Name: murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00
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Gli autori ringraziano Sara Minemyer e Alexander Comerci per la revisione linguistica.

Tutti i protocolli sugli animali sono approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e aderiti alle Linee guida dei National Institutes of Health (NIH). Gli strumenti utilizzati per qualsiasi procedura chirurgica sono stati accuratamente sterilizzati.
1. Preparazione iniziale
<ol><li>Prima di iniettare cellule tumorali nella milza del topo, autoclave e sterilizzare tutti gli strumenti da utilizzare durante la procedura.</li>
	<li>Sterilizzare e/o autoclave un pad di r...

<ol>
	<li>Riihim&#228;ki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer.">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765 (2016).</li><li>Oki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+treatment+for+colorectal+liver+metastasis.">Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis.</a> Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation+in+hepatic+ischemia/reperfusion+injury:+present+concepts+and+potential+therapeutics.">Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).</li><li>Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+surgery+on+tumor+growth:+a+century+of+investigations.">The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations.</a> Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).</li><li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress.">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484 (2007).</li><li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis.">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li><li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraportal+injection+model:+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer.">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29 (2009).</li><li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Sa&#235;c, P. R. e. m. a. u. d. -., Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis:+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody.">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li><li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer.">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy.">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li></ol>

Il modello animale descritto in questo manoscritto si basa su due approcci principali. Il primo è quello di riconoscere la capacità delle cellule tumorali di localizzare e proliferare nei lobi del fegato. Il secondo è quello di studiare l'effetto della lesione di reperfusione ischemia epatica che influenza la crescita del tumore e le metastasi. Questo modello consente lo studio pertinente delle metastasi epatiche in assenza di metastasi secondarie in un topo immunocompetente. Il modello è utile per affrontare le ques...

Il fegato è uno dei siti più comuni per lo sviluppo della malattia metastatica1. La mortalità è quasi invariabilmente attribuibile a complicazioni associate alla crescita del tumore nel fegato. Nei pazienti con tumori solidi metastatici nel fegato, l'intervento chirurgico rimane un intervento cruciale per il controllo della malattia e un possibile approccio curativo. Tuttavia, la stragrande maggioranza dei pazienti in ultima analisi presenta una malattia ricorrente, prevalentemente nel fegato2,3. Durante la chirurgia epatica, il sanguinamento intraoperatorio è comune, spesso richiede la trasfusione di sangue e diversi approcci tecnici per il controllo del sanguinamento, compresi i metodi di bloccaggio vascolare. Tuttavia, tali misure causano ischemia/reperfusione epatica (I/R) al tessuto epatico. Gli effetti negativi dell'I/R sulla funzione epatocellulare sono stati ben documentati. L'insulto I/R del fegato accende le cascate infiammatorie durante il ripristino del flusso sanguigno attraverso vie infiammatorie4. Non solo la lesione epatica da I/R contribuisce all'insufficienza epatica, ma le prove attuali dimostrano anche che la lesione da I/R stimola l'adesione delle cellule tumorali e promuove l'incidenza della formazione di metastasi e la crescita della malattia micrometastatica esistente5. Abbiamo già riferito che lo stress chirurgico induce l'attivazione di cellule immunitarie che non solo aiuta nella crescita del tumore primario, ma facilita anche le metastasi catturando le cellule tumorali all'interno della circolazione6.
Qui descriviamo in dettaglio una tecnica per stabilire un modello di tumore del topo metastasi epatica. In questo modello, presentiamo anche un metodo per indurre lesioni da reperfusione di ischemia epatica che agisce come un surrogato allo stress chirurgico presente clinicamente durante le epatitectomie. I metodi combinati di iniezione del cancro e I/R epatico possono interpretare con successo lo sviluppo del CRLM in pazienti che hanno subito la resezione tumorale primaria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stretomysin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3023701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flask 75cm</td>
			<td>5 Cells Star</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml PP Conical Tubes</td>
			<td>BioExcell</td>
			<td>41021037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Giibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1376152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautry</td>
			<td>Bovie</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular clamp</td>
			<td>Finescience tools</td>
			<td>18055-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Serrefine clamp applicator with lock</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-18056-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-15021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilator</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-00276-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic fixator Retraction system</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-18200020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-11019-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 polypropylene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1443915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>559A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine solution</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml 25G</td>
			<td>BD safety Glide</td>
			<td>305903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 ml</td>
			<td>BD insulin Syringes</td>
			<td>32946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton -Tipped Applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LR92240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Elisa Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11663925910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Putney</td>
			<td>#056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>NADA</td>
			<td>#139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALT strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AST strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury

L'ischemia e la lesione da reperfusione (I/R) del fegato, una sfida clinica comune, rimane un inevitabile processo patofisiologico che ha dimostrato di indurre danni multipli ai tessuti e agli organi. Nonostante i recenti progressi e gli approcci terapeutici, la morbilità generale è rimasta insoddisfacente soprattutto nei pazienti con anomalie parenchyliche sottostanti. Nel contesto della crescita aggressiva del cancro e della metastasi, si sospetta che l'I/R chirurgico sia il promotore che regola la ricorrenza del tumore. Questo articolo ha lo scopo di descrivere un modello murino clinicamente rilevante di E-R e metastasi epatica del fegato. In tal modo, miriamo ad aiutare altri ricercatori a stabilire e perfezionare questo modello per la loro pratica di ricerca di routine per comprendere meglio gli effetti del fegato I/R sulla promozione delle metastasi epatiche.

