Name: real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures
Uploaded: 2019-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

Detta arbete stöddes av interna medel från Institutionen för neurokirurgi, Brown University till N.T.

Protokollen för insamling, isolering, och förökning av patient-derived humana gliom celler godkändes av IRB kommittén för Rhode Island Hospital. Alla djur upprätthölls enligt NIH-guiden för skötsel och användning av försöksdjur. Alla djur användnings protokoll godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Rhode Island Hospital.
1. media och buffertpreparat
<ol><li>Förbered 50 mL av Neurosphere media: 1x neuronal basal medium w/o vitamin A, 1x ser...

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Stupp, R., Weber, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+radio-+and+chemotherapy+in+glioblastoma.">The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma.</a> Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).</li><li>Wick, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+inhibition:+emerging+molecular+targets+for+treating+glioblastoma.">Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).</li><li>Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disguising+adult+neural+stem+cells.">Disguising adult neural stem cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).</li><li>Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+the+origin+of+gliomas.">Neural stem cells and the origin of gliomas.</a> New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).</li><li>Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glioblastoma. , (2017).</li><li>Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+within+the+tumor:+new+roles+for+axon+guidance+molecules+in+cancers.">The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).</li><li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells.">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).</li><li>Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+determines+the+caliber+of+dorsal+root+ganglion+neurons+in+culture.">Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).</li><li>Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+functional+Schwann+cells+and+neurons+from+normal+peripheral+nerve+tissue.">Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue.</a> Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).</li><li>Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+demyelination+by+Mycobacterium+leprae+in+the+absence+of+immune+cells.">Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells.</a> Science. 296 (5569), 927-931 (2002).</li><li>Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+receptor+tyrosine+kinase+signaling+mediates+early+demyelination+induced+by+leprosy+bacilli.">ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli.</a> Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation.">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li><li>Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+properties+of+human+adult+brain-derived+myelin+progenitor+cells.">Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells.</a> American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).</li><li>Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+glioma+cell+migration,+tumor+growth,+and+stemness+gene+expression+using+a+Lck+targeted+inhibitor.">Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor.</a> Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+glioma+cell+migration+on+collagen+and+astrocytes.">A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).</li><li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+three-dimensional+collagen+scaffolds+on+the+expression+profiles+and+biological+functions+of+glioma+cells.">Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells.</a> International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).</li><li>Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+and+pharmacological+regulation+of+glioblastoma+cell+migration+in+3D+matrices.">The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).</li><li>Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+in+vivo-like+plasticity+of+glioma+cell+invasion+along+blood+vessels+and+in+astrocyte-rich+stroma.">Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).</li><li>Gritsenko, P. G., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+adhesion+systems+mediate+glioma+cell+invasion+in+complex+environments.">Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments.</a> Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).</li><li>Kaur, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11,+a+marker+of+the+mesenchymal+phenotype,+regulates+glioblastoma+cell+migration+and+survival+in+vivo.">Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo.</a> Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+hydrogel+is+suitable+for+targeted+investigation+of+amoeboid+migration+of+glioma+cells.">Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).</li></ol>

Migrationsstudier för hGCs kan utföras med hjälp av Boyden kammar system eller Scratch analyser. Men medan dessa experiment misslyckas med att ge någon information om samspelet mellan tumörceller med andra omgivande vävnader, kan det nuvarande systemet recapitulate GC interaktioner med myeliniserade och icke-myeliniserade fibrer. Vidare, för att studera tumör bildning och slutpunkts migration, organotypic slice kulturer av gnagare hjärnan eller in vivo implantation av gliom celler i gnagare hjärnan eller flanke...

