Name: real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures
Uploaded: 2019-12-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

Bu çalışma, Brown Üniversitesi'nden N.T.'ye nöroşirürji bölümü dahili fonları tarafından desteklenmiştir.

Hasta kaynaklı insan glioma hücrelerinin toplanması, izole edilmesi ve yayılması na yönelik protokoller Rhode Island Hastanesi'nin IRB komitesi tarafından onaylandı. Tüm hayvanlar, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na göre muhafaza edilmiştir. Tüm hayvan kullanım protokolleri Rhode Island Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Medya ve tampon preparatları
<ol><li>Prepare 50 mL of Neurosphere Media:...

<ol>
	<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma.">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li><li>Stupp, R., Weber, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+radio-+and+chemotherapy+in+glioblastoma.">The role of radio- and chemotherapy in glioblastoma.</a> Onkologie. 28 (6-7), 315-317 (2005).</li><li>Wick, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+inhibition:+emerging+molecular+targets+for+treating+glioblastoma.">Pathway inhibition: emerging molecular targets for treating glioblastoma.</a> Neuro-Oncology. 13 (6), 566-579 (2011).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines.">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li><li>Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+of+origin+in+cancer.">Cells of origin in cancer.</a> Nature. 469 (7330), 314-322 (2011).</li><li>Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disguising+adult+neural+stem+cells.">Disguising adult neural stem cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (1), 125-131 (2004).</li><li>Sanai, N., Alvarez-Buylla, A., Berger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+the+origin+of+gliomas.">Neural stem cells and the origin of gliomas.</a> New England Journal of Medicine. 353 (8), 811-822 (2005).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+restricted+cell+population+propagates+glioblastoma+growth+after+chemotherapy.">A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy.</a> Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).</li><li>Bao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma+stem+cells+promote+radioresistance+by+preferential+activation+of+the+DNA+damage+response.">Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response.</a> Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).</li><li>Beier, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133(+)+and+CD133(-)+glioblastoma-derived+cancer+stem+cells+show+differential+growth+characteristics+and+molecular+profiles.">CD133(+) and CD133(-) glioblastoma-derived cancer stem cells show differential growth characteristics and molecular profiles.</a> Cancer Research. 67 (9), 4010-4015 (2007).</li><li>Armento, A., Ehlers, J., Schotterl, S., Naumann, U., De Vleeschouwer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Glioblastoma. , (2017).</li><li>Chedotal, A., Kerjan, G., Moreau-Fauvarque, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+brain+within+the+tumor:+new+roles+for+axon+guidance+molecules+in+cancers.">The brain within the tumor: new roles for axon guidance molecules in cancers.</a> Cell Death and Differentiation. 12 (8), 1044-1056 (2005).</li><li>Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+3D+biomimetic+models+to+understand+the+behavior+of+glioblastoma+multiforme+cells.">Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells.</a> Tissue Engineering Part B Reviews. 20 (4), 314-327 (2014).</li><li>Windebank, A. J., Wood, P., Bunge, R. P., Dyck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+determines+the+caliber+of+dorsal+root+ganglion+neurons+in+culture.">Myelination determines the caliber of dorsal root ganglion neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1563-1569 (1985).</li><li>Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+functional+Schwann+cells+and+neurons+from+normal+peripheral+nerve+tissue.">Separation of functional Schwann cells and neurons from normal peripheral nerve tissue.</a> Brain Research. 115 (3), 361-375 (1976).</li><li>Rambukkana, A., Zanazzi, G., Tapinos, N., Salzer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-dependent+demyelination+by+Mycobacterium+leprae+in+the+absence+of+immune+cells.">Contact-dependent demyelination by Mycobacterium leprae in the absence of immune cells.</a> Science. 296 (5569), 927-931 (2002).