Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af Muneoka Lab og Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Dette arbejde blev støttet af Texas A & M University.

Alle dyr brug og teknikker var i overensstemmelse med de standardprocedurer for den institutionelle dyrepasning og brug Udvalget af Texas A & M University.
1. voksen mus bagben distal P3 amputation
<ol><li>Anesthetize en 8 til 12 uger gamle CD-1 mus (tabel over materialer) ved hjælp af isofluran gas i ilt; i første omgang bedøve ved 3% i et kammer, efterfulgt af 2% isofluran leveret af en til over varigheden af operationen. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at forhi...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Denne protokol beskriver en standardiseret procedure for voksne mus distale P3 amputation, fluorescerende immun Histokemisk farvning til at visualisere og undersøge tema dannelse og Intramembranous ossifikation, og sekventiel in vivo μct scanning til Identificer knogle morfologiske, volumen og længde ændringer post amputation. P3 amputation er en unik, proceduremæssigt enkel og reproducerbar model til at analysere et Pro-regenerativ sårmiljø, der udløser tema dannelse. Desuden giver P3-cifret model talrige fordel...

Pattedyr, herunder mennesker og mus, har kapacitet til at regenerere spidserne af deres cifre efter distale amputation af terminalen falanks (P3)1,2,3. I mus er regenererings reaktionen amputation-niveau afhængig; stadigt mere proksimale talamputationer viser et progressivt svækket regenerativ respons, indtil komplet regenerativ fejl ved amputationer transekting og proksimalt til P3-negle matrixen4,5,6 , 7 , 8. P3-regenerering medieres ved dannelsen af en blastema, defineret som en population af prolifererende celler, der gennemgår morfogenese for at regenerere de amputerede strukturer9. Dannelsen af en tema for at regenerere de strukturer, der er gået tabt ved amputation, en proces, som kaldes epimorphic regenerering, adskiller P3-regenererings reaktionen på flere vævs niveauer fra traditionel vævsreparation efter skade6, 10. P3-regenerering er en reproducerbar og proceduremæssigt enkel model til undersøgelse af komplekse regenerativ processer, herunder sårheling11,12, knogle histolyse11,12, revaskularisering13, perifer nerve Regeneration14, og blastemal omdannelse til knogle via intramembranøs ossifikation15.
Tidligere studier med immun histokemi har vist, at tema er heterogent, Avaskulær, hypoxisk og meget proliferativ11,13,15,16. Efter distale P3-amputation er den tidlige tema i første omgang associeret med P3 periosteum og som og er karakteriseret ved robust proliferation og spirende osteogenese ved siden af knogleoverfladen15. Efter knoglenedbrydning og sårlukning dannes heterogene tema ved sammensmeltningen af periost-og endosteal-associerede celler, efterfulgt af differentieringen af blastemale komponenter, herunder knogle via intramembranøs ossifikation 15.
