Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر مونيوكا ومعهد تكساس للطب الجينومي (TIGM). وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تكساس A & M.

وكانت جميع عمليات استخدام الحيوانات وتقنياتها متوافقة مع إجراءات التشغيل الموحدة للجنة المؤسسات لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة تكساس A&M.
1. الكبار ماوس هند أطرافه القاصي P3 بتر
<ol><li>تخدير ماوس CD-1 من 8 إلى 12 أسبوعًا (جدولالمواد)باستخدام غاز الإيسوفيلورا...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

يصف هذا البروتوكول إجراءً موحداً لبتر P3 القاصي للماوس البالغين، وتلطيخ الفلورسنت المناعي الكيميائي لتصور وتحرّي تشكيل البلازيما والتحجر داخل الجسم، والمسح المتسلسل داخل الجسم والأشعة المقطعية إلى تحديد العظام المورفولوجية، وحجم، وطول التغييرات بعد البتر. P3 بتر هو نموذج فريد من نوعه، ب...

الثدييات، بما في ذلك البشر والفئران، لديها القدرة على تجديد نصائح من أرقامها بعدبتر القاصي للphalanx الطرفية (P3) 1،2،3. في الفئران، استجابة التجديد تعتمد على مستوى البتر; عمليات بتر الأرقام القريبة بشكل متزايد تظهر استجابة تجديدية مخففة تدريجيًا حتى فشل تجديدي كامل عند بتر الأطراف وتنتقل والقريبة إلى مصفوفة الأظافر P34و5و6 , 7 , 8.يتم التوسط تجديد P3 عن طريق تشكيل blastema، ويعرف بأنه مجموعة من الخلايا المتكاثرة التي تخضع لمورفوجينيسيس لتجديد الهياكل المبتورة9. تشكيل blastema لتجديد الهياكل المفقودة عن طريق بتر، وهي عملية تسمى تجديد شكلي، يميز استجابة تجديد P3 متعددة الأنسجة المستوى من إصلاح الأنسجة التقليدية بعد الإصابة6، 10.P3 التجديد هو نموذج قابل للاستنساخ وبسيطة إجرائيا للتحقيق في العمليات التجديدية المعقدة بما في ذلك التئام الجروح11،12، الانحلال العظام11،12، إعادة الأوعية الدموية13، تجديد العصب المحيطي14، والتحويل الكيسي إلى العظام عن طريق التحجر داخل الأوعية15.
وقد أظهرت الدراسات السابقة باستخدام الكيمياء المناعية أن الانفجار غير متجانسة، والأوعية الدموية، نقص الأكسجة، والانتشار الشديد11،13،15،16. بعد بتر P3 القاصي، ويرتبط في البداية blastema في وقت مبكر مع periosteum P3 وendosteum ويتميز انتشار قوي وosteogenesis الوليدة المتاخمة لسطح العظام15. بعد تدهور العظام وإغلاق الجرح، يتم تشكيل الانفجار غير المتجانس من خلال دمج الخلايا المرتبطة بسرقة البيريوسرقة وendosteal، تليها التمايز بين المكونات الفجائية بما في ذلك العظام عن طريق التحجر داخل التحجر 15.
إصلاح العظام استجابة للإصابة يحدث عادة عن طريق التحجر endochondral، أي عن طريق الكالس الغضروفي الأولي الذي يشكل نموذجا لتشكيل العظام اللاحقة17،18. التحجر العظام طويلة intramembranous، أي تشكيل العظام دون وسيط ة غضروفية، ويحدث عادة باستخدام أجهزة الهاء معقدة أو التثبيت الجراحي19،20. استجابة تجديد الأرقام هو نموذج ما قبل السريرية التي تقدم مزايا على نماذج التحجر داخل memembranous التقليدية: 1) أنها لا تتطلب الخارجية أو الداخلية إصابة ما بعد التثبيت لتحفيز التحجر داخل، 2) فمن يتم تنفيذها باستخدام 4 أرقام من كل الحيوان، وبالتالي تعظيم العينات مع التقليل من استخدام الحيوانات، و 3) متسلسلة في التصوير المقطعي المجهري الجسم (μCT) يمكن أن يتم تحليل بسهولة وسرعة.
في هذه الدراسة، نبين طائرة البتر P3 الموحدة لتحقيق استجابة تجديد قابلة للاستنساخ وقوية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بإظهار بروتوكول الكيمياء المناعية الفلورية الأمثل باستخدام أقسام البارافين لتصور تشكيل blastema، وإعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، وتحويل blastemal إلى العظام عن طريق داخل الباالتخزينان التحجر. كما نبرهن على استخدام التغيرات المتسلسلة في الجسم الحي لتحديد التغيرات في مورفولوجيا العظام وحجمها وطولها في نفس الرقم على مدى التجدد. والهدف من هذا البروتوكول هو التحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات بعد بتر الأطراف وإظهار 2 تقنيات، الفلورة الكيمياء المناعية ومتسلسلة في الجسم الحي μCT، لدراسة تجديد العظام intramembranous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