</li><li>Tapinos, N., Ohnishi, M., Rambukkana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ErbB2+receptor+tyrosine+kinase+signaling+mediates+early+demyelination+induced+by+leprosy+bacilli.">ErbB2 receptor tyrosine kinase signaling mediates early demyelination induced by leprosy bacilli.</a> Nature Medicine. 12 (8), 961-966 (2006).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation.">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li><li>Ruffini, F., Arbour, N., Blain, M., Olivier, A., Antel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctive+properties+of+human+adult+brain-derived+myelin+progenitor+cells.">Distinctive properties of human adult brain-derived myelin progenitor cells.</a> American Journal of Pathology. 165 (6), 2167-2175 (2004).</li><li>Zepecki, J. P., Snyder, K. M., Moreno, M. M., Fajardo, E., Fiser, A., Ness, J., Sarkar, A., Toms, S. A., Tapinos, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+glioma+cell+migration,+tumor+growth,+and+stemness+gene+expression+using+a+Lck+targeted+inhibitor.">Regulation of human glioma cell migration, tumor growth, and stemness gene expression using a Lck targeted inhibitor.</a> Oncogene. 38, 1734-1750 (2018).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods in Molecular Bioliogy. 294, 15-22 (2005).</li><li>Merz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+slice+cultures+of+human+glioblastoma+reveal+different+susceptibilities+to+treatments.">Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments.</a> Neuro-Oncology. 15 (6), 670-681 (2013).</li><li>Singh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+human+brain+tumour+initiating+cells.">Identification of human brain tumour initiating cells.</a> Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).</li><li>Aubert, M., Badoual, M., Christov, C., Grammaticos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+glioma+cell+migration+on+collagen+and+astrocytes.">A model for glioma cell migration on collagen and astrocytes.</a> Journal of the Royal Society Interface. 5 (18), 75-83 (2008).</li><li>Jia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+three-dimensional+collagen+scaffolds+on+the+expression+profiles+and+biological+functions+of+glioma+cells.">Effects of three-dimensional collagen scaffolds on the expression profiles and biological functions of glioma cells.</a> International Journal of Oncology. 52 (6), 1787-1800 (2018).</li><li>Kaphle, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+and+pharmacological+regulation+of+glioblastoma+cell+migration+in+3D+matrices.">The mechanical and pharmacological regulation of glioblastoma cell migration in 3D matrices.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3948-3960 (2019).</li><li>Gritsenko, P., Leenders, W., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+in+vivo-like+plasticity+of+glioma+cell+invasion+along+blood+vessels+and+in+astrocyte-rich+stroma.">Recapitulating in vivo-like plasticity of glioma cell invasion along blood vessels and in astrocyte-rich stroma.</a> Histochemistry and Cell Biology. 148 (4), 395-406 (2017).</li><li>Gritsenko, P. G., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+adhesion+systems+mediate+glioma+cell+invasion+in+complex+environments.">Adaptive adhesion systems mediate glioma cell invasion in complex environments.</a> Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).</li><li>Kaur, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadherin-11,+a+marker+of+the+mesenchymal+phenotype,+regulates+glioblastoma+cell+migration+and+survival+in+vivo.">Cadherin-11, a marker of the mesenchymal phenotype, regulates glioblastoma cell migration and survival in vivo.</a> Molecular Cancer Research. 10 (3), 293-304 (2012).</li><li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors.">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34 (21), 5181-5190 (2013).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+hydrogel+is+suitable+for+targeted+investigation+of+amoeboid+migration+of+glioma+cells.">Three-dimensional hydrogel is suitable for targeted investigation of amoeboid migration of glioma cells.</a> Molecular Medicine Reports. 17 (1), 250-256 (2018).</li></ol>

HGC'ler için göç çalışmaları Boyden oda sistemleri veya çizik tahlilleri kullanılarak yapılabilir. Ancak, bu deneyler diğer çevre dokuları ile tümör hücrelerinin etkileşimleri ile ilgili herhangi bir bilgi vermek için başarısız olsa da, mevcut sistem miyelinatlı ve non-miyelinated lifleri ile GC etkileşimleri özetleyebilir. Ayrıca, tümör oluşumu ve son nokta göç çalışma, kemirgen beyin veya kemirgen beyin veya kanadı içine glioma hücrelerinin in vivo implantasyon organotipik dilim kül...

