en tiempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Evaluación de biomarcadores en Glioma por Immunohistochemistry en parafina-encajado 3D Glioma desarrolló culturas

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Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

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A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

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