Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Wij danken de leden van het Muneoka Lab en het Texas Institute for genomic Medicine (TIGM). Dit werk werd gesteund door Texas A & M University.

Alle dier gebruik en-technieken waren in overeenstemming met de standaardwerk procedures van het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Texas A & M University.
1. volwassen muis Hind ledemaat distale P3 amputatie
<ol><li>Anesthetiseer een 8 tot 12 week oude cd-1 muis (tabel met materialen) met behulp van Isofluraan gas in zuurstof; aanvankelijk anesthetiseren bij 3% in een kamer, gevolgd door 2% Isofluraan geleverd door een neuskegel over de duur van de operatie. ...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde procedure van volwassen muis distale P3 amputatie, fluorescerende immunohistochemische kleuring om blastema vorming en intramembraneuze ossificatie te visualiseren en te onderzoeken, en sequentieel in-vivo μCT scanning om Identificeer botmorfologische, volume-en lengte wijzigingen na amputatie. P3-amputatie is een uniek, procedureel eenvoudig en reproduceerbaar model om een Pro-regeneratieve wondomgeving te analyseren die blastema-vorming activeert. Bovendien biedt het P3-c...

Zoogdieren, met inbegrip van mensen en muizen, hebben de capaciteit om de toppen van hun cijfers te regenereren na distale amputatie van de Terminal falanx (P3)1,2,3. Bij muizen is de regeneratie reactie amputatie-niveau afhankelijk; in toenemende mate van proximale cijfers wordt een geleidelijk verzwakte regeneratieve respons weergegeven totdat volledig regeneratief falen bij amputaties Romeinse en proximale naar de P3-nagel matrix4,5,6 , 7 , 8. P3-regeneratie wordt gemedieerd door de vorming van een blastema, gedefinieerd als een populatie van prolifererende cellen die morfogenese ondergaan om de geampuleerde structuren te regenereren9. De vorming van een blastema om de door amputatie verloren structuren te regenereren, een proces dat epimorfe regeneratie wordt genoemd, onderscheidt de P3-regeneratie respons op multi weefselniveau van de traditionele weefselherstel na blessure6, 10. P3-regeneratie is een reproduceerbaar en procedureel eenvoudig model om complexe regeneratieve processen te onderzoeken, waaronder wondgenezing11,12, bot histolysis11,12, revascularisatie13, perifere zenuw regeneratie14, en blastemal conversie naar bot via intramembraneuze ossificatie15.
Uit eerdere studies met immunohistochemie is gebleken dat de blastema heterogeen, avasculair, hypoxisch en zeer proliferatief is11,13,15,16. Na de distale P3-amputatie wordt de vroege blastema in eerste instantie geassocieerd met het P3-periosteum en endosteum en wordt gekenmerkt door een robuuste proliferatie en ontluikende osteogenese grenzend aan het botoppervlak15. Na botdegradatie en wondsluiting wordt de heterogene blastema gevormd door het samenvoegen van periostehoudende en endosteal geassocieerde cellen, gevolgd door de differentiatie van blastemale componenten, waaronder bot via intramembraneuze ossificatie 15.
Botreparatie in reactie op letsel treedt meestal op door endochondrale ossificatie, d.w.z. via een initiële kraakbeenachtige Callus die een sjabloon vormt voor daaropvolgende botvorming17,18. Lange botintramembraneuze ossificatie, d.w.z. botvorming zonder kraakbeen middel, wordt vaak geïnduceerd met behulp van complexe afleid inrichtingen of chirurgische fixatie19,20. De Digit-regeneratie respons is een preklinisch model dat voordelen biedt ten opzichte van conventionele intramembraneuze ossificatie modellen: 1) het vereist geen externe of interne fixatie post letsel om intramembraneuze ossificatie te stimuleren, 2) het is uitgevoerd met 4 cijfers van elk dier, waardoor monsters worden gemaximaliseerd terwijl het dier gebruik wordt geminimaliseerd, en 3) sequentiële in vivo microcomputer tomografie (μCT) analyse kan met gemak en snelheid worden uitgevoerd.