Glioblastom insan beyninin en agresif ve ölümcül tümörlerinden biridir. Mevcut bakım standardı, tümörün cerrahi rezeksiyonu ve ardından radyasyon1 artı eşlik eden ve temozolomide2'ninadjuvan uygulamasıdır. Bu multi-terapötik yaklaşım la bile, tümör nüks kaçınılmazdır3. Bu kısmen tümör hücrelerinin geniş göç doğası nedeniyle, beyin parankim istila beyin içinde birden fazla parmak benzeri projeksiyonlar oluşturarak4 tam rezeksiyon olası hale.
Son yıllarda, bu glioblastoma saldırganlık nedeniyle olduğu ortaya çıkmıştır, kısmen, tümör kitle içinde kanser kök hücrelerinin bir popülasyonvarlığı nabağlı5,6, yüksek göç potansiyeli sergileyen7,8, kemoterapi ve radyasyona direnç9,10 ve ikincil tümörler oluşturmak için yeteneği11. GSC'ler çıplak farelere xenografted zaman orijinal poliklonal tümörler recapitulating yeteneğine sahiptir5.
Glioblastomların genetik geçmişi ile ilgili bilgi zenginliğine rağmen, glioma hücreli (GC) göçü üzerine yapılan çalışmalar şu anda etkin in vitro veya in vivo göç modellerinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Özellikle, glioma hücre-aksonal etkileşimleri hücresel ve çevresel faktörler tarafından modüle glioma invazyonunun temel bileşeni olmakla birlikte, bizim bilgimize göre şu anda bu etkileşimleri modelleme yeteneği ile hiçbir deneysel sistem yoktur12,13,14. Bu eksikliği gidermek için, farklılaştırılmış tümör belirteçlerinin yüksek ekspresyonunun yanı sıra hGC'lerin miyelinatlı ve miyelinatlı olmayan liflerle etkileşiminin yanı sıra, saflaştırılmış DRG akson-oligodendrositlerle birlikte kültürlenen primer hGC'lerden oluşan bir ex vivo kültür sistemi geliştirdik. Bu ex vivo platformu, bölümlere ayrılmış düzeni nedeniyle, hGC göç desenleri üzerinde yeni terapötik etkilerini test etmek için uygundur.,

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5S NGF</td>
			<td>ENVIGO</td>
			<td>B.5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Suspension Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A669-500</td>
			<td>Concentrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-A2B5 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution (PBS, pH 7.2)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement, minus vitamin A</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12587001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Campenot Chamber</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>35mm X 10mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td>70 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>30 uM, Nylon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11097113001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Rat Collagen I</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3440-100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E16 Timed Pregnant Sprague Dawley Rat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30070.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUDR</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 Nutrient Mix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11765054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-7035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt, 0.2% in PBS</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle, 18G</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium G</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>41400045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>1190081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns plus tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal-A Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ordinary forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2 Sprague Dawley Rat Pups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin Rake</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-PR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1110501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syrine Grease Applicator</td>
			<td>Tyler Research</td>
			<td>CAMP-GLSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T2036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U3003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of human glioma cell migration on dorsal root ganglion axon-oligodendrocyte co-cultures

