Name: murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00
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Los autores agradecen a Sara Minemyer y Alexander Comerci por la revisión linguística.

Todos los protocolos de los animales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales y se adhieren a las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Los instrumentos utilizados para cualquier procedimiento quirúrgico fueron completamente esterilizados.
1. Preparación inicial
<ol><li>Antes de inyectar células cancerosas en el bazo del ratón, autoclave y esterilizar todos los instrumentos que se utilizarán durante el procedimiento.</li>
	<li>Esterilice...

<ol>
	<li>Riihim&#228;ki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer.">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765 (2016).</li><li>Oki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+treatment+for+colorectal+liver+metastasis.">Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis.</a> Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).</li><li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+treatment+of+colorectal+cancer.">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li><li>van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation+in+hepatic+ischemia/reperfusion+injury:+present+concepts+and+potential+therapeutics.">Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).</li><li>Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+surgery+on+tumor+growth:+a+century+of+investigations.">The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations.</a> Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).</li><li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress.">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li><li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer.">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484 (2007).</li><li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis.">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li><li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraportal+injection+model:+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer.">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29 (2009).</li><li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Sa&#235;c, P. R. e. m. a. u. d. -., Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis:+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody.">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li><li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer.">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li><li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy.">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li></ol>

El modelo animal descrito en este manuscrito se basa en dos enfoques principales. La primera es reconocer la capacidad de las células cancerosas para localizar y proliferar en los lóbulos hepáticos. El segundo es estudiar el efecto de la lesión por reperfusión de isquemia hepática que influye en el crecimiento tumoral y las metástasis. Este modelo permite el estudio relevante de metástasis hepáticas en ausencia de metástasis secundarias en un ratón inmunocompetente. El modelo es útil para abordar las cuestion...

El hígado es uno de los sitios más comunes para el desarrollo de la enfermedad metastásica1. La mortalidad es casi invariablemente atribuible a complicaciones asociadas con el crecimiento tumoral en el hígado. En pacientes con tumores sólidos metastásicos en el hígado, la cirugía sigue siendo una intervención crucial para el control de la enfermedad y un posible enfoque curativo. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes en última instancia presentan con enfermedad recurrente, predominantemente en el hígado2,3. Durante la cirugía hepática, el sangrado intraoperatorio es común, a menudo requiere transfusión de sangre y diferentes enfoques técnicos para el control del sangrado, incluidos los métodos de sujeción vascular. Sin embargo, tales medidas causan isquemia hepática/reperfusión (I/R) al tejido hepático. Los efectos adversos de I/R sobre la función hepatocelular han sido bien documentados. El insulto de I/R del hígado enciende cascadas inflamatorias durante la restauración del flujo sanguíneo a través de vías inflamatorias4. La lesión de I/R hepática no sólo contribuye a la insuficiencia hepática, sino que la evidencia actual también muestra que la lesión por I/R estimula la adhesión de las células tumorales, y promueve la incidencia de la formación de metástasis y el crecimiento de la enfermedad micrometastásica existente5. Hemos informado previamente que el estrés quirúrgico induce la activación de las células inmunitarias que no sólo ayuda en el crecimiento del tumor primario, sino que también facilita las metástasis mediante la captura de células cancerosas dentro de la circulación6.
Aquí describimos en detalle una técnica para establecer un modelo de tumor de ratón de metástasis hepática. En este modelo, también presentamos un método para inducir una lesión por reperfusión de isquemia hepática que actúa como sustituto del estrés quirúrgico presente clínicamente durante las hepatectomías. Los métodos combinados de inyección de cáncer e I/R hepática pueden interpretar con éxito el desarrollo de CRLM en pacientes que se han sometido a una resección tumoral primaria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>900-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stretomysin</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3023701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>sh30042.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture Flask 75cm</td>
			<td>5 Cells Star</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml PP Conical Tubes</td>
			<td>BioExcell</td>
			<td>41021037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain</td>
			<td>Giibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1376152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cautry</td>
			<td>Bovie</td>
			<td>AA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microvascular clamp</td>
			<td>Finescience tools</td>
			<td>18055-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Serrefine clamp applicator with lock</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-18056-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-15021-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel Dilator</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-00276-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic fixator Retraction system</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-18200020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-11019-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Adson Forceps</td>
			<td>Fine science toosl</td>
			<td>FST-11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 polypropylene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>K881H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-8826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>1443915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clipper</td>
			<td>Oster</td>
			<td>559A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine solution</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml 25G</td>
			<td>BD safety Glide</td>
			<td>305903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe 0.5 ml</td>
			<td>BD insulin Syringes</td>
			<td>32946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton -Tipped Applicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LR92240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycoplasma Elisa Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11663925910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Putney</td>
			<td>#056344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>NADA</td>
			<td>#139-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALT strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AST strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH strip</td>
			<td>Heska</td>
			<td>15809607</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