Tutti i topi wildtype (C57BL6) (n - 20) sono stati sottoposti al modello delle metastasi epatiche utilizzando il protocollo descritto sopra. Tutti i topi iniettati con o senza lesioni da reperfusione di ischemia sono sopravvissuti fino alla data del sacrificio. Il diagramma schematico Figura 1A di un fegato iniettato dal cancro illustra il bloccaggio della triade del portale (arteria epatica, vena del portale e dotto biliare) che induce un'ischemia epatica parziale (70%) insulto verso la med...

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Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.

Modello Murine dei tumori metastatici del fegato nell'impostazione della lesione alla riperfusione dell'ischemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Prove sperimentali e cliniche dimostrano che la riperfusione di ischemia epatica può aumentare la formazione di focolai metastatici facendo circolare le cellule tumorali e la crescita della malattia micrometastatica. Questo modello murino riproducibile consente lo studio rilevante sia della creazione di metastasi che della crescita del tumore preesiste all'interno del fegato. La chirurgia epatica, il sanguinamento e lo shock settico sono tutti associati alla riperfusione di ischemia epatica e possono influenzare la crescita della malattia metastatica.Queste tecniche consentono lo studio di questi fenomeni nel tentativo di diagnosticare e prevenire meglio l'effetto dannoso della riperfusione di ischemia sulla crescita tumorale in un contesto clinico. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un topo maschio C57 black 6 di otto-12 settimane anestetizzato, disinfettare la pelle esposta della parete addominale con uno scrub povidone-iodio e utilizzare le forcette dentate per sollevare la pelle. Utilizzando un bisturi chirurgico, fare un'incisione della linea mediana nella pelle e sollevare il muscolo addominale e il peritoneo per facilitare la creazione di un'incisione della linea mediana di tre centimetri per esporre il contenuto addominale.Dopo aver posizionato un emostato su entrambi i lati dell'incisione e sotto il processo xifoide, tirare e nastro la coda verso il basso per estendere l'addome e utilizzare un applicatore sterile a punta di cotone da sei pollici per separare ed esporre la milza dal tessuto adiposo pancreatico. Successivamente, vortice la sospensione delle cellule tumorali di interesse per dissociare eventuali grumi cellulari e caricare le cellule in una siringa per insulina da 0,5 millilitri dotata di un ago calibro 28. Iniettare lentamente e con cura 100 microlitri di cellule nella punta della milza, posizionando una punta di cotone adiacente al lato della puntura dell'ago per assorbire qualsiasi possibile fuoriuscita di tumore nella cavità peritoneale aggiungendo una leggera pressione per stabilizzare la milza durante l'iniezione.Un'iniezione riuscita sarà evidente da un cambiamento nel colore del fegato. Una volta che tutte le cellule sono state consegnate, posizionare un pezzo di garza sterile imbevuta di PBS sull'area sezionata e posizionare il mouse su una pastiglia riscaldante per 15 minuti per consentire alle cellule tumorali di circolare all'interno del sistema. Per indurre un'ischemia e una lesione da riperfusione, utilizzare due punte di cotone inumidito per spostare delicatamente l'intestino dalla cavità per esporre la vena del portale e posizionare il mouse sotto un microscopio sezionante.Sollevare i lobi del fegato laterale mediano e sinistro contro il diaframma. Posizionare un piccolo batuffolo di cotone umido tra il lobo mediano e il lobo laterale destro per creare spazio sufficiente per il bloccaggio e passare con cura un dilatatore di vasi dietro la triade del portale e, utilizzando le pinze del dilatatore del vaso, utilizzare un pezzo di 10 centimetri di sutura di polipropilene 4-0 per passare dietro e sollevare la triade del portale. Utilizzare un applicatore di morsetto micro-serrifine con una serratura per posizionare un morsetto microvascolare sui lobi epatici sinistro e mediano per occludere tutte le strutture nella triade del portale.Quando si osserva sbiancamento, rimuovere la sutura di polipropilene 4-0 e il piccolo batuffolo di cotone e restituire con cura l'intestino alla cavità addominale. Coprire la parete addominale con un nuovo pezzo di garza imbevuta di PBS e coprire la garza con un involucro di plastica per ridurre al minimo la perdita evaporativa. Quindi riposizionare il mouse sulla pastiglia di riscaldamento per 60 minuti.Durante l'intervallo ischemico, visualizzare il pallido sbiancamento dei lobi mediali destro, mediali sinistro e laterale per confermare le prove della lesione da ischemia. Alla fine del periodo di lesione, rimuovere il morsetto. Per eseguire una splenectomia, sollevare con cura la milza con forcende lisce e utilizzare un dispositivo cautery portatile per cauterizzare i vasi sanguigni splenici per evitare un eccessivo sanguinamento.Trasezionare i vasi nella sezione cauterizzata per rimuovere la milza e utilizzare immediatamente 4-0 suture in polipropilene per chiudere le incisioni muscolari e cutanee in un modello di sutura a doppio strato. Quindi riposizionare il mouse nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Lo stress chirurgico aumenta significativamente la quantità di micrometastasi prestabilite all'interno del fegato.Questa differenza si osserva anche due settimane dopo la riperfusione dell'ischemia rispetto ai topi non ischemia riperfusi. La riperfusione di ischemia epatica e l'iniezione di cellule tumorali possono essere influenzate dalla temperatura ambiente e dalla vitalità cellulare, quindi fai attenzione a controllare queste variabili. Questa tecnica facilita lo studio degli effetti dello stress chirurgico e della lesione epatica sulla crescita della malattia metastatica.Ciò aiuterà i ricercatori a comprendere meglio il fenomeno della crescita tumorale indotta dalla chirurgia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Successivo sequenziamento di nuova generazione per il rilevamento di Actionable mutazioni nei tumori solidi e liquidi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Ricerca

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