Glioblastom, yoğun hücresel heterojenlik ve hGC'lerin göç özellikleri nedeniyle en agresif insan kanserlerinden biridir. Glioma hücre göçünaltında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için tümör mikroortamında hGC'ler ve aksonlar arasındaki etkileşimi inceleme yeteneği esastır. Bu hücresel etkileşimi modellemek için hGC'ler ve dorsal kök gangliyonu (DRG) akson-oligodendrocyte ortak kültürlerden oluşan karma bir kültür sistemi geliştirdik. DRG kültürleri, verimli bir şekilde izole edilebildikleri ve bu tür göç çalışmaları için ideal olan uzun ve kapsamlı projeksiyonları oluşturabildikleri için seçilmiştir. Saflaştırılmış sıçan oligodendrocytes sonra saflaştırılmış sıçan DRG aksonlar eklendi ve miyelin indüklenen. Kompakt miyelin oluşumunu doğruladıktan sonra, hGC'ler nihayet co-kültüre eklendi ve DRG akson ve oligodendrositler ile etkileşimleri zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. Bu koşullar altında, HGC'ler GFAP ve Ki67'yi ifade eden tümör benzeri agrega yapıları oluştururlar, hem miyelinli hem de miyelinsiz aksonal izler boyunca göç eder ve psödopodi oluşumu yoluyla bu aksonlarla etkileşime girilir. Ex vivo co-kültür sistemimiz hGC göçünün yeni hücresel ve moleküler mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir ve potansiyel olarak in vitro ilaç etkinliği testi için kullanılabilir.

Aksonlarla hGC'lerin etkileşimini incelemek için, daha önce açıklandığı gibi saflaştırılmış DRG aksonları üretti15,16,17,18. Bu saflaştırılmış DRG aksonlar daha sonra aksonal ağ içinde entegre GFAP +/Ki67+ tümör benzeri yapılar oluşturan hGC'ler ile tohumlanırken, tek tek hGC'ler aksonlar arasında birlikte veya arasında göç ettiler (Şekil 2). HGC...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures at JoVE.com

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...

