Name: murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00
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Os autores agradecem a Sara Minemyer e Alexander comerci pela revisão linguística.

Todos os protocolos de animais são aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais e aderiram aos institutos nacionais de saúde (NIH) diretrizes. Os instrumentos utilizados para qualquer procedimento cirúrgico foram completamente esterilizados.
1. Preparação inicial
<ol><li>Antes de injetar células cancerosas no baço do rato, autoclave e esterilizar todos os instrumentos a serem utilizados durante o procedimento.</li>
	<li>Esterilizar e/ou autoclave uma almofada de aq...

<ol>
	<li>Riihim&#228;ki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer.">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765 (2016).</li><li>Oki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+treatment+for+colorectal+liver+metastasis.">Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis.</a> Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation+in+hepatic+ischemia/reperfusion+injury:+present+concepts+and+potential+therapeutics.">Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).</li><li>Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+surgery+on+tumor+growth:+a+century+of+investigations.">The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations.</a> Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).</li><li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress.">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484 (2007).</li><li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis.">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li><li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraportal+injection+model:+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer.">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29 (2009).</li><li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Sa&#235;c, P. R. e. m. a. u. d. -., Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis:+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody.">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li><li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer.">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy.">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li></ol>

O modelo animal descrito neste manuscrito é baseado em duas abordagens principais. O primeiro é reconhecer a capacidade das células cancerosas para localizar e proliferar nos lóbulos do fígado. O segundo é estudar o efeito da lesão hepática de reperfusão de isquemia influenciando o crescimento tumoral e as metástases. Este modelo permite o estudo relevante de metástases do fígado na ausência de metástases secundárias em um rato imuno-competente. O modelo é útil para abordar as questões de eficiência me...

O fígado é um dos locais mais comuns para o desenvolvimento da doença metastática1. A mortalidade é quase invariavelmente atribuível a complicações associadas ao crescimento tumoral no fígado. Em pacientes com tumores sólidos metastáticos no fígado, a cirurgia continua sendo uma intervenção crucial para o controle da doença e uma possível abordagem curativa. Entretanto, a maioria vasta dos pacientes apresenta finalmente com doença periódica, predominante no fígado2,3. Durante a cirurgia hepatic, o sangramento intraoperativo é comum, frequentemente necessitando a transfusão de sangue e as aproximações técnicas diferentes para o controle do sangramento, incluindo métodos de aperto vasculares. No entanto, tais medidas causam isquemia/reperfusão hepática (I/R) ao tecido hepático. Os efeitos adversos da I/R na função hepatocelular têm sido bem documentados. O insulto do fígado I/R inflama cascatas inflamatórias durante a restauração do fluxo sanguíneo através de vias inflamatórias4. Não só a lesão hepática I/R contribui para a insuficiência hepática, mas a evidência atual também mostra que a lesão de I/R estimula a adesão de células tumorais, e promove a incidência de formação de metástases e o crescimento da doença micrometastática existente5. Nós temos relatado previamente que o esforço cirúrgico induz a ativação de pilhas imunes que ajuda não somente no crescimento do tumor preliminar, mas igualmente facilita metástases capturando pilhas de cancro dentro da circulação6.
Aqui nós descrevemos em detalhe uma técnica para estabelecer um modelo do tumor do rato da metástase do fígado. Neste modelo, também apresentamos um método para induzir lesão de reperfusão hepática de isquemia que atua como um substituto para o estresse cirúrgico presente clinicamente durante hepatectomias. Os métodos combinados da injeção do cancro e do I/R hepatic podem com sucesso interpretar o desenvolvimento de CRLM nos pacientes que se submeteram ao Resection preliminar do tumor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stretomysin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3023701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flask 75cm</td>
			<td>5 Cells Star</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml PP Conical Tubes</td>
			<td>BioExcell</td>
			<td>41021037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Giibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1376152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautry</td>
			<td>Bovie</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular clamp</td>
			<td>Finescience tools</td>
			<td>18055-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Serrefine clamp applicator with lock</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-18056-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-15021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilator</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-00276-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic fixator Retraction system</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-18200020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-11019-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 polypropylene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1443915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>559A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine solution</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml 25G</td>
			<td>BD safety Glide</td>
			<td>305903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 ml</td>
			<td>BD insulin Syringes</td>
			<td>32946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton -Tipped Applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LR92240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Elisa Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11663925910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Putney</td>
			<td>#056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>NADA</td>
			<td>#139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALT strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AST strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury

A lesão de isquemia e reperfusão hepática (I/R), um desafio clínico comum, continua sendo um processo fisiopatológico inevitável que tem demonstrado induzir múltiplos danos nos tecidos e órgãos. Apesar dos avanços recentes e das aproximações terapêuticas, a morbosidade total permaneceu insatisfatória especial nos pacientes com anomalias parenquimatosas subjacentes. No contexto do crescimento agressivo do cancro e da metástase, o I/R cirúrgico é suspeitado para ser o promotor que regula o retorno do tumor. Este artigo tem como objetivo descrever um modelo murino clinicamente relevante de I/R hepática e metástase hepática colorretal. Ao fazê-lo, pretendemos ajudar outros investigadores a estabelecer e aperfeiçoar este modelo para a sua prática de investigação de rotina para compreender melhor os efeitos do fígado I/R sobre a promoção de metástases hepáticas.

Todos os camundongos tipo selvagem (C57BL6) (n = 20) foram submetidos ao modelo de metástases hepáticas utilizando o protocolo descrito acima. Todos os camundongos injetados com ou sem lesão de reperfusão de isquemia sobreviveram até a data do sacrifício. O diagrama esquemático Figura 1a de um fígado com injeção de câncer ilustra o aperto da Tríade Portal (artéria hepática, veia porta e ducto biliar) que induz um fígado parcial isquêmico (70%) insulto para a mediana e os lób...