murine model of metastatic liver tumors in the setting of ischemia reperfusion injury

La isquemia hepática y la lesión por reperfusión (I/R), un desafío clínico común, sigue siendo un proceso fisiopatológico inevitable que se ha demostrado que induce múltiples daños en los tejidos y órganos. A pesar de los recientes avances y enfoques terapéuticos, la morbilidad general ha permanecido insatisfactoria, especialmente en pacientes con anomalías parénquimas subyacentes. En el contexto del crecimiento agresivo del cáncer y la metástasis, se sospecha que la I/R quirúrgica es el promotor que regula la recurrencia tumoral. Este artículo tiene como objetivo describir un modelo murino clínicamente relevante de I/R hepática y metástasis hepática colorrectal. Al hacerlo, nuestro objetivo es ayudar a otros investigadores a establecer y perfeccionar este modelo para su práctica de investigación rutinaria para entender mejor los efectos de la I/R hepática en la promoción de metástasis hepáticas.

Todos los ratones de tipo salvaje (C57BL6) (n x 20) fueron sometidos al modelo de metástasis hepáticas utilizando el protocolo descrito anteriormente. Todos los ratones inyectados con o sin lesión por reperfusión de isquemia sobrevivieron hasta la fecha del sacrificio. El diagrama esquemático Figura 1A de un hígado inyectado por cáncer ilustra la sujeción de la tríada del portal (arteria hepática, vena porta y conducto biliar) que induce una isquémica hepática parcial (70%) insul...

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Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

Describimos en detalle un modelo de tumor de metástasis hepáticas de cáncer colorrectal clínicamente relevante (CRLM) y la influencia de la reperfusión de isquemia hepática (I/R) en el crecimiento tumoral y la metástasis. Este modelo puede ayudar a entender mejor los mecanismos subyacentes promoción inducida por cirugía del crecimiento metastásico hepático.

Modelo murino de tumores hepáticos metastásicos en el escenario de la lesión por reperfusión de isquemia

Liver ischemia and reperfusion (I/R) injury, a common clinical challenge, remains an inevitable pathophysiological process that has been shown to induce ...