Knogle reparation som reaktion på skade opstår typisk ved endokondral ossifikation, dvs. via en indledende brusk, der danner en skabelon for efterfølgende knogledannelse17,18. Lang knogle Intramembranous ossifikation, dvs, knogledannelse uden en brusk mellemliggende, er almindeligt induceret ved hjælp af komplekse distraktion anordninger eller kirurgisk fiksering19,20. Det ciffer regenererende respons er en præklinisk model, der giver fordele i forhold til konventionelle intramembranske ossifikation modeller: 1) det kræver ikke ekstern eller intern fiksering post skade at stimulere Intramembranous ossifikation, 2) det er udført ved hjælp af 4 cifre fra hvert dyr, og dermed maksimere prøver, mens minimere dyrs brug, og 3) sekventiel in vivo mikrocomputer tomografi (μCT) analyse kan udføres med lethed og hastighed.
I denne undersøgelse viser vi det standardiserede P3-amputerings plan for at opnå et reproducerbart og robust regenererings respons. Derudover demonstrerer vi en optimeret fluorescens immunhistokemisk protokol ved hjælp af paraffin sektioner for at visualisere tema dannelse, revaskularisering i forbindelse med regenerering og blastemal omdannelse til knogle via Intramembranous Ossifikation. Vi viser også brugen af sekventiel in vivo μCT til at identificere ændringer i knogle morfologi, volumen og længde i det samme ciffer i løbet af regenerering. Formålet med denne protokol er at undersøge dannelsen af pattedyr tema efter amputation og at påvise 2 teknikker, fluorescens Immunhistokemi og sekventiel in vivo μct, til studiet af intramembranøs knogle regenerering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Her præsenterer vi en protokol af voksne mus distale Terminal falanks (P3) amputation, en proceduremæssigt enkel og reproducerbar pattedyrs model af epimorphic regenerering, som involverer tema dannelse og Intramembranous ossifikation analyseret af Fluorescens Immunhistokemi og sekventiel in vivo-mikrocomputer tomografi (μCT). Regenerering af pattedyr er begrænset til amputationer, der transektere den distale region af terminalen falanks (P3); cifre amputeret på mere proksimale niveauer undlader at regenerere og gennemgå fibrotisk helbredelse og ardannelse. Regenererings reaktionen medieres ved dannelsen af en proliferativ blastema, efterfulgt af knogle regenerering via intramembranøs ossifikation for at genoprette den amputerede skelet længde. P3 amputation er en præklinisk model til at undersøge epimorphic regenerering i pattedyr, og er et effektivt værktøj til design af terapeutiske strategier til at erstatte fibrotisk helbredelse med en vellykket regenerativ respons. Vores protokol bruger fluorescens Immunhistokemi til 1) identificere tidlige-og-sene tema cellepopulationer, 2) undersøgelse revaskularisering i forbindelse med regenerering, og 3) undersøge Intramembranous ossifikation uden behov for komplekse knogle stabiliseringsanordninger. Vi viser også brugen af sekventiel in vivo μCT til at skabe billeder i høj opløsning til at undersøge morfologiske ændringer efter amputation, samt kvantificere volumen-og længde ændringer i det samme ciffer i løbet af regenerering. Vi mener, at denne protokol tilbyder enorm nytte til at undersøge både epimorphic og vævs regenerativ reaktioner i pattedyr.