هنا، نقدم بروتوكول من الكبار الماوس البعيدة محطة phalanx (P3) بتر، نموذج الثدييات بسيطة إجرائيا واستنساخها من التجدد epimorphic، والذي ينطوي على تشكيل blastema والتحجر داخل التحجر تحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتصوير المقطعي المجهري المتسلسل في الجسم الحي (μCT). ويقتصر تجديد الثدييات على عمليات بتر الأطراف التي تنقل المنطقة البعيدة من الفالانكس الطرفي (P3)؛ الأرقام المبتورة في مستويات أكثر شبه ية تفشل في تجديد والخضوع للشفاء الليفي وتشكيل ندبة. يتم التوسط في استجابة التجديد عن طريق تشكيل انفجار التكاثري، تليها تجديد العظام عن طريق التحجر داخل العظام لاستعادة طول الهيكل العظمي المبتور. P3 بتر هو نموذج ما قبل السريرية للتحقيق في التجدد الشكلي في الثدييات، وهو أداة قوية لتصميم الاستراتيجيات العلاجية لاستبدال الشفاء الليفي مع استجابة تجديدية ناجحة. يستخدم بروتوكولنا الكيمياء المناعية الفلورية إلى 1) تحديد مجموعات الخلايا البلاسالتيما في وقت مبكر ومتأخر، 2) إعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، و 3) التحقيق في التحجر داخل العظام دون الحاجة إلى العظام المعقدة أجهزة التثبيت. كما نبرهن على استخدام التسلسلة في الجسم الحي μCT لإنشاء صور عالية الدقة لدراسة التغيرات المورفولوجية بعد البتر، فضلا عن قياس حجم وطول التغيرات في نفس الرقم على مدى التجديد. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر فائدة هائلة للتحقيق في كل من الاستجابات النضوجية والأنسجة التجديدية في الثدييات.

الماوس الكبار تجديد أرقام P3 في 6/7 DPA (الشكل 2A-D)،9 DPA (الشكل2E-H)،و 10 DPA (الشكل2I-L)كانت ملطخة بالمناعة مع الأجسام المضادة لRunx2، OSX، و PCNA لتصور العظام داخل العظام تجديد، والمناعية مع الأجسام المضادة لCXCR4 وvWF لتصور تشكيل blastem...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous

هنا، نقدم بروتوكول اعادة الاستئصال الطرفية للفأر الكبار للتحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات وتحجر داخل الهستيرين، وتحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتتابع في الجسم الحي التصوير المقطعي المجهري.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