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Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Nós descrevemos em detalhe um modelo clinicamente relevante do tumor das metástases do fígado do cancro colorretal (crlm) e a influência do reperfusão da isquemia do fígado (I/R) no crescimento e na metástase do tumor. Este modelo pode ajudar a compreender melhor os mecanismos subjacentes à promoção cirurgia-induzida do crescimento metastático do fígado.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

Evidências experimentais e clínicas mostram que a reperfusão da isquemia hepática pode aumentar a formação de focos metastáticos através da circulação de células cancerígenas e o crescimento da doença micrometastática. Este modelo de murina reprodutível permite o estudo relevante tanto do estabelecimento de metástases quanto do crescimento do tumor pré-existente dentro do fígado. Cirurgia hepática, sangramento e choque séptico estão todos associados à reperfusão da isquemia hepática e podem afetar o crescimento da doença metastática.Essas técnicas permitem o estudo desse fenômeno em um esforço para melhor diagnosticar e prevenir o efeito prejudicial da reperfusão da isquemia no crescimento do tumor em um ambiente clínico. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um rato C57 preto C57 de 8 a 12 semanas, desinfete a pele da parede abdominal exposta com um esfoliante povidone-iodo e use fórceps dentuças para levantar a pele. Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão midline na pele e levante o músculo abdominal e o peritônio para facilitar a criação de uma incisão de linha média de três centímetros para expor o conteúdo abdominal.Depois de colocar um hemosta em ambos os lados da incisão e sob o processo xifoide, puxe e tape a cauda para baixo para estender o abdômen e use um aplicador de ponta de algodão estéril de seis polegadas para separar e expor o baço do tecido de gordura pancreática. Em seguida, o vórtice da célula cancerosa suspende o interesse de dissociar qualquer aglomerado celular e carregar as células em uma seringa de insulina de 0,5 mililitro equipada com uma agulha de calibre 28. Injete lentamente e cuidadosamente 100 microliters de células na ponta do baço, colocando uma ponta de algodão adjacente ao lado da punção da agulha para absorver qualquer possível derramamento de tumor na cavidade peritoneal, adicionando pressão suave para estabilizar o baço durante a injeção.Uma injeção bem sucedida será evidente por uma mudança na cor do fígado. Quando todas as células tiverem sido entregues, coloque um pedaço de gaze estéril encharcada de PBS sobre a área dissecada e coloque o mouse em uma almofada de aquecimento por 15 minutos para permitir que as células cancerosas circulem dentro do sistema. Para induzir uma isquemia e lesão de reperfusão, use duas pontas de algodão umedecidas para mover suavemente o intestino da cavidade para expor a veia portal e colocar o rato sob um microscópio dissecando.Levante os lóbulos de fígado laterais medianos e esquerdos contra o diafragma. Coloque um pequeno cotonete úmido entre o lobo mediano e o lobo lateral direito para criar espaço suficiente para fixação e passe cuidadosamente uma fórceps dilatadora de vasos atrás da tríade portal e, usando as fórceps dilatadores do vaso, use um pedaço de 10 centímetros de sutura de polipropileno de 4-0 para passar por trás e levantar a tríade portal. Use um aplicador de grampo de micro-serrifina com uma fechadura para colocar um grampo microvascular nos lobos hepáticos esquerdo e mediano para ocluir todas as estruturas da tríade portal.Quando observar o branqueamento, remova a sutura de polipropileno 4-0 e o cotonete de algodão pequeno e devolva cuidadosamente o intestino à cavidade abdominal. Cubra a parede abdominal com um novo pedaço de gaze encharcada de PBS e cubra a gaze com plástico para minimizar a perda evaporativa. Em seguida, coloque o mouse de volta na almofada de aquecimento por 60 minutos.Durante todo o intervalo isquêmico, visualize o branqueamento pálido dos lobos medial, medial esquerdo e lateral para confirmar evidências da lesão da isquemia. No final do período de lesão, remova o grampo. Para realizar uma esplenectomia, levante cuidadosamente o baço com fórceps lisos e use um dispositivo de cauteria portátil para cauterizar os vasos sanguíneos esplênicos para evitar sangramento excessivo.Transecte os vasos na seção cauterizada para remover o baço e use imediatamente suturas de polipropileno 4-0 para fechar as incisões musculares e cutâneas em um padrão de sutura de dupla camada. Em seguida, coloque o mouse de volta em sua gaiola doméstica com monitoramento até a recuperação completa. O estresse cirúrgico aumenta significativamente a quantidade de micrometastases pré-estabelecidas dentro do fígado.Essa diferença é observada mesmo duas semanas após a reperfusão da isquemia em comparação com camundongos não-isquemínia. A reperfusão da isquemia hepática e a injeção de células tumorais podem ser afetadas pela temperatura ambiente e viabilidade celular, por isso tome cuidado para controlar essas variáveis. Esta técnica facilita o estudo dos efeitos do estresse cirúrgico e da lesão hepática no crescimento da doença metastática.Isso ajudará os pesquisadores a entender melhor o fenômeno do crescimento tumoral induzido pela cirurgia.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Pesquisa do câncer

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Um mouse modelo de fadiga induzida por irradiação periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identificação e caracterização dos fatores metastáticos por transferência de genes para a novela RIP-Tag; RIP-tva modelo murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Desenvolvimento de um modelo humano pré-clínicos de Osteoclastogenesis de monócitos do sangue periférico co cultivados com linhas de células de câncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...