Glioblastoma är en av de mest aggressiva och dödliga tumörer i den mänskliga hjärnan. Den nuvarande standarden på vården inkluderar kirurgisk resektion av tumören följt av strålning1 plus samtidig och adjuvant administrering av temozolomid2. Även med denna multi-terapeutiska tillvägagångssätt, tumör upprepning är oundvikligt3. Detta beror delvis på den omfattande flyttande natur tumörceller, som invaderar hjärnparenkymet skapa flera finger-liknande projektioner i hjärnan4 som gör fullständig resektion osannolikt.
Under de senaste åren har det blivit uppenbart att aggressivitet glioblastoma beror delvis på närvaron av en population av cancer stamceller inom tumör massan5,6, som uppvisar hög migrations potential7,8, resistens mot kemoterapi och strålning9,10 och förmågan att bilda sekundära tumörer11. GSCs kan rekapitulera ursprungliga polyklonala tumörer när xenografted till naken möss5.
Trots den rikedom av kunskap om den genetiska bakgrunden av glioblastomas, studier på gliom cell (GC) migration hindras för närvarande av brist på effektiva in vitro-eller in vivo migration modeller. Särskilt, medan gliom cell-axonal interaktioner modulerad av cellulära och miljömässiga faktorer är en kärnkomponent i gliom invasion, till vår kännedom finns det för närvarande inget experimentellt system med förmågan att modellera dessa interaktioner12,13,14. För att åtgärda denna brist utvecklade vi ett ex vivo kultur system av primära hgcs Co-odlade med renade DRG Axon-oligodendrocyter som resulterar i förhöjda uttryck av differentierade tumörmarkörer samt omfattande migration och interaktion av hgcs med myelinerade och icke-myeliniserade fibrer. Denna ex vivo plattform, på grund av dess uppdelade layout, är lämplig för att testa effekterna av nya Therapeutics på hGC migrationsmönster.,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5S NGF</td>
			<td>ENVIGO</td>
			<td>B.5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>Concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campenot Chamber</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>35mm X 10mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>30 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUDR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1190081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns plus tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ordinary forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Sprague Dawley Rat Pups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Rake</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrine Grease Applicator</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-GLSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures

Glioblastom är en av de mest aggressiva mänskliga cancerformer på grund av omfattande cellulära heterogenitet och migration egenskaper hGCs. För att bättre förstå molekylära mekanismer bakom gliom cell migration, en förmåga att studera samspelet mellan hgcs och axoner inom tumören mikromiljö är viktigt. För att modellera denna cellulära interaktion, utvecklade vi ett blandat kultur system bestående av hGCs och dorsala root ganglier (DRG) Axon-oligodendrocyte Co-kulturer. DRG kulturer valdes eftersom de kan isoleras effektivt och kan bilda de långa, omfattande prognoser som är idealiska för migration studier av detta slag. Renade råtta oligodendrocyter lades sedan på renade råtta DRG axoner och inducerade till myelinat. Efter att ha bekräftat bildandet av kompakta myelin, var hGCs slutligen till samkulturen och deras interaktioner med DRG axoner och oligodendrocyter övervakades i realtid med hjälp av Time-lapse mikroskopi. Under dessa förhållanden, hgcs bilda tumör-liknande aggregerade strukturer som uttrycker gfap och Ki67, migrera längs både myeliniserade och icke-myeliniserade axonala spår och interagera med dessa axoner genom bildandet av pseudopodia. Vårt ex vivo Co-Culture-system kan användas för att identifiera nya cellulära och molekylära mekanismer för hGC-migration och kan potentiellt användas för in vitro-testning av läkemedels effekt.

För att studera interaktionen mellan hgcs och axoner genererade vi renade DRG axoner som tidigare beskrivits15,16,17,18. Dessa renade DRG axoner var sedan seedad med hGCs, som bildade GFAP +/Ki67 + tumörliknande strukturer integreras i axonala nätverk, medan enskilda hGCs migreras antingen i förening eller mellan axonerna (figur 2). För att avgöra hur hgcs interagerar med...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Här presenterar vi ett ex-vivo blandat enskiktslager kultur system för studier av Human gliom cell (HGC) migration i realtid. Denna modell ger möjlighet att observera interaktioner mellan hgcs och både myelinerade och icke-myeliniserade axoner inom en uppdelade kammare.

Real tidsövervakning av humana Glioma cell migration på dorsala root ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-kulturer