يعتبر بتر P3 نموذجًا قبل الظهارة للتحقيق في التجدد الظهاري للثدييات وأداة قوية لتحديد مجموعات الخلايا الحرجة والآليات التي تتحكم في التجدد الداخلي. نموذج P3 يسمح لتحديد مجموعات الخلايا الفجّة المبكرة والمتأخرة ، ودراسة إعادة التجمّع أثناء التجديد ، والتحقيق في القذف داخل الرحم دون متطلبات جهاز تثبيت العظام المعقدة. إظهار الإجراء معي سيكون أسامة قريشي، أليسا فالك، وكاثرين زيميل، فني، وريجينا برونايور، أستاذ باحث مساعد من مختبرنا.بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرصة إصبع القدم في فأر CD-1 يبلغ من العمر ثمانية إلى 12 أسبوعًا ، ضع المرهم على عيون الحيوان ووضع الفأر تحت مجهر تشريح 10X. استخدام جراحية بوديندون اليود و 70٪ الإيثانول لتعقيم أرقام كل طرف خلفي واستخدام microscisors لتقليم الشعر بعيدا عن موقع الجراحة. تطبيق ميكرولتر واحد من bupivacaine موضعي محليا ل التخدير في موقع الجراحة، ولعب بلطف مخلب واحد الخلفي لفضح سطح أرقام الوسيط.ثم عقد مشرط في زاوية موازية للوحة الدهون، واستخدام مشرط معقمة رقم 10 لبتر غيض من phalanx محطة من الأرقام اثنين وأربعة. تطبيق واحد microliter إضافية من bupivacaine محليا إلى كل رقم مبتورة والعودة الماوس إلى قفص نظيف للسماح للجروح للشفاء دون خلع الملابس الجرح ومع رصد حتى إعادة شغل كامل. لضمان نجاح P3 الطائرة بتر، عقد مشرط موازية للوحة الدهون أثناء البتر وإجراء المسح الضوئي المجهرية المقطعية للتأكد من طول البتر الصحيح.عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، استخدم مشرطًا لقطع الرقم في منتصف عظم الفلانيكس الأوسط عند المسافة البادئة للدهن البطيني الثاني تقريبًا. نقل الأنسجة إلى 20 ملليلتر قارورة التلألؤ التي تحتوي على 10 ملليلتر من الزنك الطازجة buffered formalinative لمدة 24 إلى 48 ساعة. واستخدام microtome للحصول على أربعة إلى خمسة أجزاء سميكة ميكرومتر من كل رقم، ووضع شرائح في حمام الماء 38 إلى 41 درجة مئوية تكملها مع محلول لاصق النسيجي كما يتم الحصول عليها.ثم التقط الشرائح على الشرائح اللاصقة ووضع الشرائح على شريحة مئوية 37 درجة أكثر دفئًا حتى يجف. عندما تم deparaffinized الشرائح تزج العينات في جرة تلطيخ من حل استرجاع مستضد المناسبة، وتسخين الشرائح إلى 95 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة مع التأكد من أن الغليان لا يحدث. في نهاية الحضانة، والسماح للجرة أن تأتي إلى درجة حرارة الغرفة، ووضع الشرائح شقة في مربع شريحة بلاستيكية تغطي بوصة واحدة عميق مع ورق الأنسجة مبللة في القاعدة.إضافة 100 ميكرولترات من البروتينات قبل الدفء K إلى كل عينة. تغطية كل شريحة مع شريط صغير من البارا فيلم لضمان أن المقاطع لا تصبح جافة. بعد 12 دقيقة في 37 درجة مئوية، وإزالة بعناية فيلم البارافين، واستنزاف بلطف الشرائح على ورق الأنسجة لإزالة حل منع الزائدة.بعد ذلك، إضافة 100 إلى 200 ميكرولترات من الحل الأجسام المضادة الأولية التي تهم كل شريحة. العودة إلى المواقع إلى غرفة الترطيب مغطاة فيلم البارافين لاحتضان ليلة وضحاها في أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي بعد غسل الشرائح في المالحة TRIS المخزنة بالإضافة إلى TWEEN أو TBST التسمية الشرائح مع حل مناسب للأجسام المضادة الثانوية لاحتضان 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء.في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح في TBST والسماح لهم لتجف. ثم استخدام 100 microliters من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة لوضع بعناية أغطية على الشرائح المجففة وتخزين الشرائح شقة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها محمية من الضوء للسماح المتوسطة تصاعد لتجف. لتسلسل في التصوير المقطعي المجهرية في الجسم الحي أو micro-CT الزي التصوير المقطعي المجهري مع أنابيب لتمكين تدفق الأكسجين داخل وخارج غرفة الحيوانات التصوير المقطعي الصغرى، والتأكد من أن الأكسجين الخارج مجهز مع مرشح الفحم المنشط لاصطياب isoflurane.