In de huidige studie tonen we het gestandaardiseerde P3-amputatie vlak om een reproduceerbare en robuuste regeneratie respons te bereiken. Daarnaast demonstreren we een geoptimaliseerd fluorescentie immunohistochemie protocol met behulp van paraffine secties om de vorming van blastema, revascularisatie in de context van regeneratie en de blastemal conversie naar het bot via intramembraneuze ossificatie. We demonstreren ook het gebruik van sequentieel in-vivo μCT om veranderingen in botmorfologie, volume en lengte in hetzelfde cijfer te identificeren in het verloop van de regeneratie. Het doel van dit protocol is om de vorming van zoogdieren blastema na amputatie te onderzoeken en om 2 technieken, fluorescentie immunohistochemie en sequentieel in vivo μCT te demonstreren, voor de studie van intramembraneuze botregeneratie.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen distale terminale falanx (P3) amputatie, een procedureel eenvoudig en reproduceerbaar zoogdier model van epimorfe regeneratie, dat blastema-vorming en intramembraneuze ossificatie omvat, geanalyseerd door fluorescentie immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie (μCT). De zoogdier regeneratie is beperkt tot amputaties die het distale gebied van de terminale falanx (P3) dwars doorkruisen; cijfers geampuleerd op meer proximale niveaus niet te regenereren en ondergaan fibrotische genezing en littekenvorming. De regeneratie respons wordt gemedieerd door de vorming van een proliferatieve blastema, gevolgd door botregeneratie via intramembraneuze ossificatie om de geampuleerde skelet lengte te herstellen. P3 amputatie is een preklinisch model om epimorfe regeneratie bij zoogdieren te onderzoeken, en is een krachtig hulpmiddel voor het ontwerpen van therapeutische strategieën om fibrotische genezing te vervangen door een succesvolle regeneratieve respons. Ons protocol maakt gebruik van fluorescentie immunohistochemie op 1) Identificeer vroege en late blastema celpopulaties, 2) Bestudeer revascularisatie in de context van regeneratie, en 3) onderzoek intramembraneuze ossificatie zonder de noodzaak van complexe botten stabilisatie apparaten. We demonstreren ook het gebruik van sequentiële in-vivo μCT om afbeeldingen met een hoge resolutie te maken om morfologische veranderingen na amputatie te onderzoeken, en om volume-en lengte veranderingen in hetzelfde cijfer te kwantificeren tijdens de regeneratie. Wij geloven dat dit protocol een enorm nut biedt om zowel epimorfe als weefsel regeneratieve reacties bij zoogdieren te onderzoeken.

Volwassen muis regenereert P3-cijfers bij 6/7 DPA(afbeelding 2a-D), 9 DPA(figuur 2e-H) en 10 DPA (figuur 2i-L) waren immunogekleurd met antilichamen tegen Runx2, OSX en pcna om intramembraneuze botten te visualiseren en immunobevlekt met antilichamen tegen CXCR4 en vWF om de vorming van blastema te visualiseren. Representatief μCT-weergave van de cijfers die zijn gescand vóór de ...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken

Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 amputatie is een preklinisch model voor het onderzoeken van zoogdier epimorfe regeneratie en een krachtig instrument voor het identificeren van kritische cel populaties en mechanismen die endogene regeneratie controle. Het P3-model maakt het mogelijk om vroege en late blastemalcelpopulaties, de studie van revascularisatie tijdens regeneratie en het onderzoek naar intramembraneuze ossificatie zonder complexe vereisten voor botstabilisatie te identificeren. Het aantonen van de procedure met mij zal Osama Qureshi, Alyssa Falck, en Katherine Zimmel, technicus, en Regina Brunaeur, een Research Assistant Professor allemaal uit ons laboratorium.Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een acht tot 12 weken oude CD-1 muis, Breng zalf op de ogen van het dier en plaats de muis onder een 10X dissectie microscoop. Gebruik chirurgisch povidon jodium en 70% ethanol om de cijfers van elke achterpoot te steriliseren en microscissors te gebruiken om het haar weg te knippen van de chirurgische plaats. Breng een microliter van actuele bupivacaine lokaal aan om de chirurgische site te verdoven en speel voorzichtig een achterpoot om het mediale cijferoppervlak bloot te leggen.Vervolgens houdt u de scalpel in een hoek parallel aan het vetpad, gebruik een steriele nummer 10 scalpel om de distale punt van de terminale falanx van cijfers twee en vier te amputeren. Breng een extra microliter van bupivacaine lokaal aan op elk geamputeerd cijfer en breng de muis terug naar een schone kooi om de wonden te laten genezen zonder wondverband en met controle tot volledige recumbency. Om een succesvol P3 amputatievlak te garanderen, houdt u de scalpel parallel aan het vetkussen tijdens de amputatie en voert u micro-CT-scans uit om de juiste amputatielengte te bevestigen.Gebruik op het juiste experimentele eindpunt een scalpel om het cijfer halverwege het middelste falanxbot te verbreken bij ongeveer het tweede ventrale vetpadinspringing. Breng het weefsel over op een 20-milliliter scintillatie flacon met 10 milliliter vers gebufferd zinkformal fixatiemiddel gedurende 24 tot 48 uur. En gebruik een microtome om vier tot vijf micrometer dikke delen van elk cijfer te verwerven, waarbij de plakjes in een waterbad van 38 tot 41 graden Celsius worden geplaatst, aangevuld met een histologische lijmoplossing zoals ze worden verkregen.Leg vervolgens de plakjes vast op kleefplaten en plaats de dia's op een schuifwarmer van 37 graden Celsius om te drogen. Wanneer de dia's zijn gedeparaffiniseerd dompel de monsters onder in een kleurpot van een geschikte antigeen retrieval oplossing, en verwarm de dia's tot 95 graden Celsius gedurende 25 minuten ervoor te zorgen dat koken niet optreedt. Aan het einde van de incubatie, laat de pot te komen tot kamertemperatuur, en leg de dia's plat in een een-inch diep overdekte plastic schuifdoos met bevochtigd tissue papier aan de basis.Voeg 100 microliter voorverwarmde proteinase K toe aan elk monster. Bedek elke dia met een kleine strook parafilm om ervoor te zorgen dat de secties niet droog worden. Verwijder na 12 minuten bij 37 graden Celsius voorzichtig de paraffinefilm en laat de glijbanen voorzichtig uitlekken op tissuepapier om overtollige blokkeringsoplossing te verwijderen.Voeg vervolgens 100 tot 200 microliters van de primaire antilichaamoplossing toe die van belang is voor elke dia. Breng de locaties terug naar de bevochtigingskamer bedekt met paraffinefilm voor een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius. De volgende ochtend na het wassen van de glijbanen in TRIS-gebufferde zoutoplossing plus TWEEN of TBST label de dia's met een passende secundaire antilichaamoplossing voor een 45 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de dia's in TBST en laat ze drogen. Gebruik vervolgens 100 microliters van anti-fade montagemedium om coverslips zorgvuldig op de gedroogde glijbanen te plaatsen en bewaar de glijbanen 's nachts plat bij kamertemperatuur beschermd tegen licht om het montagemedium te laten drogen. Voor sequentiële in vivo micro-computertomografie of micro-CT outfit de micro-CT imager met buizen om zuurstof te laten stromen in en uit de micro-CT dierenkamer, ervoor te zorgen dat de uitstromende zuurstof is uitgerust met een actieve kool filter om de isoflurane val.Stel de Voxelsize in op 10,5 micrometer op 55 piekkiptenspanning en 145 microamps met 1.000 projecties per 180 graden en continue rotatie met een integratietijd van 200 milliseconden, wat resulteert in een maximum van 213 segmenten per scan. Wanneer de scanner klaar is, plaats dan voorzichtig de verdoofde muis in de micro-CT dierenkamer met de achterste ledematen cijfers gerangschikt in plat, sluit associatie ventrale kant omhoog met de linkerpoot aan de linkerkant en rechts aan de rechterkant van het scanplatform. Breng vervolgens chirurgische tape aan om de cijfers voorzichtig op hun plaats te zetten.Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen van het dier voordat u de scan initieert. Na het scannen, breng het dier terug naar een schone kooi met controle tot volledige recumbency, en laat tot enkele uren voor micro-CT beeldreconstructie. Voor analyse van de gereconstrueerde 3D-botafbeelding, met behulp van de software die met de micro-CT wordt geleverd, zet u de afbeeldingsbestanden om naar een reeks DICOM-bestanden.Wanneer alle bestanden zijn geconverteerd, downloadt u de DICOM-serie in één map met behulp van een batchbestandsdownloader in een webbrowser. Laad de BoneJ-plug-in in de map ImageJ-plug-in. Sleep en zet de map met de DICOM-bestandsreeks naar de ImageJ-balk om de bestanden te openen.Er wordt een 16-bits afbeeldingsstapel geopend die alle grijze waarden weergeeft. Als u alleen bot wilt weergeven, klikt u op Afbeelding aanpassen en Drempelwaarde. Schuif de bovenste drempelbalk naar rechts en pas de onderste drempelbalk aan totdat alleen het bot rood is gemarkeerd.De lagere drempelwaarde zal ongeveer 10.000 tot 13.000 zijn bij een maximale signaalintensiteit van 32, 767. Klik op Toepassen en klik in het nieuwe dialoogvenster op Zwarte achtergrond. Klik vervolgens op OK. Er wordt een acht-bits afbeelding met zwart-witwaarden gegenereerd.Met het wit dat overeenkomt met het bot. Teken een rechthoek rond het P3-bot om deze te selecteren en de stapel te dupliceren. Als u een 3D-afbeelding wilt genereren, klikt u op Plug-ins en 3D-viewer en gebruikt u het gereedschap uit de vrije hand om het te verwijderen bot te omcirkelen.Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Selectie vullen om onnodige bot uit de afbeelding bij te snijden. Als u het botvolume van de 3D-rendering wilt kwantificeren, opent u de BoneJ-plug-in en selecteert u Volumefractie. Er verschijnt een resultatenvenster en het botvolume wordt weergegeven in millimeters.Als u de botlengte van de 3D-rendering wilt kwantificeren, gebruikt u het gereedschap ImageJ-multipunt. Als u een afbeelding van de 3D-weergave wilt vastleggen, klikt u op Weergave en maakt u een momentopname. Sla de afbeelding vervolgens op als een TIF- of JPEG-bestand.In deze beelden werden delen van een volwassen muis die P3-cijfer regenereert immunostained met antilichamen om intramembraneuze botregeneratie en blastemavorming te visualiseren op dag zes tot zeven, negen en tien na amputatie. Hier worden representatieve micro-CT-renderings van cijfers getoond die vóór de amputatie en op verschillende tijdstippen in de loop van de regeneratie met oriëntatiepunten worden gebruikt om lengtemetingen te identificeren. Het muiscijfermodel is een krachtig systeem voor het analyseren van een pro-regeneratieve wondomgeving die blastemavorming activeert wanneer het op een distaal niveau wordt geamputeerd.Omgekeerd, proximale amputatie van de cijfers dient als een modelsysteem voor het onderzoeken van regeneratieve falen en een site voor het testen van strategieën voor het verbeteren van regeneratie.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetische Conversie als een veilige en eenvoudige methode om insuline-afscheidende cellen van volwassen huidfibroblasten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Het bouwen van Finite Element modellen te onderzoeken zebravis Jaw biomechanica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultuur van muizen embryonale Middenvoetsbeentjes: Een Fysiologische Model van endochondrale Verbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Gedeeltelijke lobulair Hepatectomy: Een chirurgische Model voor morfologische lever regeneratie

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...