Voksne mus regenererende P3-cifre ved 6/7 DPA(figur 2a-D), 9 DPA(figur 2E-H) og 10 DPA (figur 2i-L) var immun farvede med antistoffer mod Runx2, OSX og pcna til at visualisere Intramembranous knogle immun plettet med antistoffer mod CXCR4 og vWF for at visualisere tema dannelse. Repræsentative μCT-gengivelser af cifre, der er scannet før amputation, og på forskellige tidspunkter...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Amputation og regenerering af voksent muse ciffer: en simpel model til undersøgelse af dannelsen af pattedyrs blastema og Intramembranøs ossifikation

Her præsenterer vi en protokol af voksne mus Terminal falanks amputation at undersøge pattedyrs tema dannelse og Intramembranous ossifikation, analyseret af fluorescerende Immunhistokemi og sekventiel in vivo mikrocomputer tomografi.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 amputation er en præklinisk model til undersøgelse af pattedyr epimorfe regenerering og et effektivt værktøj til at identificere kritiske cellepopulationer og mekanismer, der styrer endogen regenerering. P3-modellen gør det muligt at identificere tidlige og sene blastemale cellepopulationer, undersøgelse af revaskularisering under regenerering og undersøgelse af intramembranøs ossifikation uden komplekse krav til knoglestabiliseringsanordning. At demonstrere proceduren med mig vil være Osama Qureshi, Alyssa Falck, og Katherine Zimmel, tekniker, og Regina Brunaeur, en forskningsprofessor alle fra vores laboratorium.Efter at have bekræftet en manglende reaktion på tå knivspids i en otte til 12-ugers gamle CD-1 mus, Påfør salve til dyrets øjne og placere musen under en 10X dissektion mikroskop. Brug kirurgisk povidone jod og 70% ethanol til at sterilisere cifrene i hver baglem og bruge microscissors at trimme hår væk fra operationsstedet. Påfør en microliter af topiske bupivacaine lokalt at bedøve det kirurgiske sted, og forsigtigt splay en bagpote at afsløre den mediale ciffer overflade.Derefter holde skalpel i en vinkel parallelt med fedt pad, skal du bruge en steril nummer 10 skalpel til at amputere den distale spidsen af terminalen falanks af cifre to og fire. Påfør en ekstra mikroliter af bupivacain lokalt til hver amputeret ciffer og returnere musen til et rent bur for at tillade sårene til at helbrede uden sårbandage og med overvågning, indtil fuld recumbency. For at sikre en vellykket P3 amputation plan, holde skalpel parallelt med fedt pad under amputation og udføre mikro-CT-scanning for at bekræfte den korrekte amputation længde.På passende eksperimentelle endepunkt, bruge en skalpel til at afskære ciffer midtvejs gennem den midterste falanks knogle på ca den anden ventral fedt pad indrykning. Vævet overføres til et 20-milliliter scintillationsglas indeholdende 10 milliliter frisk buffered zink formalin fixativ i 24 til 48 timer. Og brug en mikrotom til at erhverve fire til fem mikrometer tykke dele af hvert ciffer, placere skiver i en 38 til 41 grader Celsius vandbad suppleret med en histologisk klæbemiddel løsning, som de er opnået.Derefter fange skiver på klæbende dias og placere dias på en 37-graders Celsius slide varmere til tørre. Når objektglassene er blevet deparaffineret, nedsænkes prøverne i en farvningsglas af en passende antigenudtagningsopløsning, og lyser objektglassene til 95 grader Celsius i 25 minutter og sørger for, at kogningen ikke forekommer. I slutningen af inkubationen, lad krukken til at komme til stuetemperatur, og læg dias fladt i en one-inch dyb dækket plast slide boks med fugtet silkepapir i bunden.Der tilsættes 100 mikroliter af forvarmet proteinase K til hver prøve. Dæk hvert dias med en lille strimmel parafilm for at sikre, at sektionerne ikke bliver tørre. Efter 12 minutter ved 37 grader Celsius fjernes paraffinfilmen forsigtigt, og slides forsigtigt tømmes på silkepapir for at fjerne overskydende blokerende opløsning.Dernæst tilsættes 100 til 200 mikroliter af den primære antistofopløsning af interesse for hvert dias. Returner stederne til det befugtende kammer dækket med paraffinfilm til en overnatning inkubation ved fire grader Celsius. Næste morgen efter vask af objektglas i TRIS-bufferet saltvand plus TWEEN eller TBST mærke dias med en passende sekundær antistofopløsning til en 45-minutters inkubation ved stuetemperatur beskyttet mod lys.Ved slutningen af inkubationen vaskes objektglassene i TBST, og de skal tørre. Brug derefter 100 mikroliter af anti-fade montering medium til forsigtigt placere coverslips på de tørrede dias og gemme dias fladt ved stuetemperatur natten beskyttet mod lys, så montering medium til tørre. For sekventiel in vivo mikro-computertomografi eller mikro-CT outfit mikro-CT imager med slanger for at muliggøre ilt flow ind og ud af mikro-CT dyrekammer, og