تعيين Voxelsize إلى 10.5 ميكرومتر في 55 كيلوفولتاج الذروة و 145 ميكرومبير مع 1،000 الإسقاطات لكل 180 درجة وتناوب مستمر مع وقت التكامل من 200 ميلي ثانية، مما أدى إلى حد أقصى 213 شرائح لكل مسح. عندما يكون الماسح الضوئي جاهزًا، ضع الفأر المُجَنَّد بلطف في غرفة الحيوانات المُصغرة المقطعية مع أرقام الأطراف الخلفية مرتبة في جانب بطني مسطح وثيق مع الكف الأيسر على الجانب الأيسر واليسرى على الجانب الأيمن من منصة المسح الضوئي. ثم تطبيق الشريط الجراحي لتأمين بلطف الأرقام في مكان.ضع مرهم العيون على عيون الحيوان قبل بدء الفحص. بعد المسح الضوئي، قم بإعادة الحيوان إلى قفص نظيف مع المراقبة حتى إعادة شغل الوظائف بالكامل، والسماح لعدة ساعات لإعادة بناء صورة التصوير المقطعي الصغرى. لتحليل صورة العظام ثلاثية الأبعاد التي أعيد بناؤها ، وذلك باستخدام البرنامج المقدم مع التصوير المقطعي المصغر ، قم بتحويل ملفات الصور إلى سلسلة من ملفات DICOM.عندما يتم تحويل كافة الملفات، قم بتنزيل سلسلة DICOM في مجلد واحد باستخدام تنزيل ملف دفعي في مستعرض ويب. قم بتحميل المكون الإضافي BoneJ في مجلد المكونات الإضافية ImageJ. سحب و-أفلت المجلد سلسلة ملف DICOM إلى شريط ImageJ لفتح الملفات.سيتم فتح رصة صورة 16 بت تعرض كافة القيم الرمادية. لعرض العظم فقط، انقر فوق ضبط الصورة والعتبة. حرك شريط العتبة العلوي إلى أقصى اليمين واضبط شريط العتبة السفلي حتى يتم تمييز العظم باللون الأحمر فقط.ستكون قيمة العتبة الأدنى حوالي 10,000 إلى 13,000 عند أقصى كثافة إشارة 32,767. انقر فوق تطبيق وفي مربع الحوار الجديد، انقر فوق خلفية سوداء. بعد ذلك، انقر فوق موافق. سيتم إنشاء صورة ثمانية بت عرض قيم بالأسود والأبيض.مع الأبيض المقابلة للعظم. رسم مستطيل حول العظام P3 لتحديده وتكرار المكدس. لإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد، انقر فوق الإضافات والمشاهد ثلاثي الأبعاد واستخدم أداة التحديد اليدوي للدائرة في العظم الذي سيتم حذفه.ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد اختيار التعبئة لاحصد أي عظمة غير ضرورية من الصورة. لتحديد حجم العظام من التقديم ثلاثي الأبعاد، افتح المكون الإضافي BoneJ وحدد كسور الحجم. ستظهر نافذة نتائج، كما سيظهر حجم العظام في ملليمترات مكعبة.لتحديد طول العظام من التقديم ثلاثي الأبعاد، استخدم أداة ImageJ متعددة النقاط. لالتقاط صورة للعرض ثلاثي الأبعاد، انقر فوق عرض وأخذ لقطة. ثم احفظ الصورة كملف TIF أو JPEG.في هذه الصور كانت أجزاء من فأر بالغ تجديد P3 مناعة مع الأجسام المضادة لتصور تجديد العظام داخلmembranous وتشكيل البلاستيما في اليوم السادس إلى السابع وتسعة و 10 بعد البتر. هنا، تظهر عروض التصوير المجهرية المجهرية للأرقام التي تم مسحها ضوئيًا قبل البتر وفي نقاط زمنية مختلفة على مدار التجديد مع المعالم المستخدمة لتحديد قياسات الطول. نموذج رقم الماوس هو نظام قوي لتحليل بيئة جرح مؤيدة للتجديد الذي يؤدي إلى تشكيل البلاستيما عند بترها على مستوى أدنى.وعلى العكس من ذلك، فإن بتر الأرقام في مكان قريب هو بمثابة نظام نموذجي للتحقيق في الفشل التجديدي، فضلا عن موقع لاختبار استراتيجيات تعزيز التجديد.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

التجديد الكلى في اسماك الزرد الكبار قبل جنتاميسين المستحثة الإصابات

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

تحويل جينية كطريقة آمنة وبسيطة للحصول على خلايا إفراز الأنسولين من الخلايا الليفية الجلد الكبار

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

إنشاء الزرد اليرقات "نموذج الحيوان" للتحقيق مثقبيه الكروزية حركية في فيفو

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

الكيميائية البتر والتجديد البلعوم في البلاناريا mediterranea شميدتيا

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

ظهرت مفصص الجزئي: نموذج جراحية لتجديد الكبد مورفولوجك

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...