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Detta ex vivo co-kultur system kan användas för att identifiera nya cellulära och molekylära mekanismer för mänskliga gliom cell migration och skulle kunna användas för in vitro drogeffekt testning. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att studera interaktioner mellan mänskliga glioblastoma celler och axoner i realtid. Demonstrera förfarandet kommer att John Zepecki, en doktorand från mitt labb.För att montera fackiga odlingsrätter, späd kollagen stamlösning till 500 mikrogram per milliliter i sterilt destillerat vatten och blanda noggrant. Med en steril överföringspipett fyller du en 35 millimeters odlingsfat med två milliliter av den utspädda kollagenlösningen. Sedan något luta skålen och ta bort lösningen lämnar en tunn film av kollagen bakom.Dispensera lösningen i nästa 35 millimeters fat. Upprepa denna process, lägga till mer kollagen lösning som behövs tills alla rätter har belagts. För att polymerisera kollagenet, i en laminär flödeshuva, våta gasvävsdynor med tre milliliter koncentrerad ammoniumhydroxid och täck brickorna i 15 minuter.Ta bort gasväv kuddar och låt 35 millimeters rätter torka. Därefter använder en metallfil för att fila bort punkten på en 18 gauge nål för att göra en trubbig spets. Blötlägg nålen i 70%etanol för att sterilisera.Applicera silikonfett på botten av den fackade kammaren. Se till att fettet placeras snyggt och överlappar i alla hörn. Denna teknik kan vara mycket utmanande så vi föreslår att du tar extra tid att öva på att tillämpa rätt mängd fett innan du ställer upp de uppdelade kamrarna i syfte att säkerställa utmärkt tillväxt.Det är också mycket viktigt att arbeta långsamt. Inrätta fler kammare än du tror att du kommer att behöva så du har extrafunktioner bör något gå fel. Ta bort locket från en 35 millimeters maträtt, invertera skålen och placera repor över kammaren.Knacka ner på botten av skålen försiktigt med ett par tåtaningar. Vid applicering av fettkamrarna på rätten ska du inte knacka för hårt. Annars kommer inte axoner att kunna växa under in i den intilliggande kammaren.Använd de hemostatiska forceps för att försiktigt vända skålen över. Släpp tednarna. Placera en hög med fett vid mittfackets bas.Fyll varje kammare med kompletterat neuronalt basalt medium. Kontrollera om det finns läckor och tätningsläckor med silikonfett efter behov. Fortsätt montera alla kulturrätter och lagra över natten på 37 grader Celsius och 5%koldioxid.Den uppdelade kammaren tillåter användning av olika farmakologiska reagenser samt förmåga att jämföra och kontrastera resultat mellan två brunnar på samma platta. För att så de beredda kulturer som innehåller en GBM neurosfär, först ersätta mediet med kompletterade NBF som innehåller 10%FBS i varje distala avdelningar kammare. Därefter, med en P20 pipetten inställd på 10 mikroliter, dra en GBM neurosfär från kultur skålen.Placera pipettens spets i den distala kammaren närmast mittkammaren utan att röra axonen och utvisa GBM-neurosfären långsamt så att den försiktigt faller ner på axoner. Lämna kulturen i biosäkerhetsskåpet i en timme i rumstemperatur så att GBM-neurosfären kan fästa. Denna metod skulle kunna användas för att testa farmakologiska föreningar för behandling av hjärntumörer.Denna metod skulle också kunna tillämpas på andra sjukdomar i det perifera och centrala nervsystemet såsom demyelinating neuropathies och multipel skleros. I detta protokoll, renas DRG axoner var seedade med HCGs som bildade dubbla positiva GFAP och KI67 tumör-liknande strukturer integreras inom axonal nätverket anges av de röda tumör markörer GFAP medan enskilda HGCs uttrycker den gröna fluorescerande protein migreras antingen i associering eller mellan axons. Tillägg av tunga lastbilar på myelinated DRG oligodendrocyte co-kulturer visade att tunga lastbilar migrera i samarbete med de röda färgade myelinated axoner och bort från tumör massa genom bildandet av pseudopodia.När denna teknik var fulländat, kunde vi använda den för att studera migration av mänskliga GBM stamceller i realtid. Vi kunde också studera effekter på cellmigration efter tillägg av nya terapeutiska små molekylhämmare. GBM sfären invaderar en myelinated oligodendrocyte DRG axon kultur visas här.Det protokoll som beskrivs här skulle kunna tjäna som en grund för andra biomimetiska tredimensionella ex vivo-system som syftar till att bedöma effekterna av nya läkemedelsbehandlingar. Man bör alltid vara försiktig vid hantering av celler som härrör från människan. Lämplig personlig skyddsutrustning bör bäras och blodburna patogener utbildning bör slutföras så man förstår riskerna med att arbeta med patient-härledda vävnader.Ammoniumhydroxid bör hanteras med omsorg och du bör bära handskar, en labbrock, och arbeta i en huva för att förhindra exponering för denna kemikalie.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Förberedelse och metabola haltbestämning av 3-dimensionell sfäroid samtidig kulturer av pankreascancer celler och fibroblaster

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Med Dot-analys att analysera Migration av Cell ark

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum och Plasma kopia nummer detektering med realtids-PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Realtid upptäcka i Vitro tumör Cell apoptos induceras av CD8+ T celler att studera suppressiv immunförsvaret av tumör-infiltrera myeloida celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Utvärdering av biomarkörer i gliom av immunohistokemi på Paraffin-inbäddat 3D gliom Neurosphere kulturer

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Time-lapse 2D-avbildning av fagocytos aktivitet i M1 Makrofage-4T1 mus bröstcancerceller i Co-kulturer

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Impedansbaserad realtidsmätning av cancercellmigration och invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mätning i realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumörvävnad skivor

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ett snabbt screeningarbetsflöde för att identifiera potentiell kombinationsterapi för GBM med hjälp av patientbaserade Glioma-stamceller

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...