sørg for, at den udstrømmende ilt er udstyret med en aktiveret trækul filter til at fælde isofluran.Indstil Voxelsize til 10,5 mikrometer på 55 peak kilovoltage og 145 mikroampere med 1.000 fremskrivninger pr. 180 grader og kontinuerlig rotation med en integrationstid på 200 millisekunder, hvilket resulterer i maksimalt 213 skiver pr. scanning. Når scanneren er klar, forsigtigt placere bedøvet musen i mikro-CT dyrekammer med baglempen cifre arrangeret i flad, tæt forening ventrale side op med venstre pote på venstre side og højre på højre side af scanningen platform. Derefter anvende kirurgisk tape til forsigtigt at fastgøre cifrene på plads.Påfør oftalmologiske salver i dyrets øjne, før scanningen påbegyndes. Efter scanning, returnere dyr til et rent bur med overvågning, indtil fuld recumbency, og give op til flere timer for mikro-CT billede rekonstruktion. Til analyse af det rekonstruerede 3D-knoglebillede skal billedfilerne konverteres til en række DICOM-filer ved hjælp af den software, der følger med mikro-CT.Når alle filerne er blevet konverteret, skal du hente DICOM-serien i en enkelt mappe ved hjælp af en batchfiloverførsel i en webbrowser. Læg Plug-in'en BoneJ i plug-in-mappen ImageJ. Træk og slip mappen DICOM-filserien ind på ImageJ-linjen for at åbne filerne.En 16-bit billedstak, der viser alle de grå værdier, åbnes. Hvis du kun vil have vist knogle, skal du klikke på Billedjustering og Tærskelværdi. Skub den øvre tærskellinje længst til højre, og juster den nedre tærskellinje, indtil kun knoglen er fremhævet rød.Den lavere tærskelværdi vil være ca. 10.000 til 13.000 ved en maksimal signalintensitet på 32,767. Klik på Anvend, og klik på Sort baggrund i den nye dialogboks. Klik derefter på OK. Der genereres et otte-bit billede med sorte og hvide værdier.Med den hvide svarende til knogle. Tegn et rektangel omkring P3-knoglen for at markere den og duplikere stakken. Hvis du vil generere et 3D-billede, skal du klikke på Plugins og 3D Viewer og bruge frihåndsmarkeringsværktøjet til at kredse om den knogle, der skal slettes.Højreklik derefter, og vælg Fyldmarkering for at beskære unødvendige knogler fra billedet. Hvis du vil kvantificere knoglevolumenet fra 3D-gengivelsen, skal du åbne BoneJ-plug-in'en og vælge Volumenfraktion. Der vises et resultatvindue, og knoglevolumenet vises i millimeter i kubik.Hvis du vil kvantificere knoglelængden fra 3D-gengivelsen, skal du bruge værktøjet ImageJ multipunkt. Hvis du vil tage et billede af 3D-gengivelsen, skal du klikke på Vis og tage et øjebliksbillede. Gem derefter billedet som en TIF- eller JPEG-fil.I disse billeder sektioner af en voksen mus regenererende P3 ciffer blev immunostained med antistoffer til at visualisere intramembranøs knogle regenerering og blastema dannelse på dag seks til syv, ni og 10 efter amputation. Her vises repræsentative mikro-CT-gengivelser af cifre, der scannes før amputation, og på forskellige tidspunkter i løbet af regenerering med landemærker, der bruges til at identificere længdemålinger. Museciffermodellen er et kraftfuldt system til analyse af et progenererende sårmiljø, der udløser blastemadannelse, når den amputeres på et distalt niveau.Omvendt, proksimale amputation af cifrene tjener som en model system til undersøgelse af regenerativ svigt samt et sted for test strategier for at forbedre regenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Zebrafisk af Gentamicin induceret skade

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Underskudsgivende og Gain-of-funktion tilgang til Undersøge Tidlig Cell Fate Determinanter i præimplantationsperioden Mouse Embryoner

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk Konvertering som en sikker og enkel metode til at opnå insulinproducerende celler fra voksne hud fibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Opbygning Finite Element Modeller til undersøgelse Zebrafisk Jaw Biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur af murine embryonale Mellemfodsben: en fysiologisk model af endochondral ossifikation

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering af larve zebrafisk som en dyr Model til at undersøge Trypanosoma cruzi motilitet In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserede osteoklast kultur Assay af musen knoglemarven til at undersøge rollen, som mTORC1 i osteoklast dannelse

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Kemiske Amputation og regenerering af svælget i Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Delvis dråbeformede Hepatectomy: En kirurgisk Model for morfologiske lever regenerering

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode til at isolere primære humane keratinocytter fra voksen hudvæv

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...