Bu ex vivo co-kültür sistemi insan glioma hücre göçünün yeni hücresel ve moleküler mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir ve potansiyel olarak in vitro ilaç etkinliği testi için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı gerçek zamanlı olarak insan glioblastoma hücreleri ve aksonarasındaki etkileşimleri çalışma yeteneğidir. Prosedürü gösteren John Zepecki, benim laboratuarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.Bölmeli kültür yemeklerini monte etmek için, steril distile suda mililitre başına 500 mikrogram kollajen stok çözeltisini seyreltin ve iyice karıştırın. Steril bir transfer pipetile, seyreltilmiş kollajen çözeltisi iki mililitre ile 35 milimetrelik kültür çanak doldurun. Sonra biraz çanak tilt ve arkasında kollajen ince bir film bırakarak çözeltiyi çıkarın.Sonraki 35 milimetrelik çanak içine çözelti dağıtın. Tüm yemekler kaplanana kadar gerektiğinde daha fazla kollajen çözeltisi ekleyerek bu işlemi tekrarlayın. Kollajen polimerize etmek için, bir laminar akış kaputunda, konsantre amonyum hidroksit üç mililitre ile ıslak gazlı bez pedleri ve 15 dakika boyunca tepsileri kapsayacak.Gazlı bez pedleri çıkarın ve 35 milimetrelik yemeklerin kurumasını bekleyin. Daha sonra, künt bir ipucu yapmak için 18 gauge iğne noktası kapalı dosya için metal bir dosya kullanın. Sterilize etmek için iğneyi %70 etanolle ıslatın.Bölmeli haznenin dibine silikon gres uygulayın. Gresin düzgün cerendildiğinden ve her köşeye çakışdığından emin olun. Bu teknik çok zor layıcı olabilir, bu nedenle mükemmel bir büyüme sağlamak için bölmeli odaları kurmadan önce doğru miktarda gres uygulamaalıştırmanızı öneririz.Yavaş çalışmak da çok önemlidir. Bir şeyler yanlış giderse ekstralar var, böylece ihtiyacınız olacağını düşünüyorum daha fazla oda ayarlayın. Kapağı 35 milimetrelik bir tabaktan çıkarın, kabı ters çevirin ve çizikleri odanın üzerine yerleştirin.Bir çift forceps ile yavaşça yemeğin altına dokunun. Çanak yağ odaları uygularken, çok sert dokunmayın. Aksi takdirde aksonlar alttan bitişik odaya giremeyecektir.Yavaşça çanak çevirmek için hemostatik forceps kullanın. Forcep'leri serbest bırak. Orta bölmenin tabanına bir yağ yığını yerleştirin.Takviye nöronal bazal orta ile her oda doldurun. Gerektiğinde silikon gres ile sızıntıları ve mühür sızıntıları kontrol edin. Tüm kültür yemeklerini bir araya getirin ve bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit tesakedin.Bölmeli oda farklı farmakolojik reaktiflerin kullanımının yanı sıra aynı plaka üzerindeki iki kuyu arasındaki sonuçları karşılaştırma ve karşılaştırma olanağı sağlar. GBM nörosfer içeren hazırlanan kültürleri tohumlamak için, ilk her distal bölmeli odasında% 10 FBS içeren tamamlayıcı NBF ile orta değiştirin. Sonra, 10 mikrolitre ye ayarlanmış bir P20 pipet ile kültür çanaktan bir GBM nörosfer çizin.Pipetin ucunu akson'a dokunmadan orta odaya en yakın distal hazneye yerleştirin ve GBM nörosferini yavaşça dışarı atarak aksonların üzerine yavaşça düştüğünü belirtin. GBM nörosferin intremiiçin izin vermek için oda sıcaklığında bir saat için biyogüvenlik kabine kültür bırakın. Bu yöntem beyin tümörlerinin tedavisi için farmakolojik bileşiklertest etmek için kullanılabilir.Bu yöntem demiyelinating nöropatiler ve multipl skleroz gibi periferik ve merkezi sinir sisteminin diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu protokolde saflaştırılmış DRG aksonlar, kırmızı tümör belirteçleri GFAP ile gösterilen aksonal ağ içinde entegre edilmiş çift pozitif GFAP ve KI67 tümör benzeri yapılar oluşturan HCG'ler ile tohumlanmış, yeşil floresan proteini ifade eden hgc'ler ise aksonlar arasında göç etmiştir. Miyeline DRG oligodendrosit co-kültürlerde HGCs eklenmesi hgcs kırmızı lekeli miyelinated akson ile birlikte göç ve uzak psödopodi oluşumu yoluyla tümör kütlesinden gösterdi.Bu teknik mükemmelleştirildikten sonra, insan GBM kök hücrelerinin gerçek zamanlı göçlerini incelemek için onu kullanabildik. Ayrıca yeni terapötik küçük molekül inhibitörleri eklenmesinden sonra hücre göçü üzerindeki etkileri çalışma başardık. Miyelinated oligodendrocyte DRG akson kültürünü istila eden GBM küresi burada gösterilmiştir.Burada açıklanan protokol, yeni ilaç tedavilerinin etkilerini değerlendirmek üzere tasarlanmış diğer biyomimetik üç boyutlu ex vivo sistemleri için bir temel görevi görebılabilir. İnsan kaynaklı hücreleri işlerken her zaman dikkatli olunmalıdır. Uygun PPE giyilmeli ve kanyoluyla bulaşan patojen eğitimi tamamlanmalıdır, böylece hasta kaynaklı dokularla çalışmanın riskleri anlamalıdır.Amonyum hidroksit özenle ele alınmalıdır ve eldiven, bir laboratuvar önlüğü giymek ve bu kimyasal maruz kalmaönlemek için bir başlık içinde çalışmak gerekir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Preparation and Metabolic Assay of 3-dimensional Spheroid Co-cultures of Pancreatic Cancer Cells and Fibroblasts

Hazırlık ve pankreas kanseri hücreleri ve fibroblastlar 3 boyutlu küresel ortak kültürlerin metabolik tahlil

Many cancer types, including pancreatic cancer, have a dense fibrotic stroma that plays an important role in tumor progression and invasion. Activated ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures

Biyolojik gliyom immünhistokimya parafin gömülü 3D tümörü Neurosphere kültürü üzerinde tarafından değerlendirilmesi

Analysis of protein expression in glioma is relevant for several aspects in the study of its pathology. Numerous proteins have been described as ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Hasta Kaynaklı Glioma Kök Hücreleri Kullanarak GBM için Potansiyel Kombinasyon Tedavisini Belirlemek için Hızlı Tarama İş Akışı

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...