La evidencia experimental y clínica muestra que la reperfusión de isquemia hepática puede aumentar la formación de focos metastásicos mediante la circulación de células cancerosas y el crecimiento de la enfermedad micrometastática. Este modelo murino reproducible permite el estudio pertinente tanto del establecimiento de metástasis como del crecimiento del tumor preexistente en el hígado. La cirugía hepática, el sangrado y el shock séptico están asociados con la reperfusión de isquemia hepática y pueden afectar el crecimiento de la enfermedad metastásica.Estas técnicas permiten el estudio de este fenómeno en un esfuerzo por diagnosticar y prevenir mejor el efecto perjudicial de la reperfusión de isquemia en el crecimiento tumoral en un entorno clínico. Después de confirmar una falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie en un macho anestesado de ocho a 12 semanas de edad C57 negro 6 ratón, desinfectar la piel expuesta de la pared abdominal con un exfoliante povidona-yodo y utilizar fórceps dentados para levantar la piel. Usando un bisturí quirúrgico, haz una incisión de línea media en la piel y levanta el músculo abdominal y el peritoneo para facilitar la creación de una incisión de línea media de tres centímetros para exponer el contenido abdominal.Después de colocar un hemostat a ambos lados de la incisión y debajo del proceso de xifoide, tire y pegue la cola hacia abajo para extender el abdomen y use un aplicador de punta de algodón estéril de seis pulgadas para separar y exponer el bazo del tejido graso pancreático. A continuación, vórtice la suspensión de la célula cancerosa de interés para disociar cualquier grupo celular y cargar las células en una jeringa de insulina de 0,5 mililitros equipada con una aguja de calibre 28. Inyecte lentamente y cuidadosamente 100 microlitros de células en la punta del bazo, colocando una punta de algodón adyacente al lado de la punción de la aguja para absorber cualquier posible derrame tumoral en la cavidad peritoneal mientras agrega una presión suave para estabilizar el bazo durante la inyección.Una inyección exitosa será evidente por un cambio en el color del hígado. Cuando todas las células hayan sido entregadas, coloque un pedazo de gasa estéril empapada por PBS sobre el área diseccionada y coloque el ratón en una almohadilla de calentamiento durante 15 minutos para permitir que las células cancerosas circulen dentro del sistema. Para inducir una isquemia y una lesión por reperfusión, utilice dos puntas de algodón humedecido para mover suavemente el intestino de la cavidad para exponer la vena porta y coloque el ratón bajo un microscopio diseccionador.Levante la mediana y los lóbulos hepáticos laterales izquierdos contra el diafragma. Coloque un pequeño hisopo de algodón húmedo entre el lóbulo mediano y el lóbulo lateral derecho para crear suficiente espacio para sujetar y pasar cuidadosamente un vaso de fuerzas dilatadores detrás de la tríada del portal y, utilizando los fórceps dilatadores del vaso, utilice una pieza de 10 centímetros de sutura de polipropileno de 4-0 para pasar detrás y levantar la tríada del portal. Utilice un aplicador de abrazadera de micro-serifina con una cerradura para colocar una abrazadera microvascular a la izquierda y la mediana de los lóbulos hepáticos para ocluir todas las estructuras de la tríada del portal.Cuando se observe blanqueo, retire la sutura de polipropileno 4-0 y el pequeño hisopo de algodón y devuelva cuidadosamente el intestino a la cavidad abdominal. Cubra la pared abdominal con una nueva pieza de gasa empapada en PBS y cubra la gasa con una envoltura de plástico para minimizar la pérdida evaporativa. A continuación, vuelva a colocar el ratón en la almohadilla calefactora durante 60 minutos.A lo largo del intervalo isquémico, visualice el blanqueamiento pálido de los lóbulos medial, medial izquierdo y lateral derecho para confirmar la evidencia de la lesión de isquemia. Al final del período de lesión, retire la abrazadera. Para realizar una esplenectomía, levante cuidadosamente el bazo con fórceps lisos y utilice un dispositivo cautery de mano para cauterizar los vasos sanguíneos esplénicos para evitar el sangrado excesivo.Transecte los vasos en la sección cauterizada para eliminar el bazo e inmediatamente utilizar 4-0 suturas de polipropileno para cerrar las incisiones musculares y de la piel en un patrón de sutura de doble capa. A continuación, vuelva a colocar el ratón en su jaula de inicio con monitoreo hasta la recuperación completa. El estrés quirúrgico aumenta significativamente la cantidad de micrometastas preestablecidas dentro del hígado.Esta diferencia se observa incluso dos semanas después de la reperfusión de isquemia en comparación con los ratones no-isquemia reperfundidos. La reperfusión de isquemia hepática y la inyección de células tumorales pueden verse afectadas por la temperatura ambiente y la viabilidad celular, así que tenga cuidado de controlar estas variables. Esta técnica facilita el estudio de los efectos del estrés quirúrgico y la lesión hepática en el crecimiento de la enfermedad metastásica.Esto ayudará a los investigadores a comprender mejor el fenómeno del crecimiento tumoral inducido por la cirugía.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Siguiente Generación de secuenciación para la detección de mutaciones procesable en tumores sólidos y líquidos

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

A Syngeneic Mouse Model of Metastatic Renal Cell Carcinoma for Quantitative and Longitudinal Assessment of Preclinical Therapies

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Renal cell carcinoma (RCC) affects &#62; 60,000 people in the United States annually, and ~ 30% of RCC patients have multiple metastases at the time of ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Desarrollo de un modelo humano de preclínico de osteoclastogénesis de monocitos de sangre periférica cultivadas conjuntamente con líneas de células de cáncer de mama

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Utilización de ultrasonido guiado implantación celular dirigida de tejido para el establecimiento de xenoinjertos de tumores metastásicos biológicamente relevantes