Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Nous remercions les membres du Laboratoire Muneoka et du Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Ce travail a été soutenu par l'Université texasA et M.

Toutes les techniques et l'utilisation des animaux étaient conformes aux procédures d'exploitation standard du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université Texas A et M.
1. Adulte Souris Hind Limb Distal P3 Amputation
<ol><li>Anesthésiez une souris CD-1 de 8 à 12 semaines (Tableaudes matériaux)en utilisant du gaz isoflurane dans l'oxygène; d'abord anesthésier à 3% dans une chambre, suivie de 2% isoflurane fourni par un cône de nez su...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Ce protocole décrit une procédure normalisée de l'amputation distale de P3 de souris adulte, de la coloration immunohistochemical fluorescente pour visualiser et étudier la formation de blastma et l'ossification intramembrane, et le balayage in-vivo séquentieux de CT à identifier les changements morphologiques, de volume et de longueur d'os après l'amputation. L'amputation de P3 est un modèle unique, procéduralement simple, et reproductible pour analyser un environnement pro-régénératif de blessure qui décle...

Les mammifères, y compris les humains et les souris, ont la capacité de régénérer les pointes de leurs chiffres après l'amputation distale de la phalange terminale (P3)1,2,3. Chez la souris, la réponse de régénération est dépendante de l'amputation; les amputations de chiffre de plus en plus proximales affichent une réponse régénérative progressivement atténuée jusqu'à l'échec régénératif complet aux amputations transectant et proximal à la matrice d'ongle de P34,5,6 , 7 Annonces , 8. La régénération de P3 est médiée par la formation d'un blastma, défini comme une population de cellules proliférantes qui subissent la morphogénèse pour régénérer les structures amputées9. La formation d'un blastma pour régénérer les structures perdues par amputation, un processus appelé régénération épimorphe, distingue la réponse de régénération P3 multi-tissu-niveau de la réparation traditionnelle de tissu après blessure6, 10. La régénération de P3 est un modèle reproductible et procéduralement simple pour étudier les processus régénératifs complexes comprenant la guérison de blessure11,12, histolyse d'os11,12, revascularisation13, régénération nerveuse périphérique14, et conversion blastmalà l'os par ossification intramembrane1 .
Des études antérieures utilisant l'immunohistochimie ont démontré que le blastema est hétérogène, avascular, hypoxique, et fortement proliférant11,13,15,16. Après l'amputation distale de P3, le blastema tôt est au commencement associé au périosteum et à l'endosteum de P3 et est caractérisé par la prolifération robuste et l'ostéogenèse naissante adjacente à la surface d'os15. Après la dégradation d'os et la fermeture de blessure, le blastma hétérogène est formé par la fusion des cellules periosteal et endosteal-associées, suivie par la différenciation des composants blastmal comprenant l'os par l'ossification intramembrane 15.
La réparation osseuse en réponse à des blessures se produit généralement par ossification endochondrale, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un callus cartilagineux initial qui forme un modèle pour la formation osseuse ultérieure17,18. L'ossification intramembrane à long os, c.-à-d., formation d'os sans intermédiaire cartilagineux, est généralement induite utilisant des dispositifs complexes de distraction ou la fixation chirurgicale19,20. La réponse de régénération de chiffre est un modèle préclinique qui offre des avantages au-dessus des modèles conventionnels d'ossification intramembrane : 1) il n'exige pas la blessure externe ou interne de poteau de fixation pour stimuler l'ossification intramembrane, 2) il est réalisée à l'aide de 4 chiffres de chaque animal, maximisant ainsi les échantillons tout en minimisant l'utilisation des animaux, et 3) l'analyse de la tomographie microcomputée in vivo séquentielle peut être effectuée avec facilité et rapidité.
Dans la présente étude, nous montrons le plan standardisé d'amputation de P3 pour réaliser une réponse reproductible et robuste de régénération. En outre, nous démontrons un protocole optimisé d'immunohistochemistry de fluorescence utilisant des sections de paraffine pour visualiser la formation de blastma, la revascularisation dans le contexte de la régénération, et la conversion blastmal à l'os par l'intermédiaire intramembranous Ossification. Nous démontrons également l'utilisation de l'invivo séquentiel pour identifier des changements dans la morphologie, le volume, et la longueur d'os dans le même chiffre au cours de la régénération. L'objectif de ce protocole est d'étudier la formation de blastma mammifère après l'amputation et de démontrer 2 techniques, l'immunohistochemistry de fluorescence et le TCT in vivo séquentiel, pour l'étude de la régénération osseuse intramembrane.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Ici, nous présentons un protocole de la phalange terminale adulte de souris (P3) amputation, un modèle mammifère procéduralement simple et reproductible de régénération épimorphe, qui implique la formation de blastma et l'ossification intramembrane analysée par immunohistochemistry de fluorescence et tomographie microcomputée in vivo séquentielle (CT). La régénération des mammifères est limitée aux amputations transectant la région distale de la phalange terminale (P3); les chiffres amputés à des niveaux plus proximal s'échouent et subissent la guérison fibrotique et la formation de cicatrices. La réponse de régénération est médiée par la formation d'un blastème proliférant, suivi de la régénération d'os par l'ossification intramembrane pour reconstituer la longueur squelettique amputée. L'amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique chez les mammifères, et est un outil puissant pour la conception des stratégies thérapeutiques pour remplacer la guérison fibrotique par une réponse régénérative réussie. Notre protocole utilise l'immunohistochimie de fluorescence pour 1) identifier les populations tôt et tard de cellules de blastma, 2) la revascularisation d'étude dans le contexte de la régénération, et 3) étudier l'ossification intramembrane sans avoir besoin d'os complexe dispositifs de stabilisation. Nous démontrons également l'utilisation de l'in vivo séquentiel pour créer des images haute résolution pour examiner les changements morphologiques après l'amputation, ainsi que pour quantifier les changements de volume et de longueur dans le même chiffre au cours de la régénération. Nous croyons que ce protocole offre une utilité énorme pour étudier les réponses épimorphiques et régénératrices tissulaires chez les mammifères.

La souris adulte régénérant des chiffres P3 à 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Figure 2E-H), et 10 DPA (Figure 2I-L) ont été immunostained avec des anticorps à Runx2, OSX, et PCNA pour visualiser l'os intramembrane la régénération, et immunostained avec des anticorps à CXCR4 et vWF pour visualiser la formation de blastma. Les rendus représentatifs de la CT des chiffres num?...

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Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Ici, nous présentons un protocole de l'amputation de phalange terminale de souris adulte pour étudier la formation de blastma de mammifères et l'ossification intramembrane, analysée par l'immunohistochemistry fluorescent et la tomographie microcomputed in-vivo séquentielle.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

L’amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique des mammifères et un outil puissant pour identifier les populations cellulaires critiques et les mécanismes qui contrôlent la régénération endogène. Le modèle P3 permet l’identification des populations de cellules blastémales précoces et tardives, l’étude de la revascularisation pendant la régénération, et l’étude de l’ossification intramembranous sans besoins complexes de dispositif de stabilisation osseuse. Oussama Qureshi, Alyssa Falck et Katherine Zimmel, technicienne, et Regina Brunaeur, professeure adjointe de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi.Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris CD-1 de huit à 12 semaines, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et placez la souris sous un microscope à dissection de 10 X. Utilisez de l’iode chirurgical de povidone et 70% d’éthanol pour stériliser les chiffres de chaque membre postérieur et utilisez des microscisseurs pour couper les cheveux loin du site chirurgical. Appliquer localement un microlitre de bupivacaine topique pour anesthésier le site chirurgical, et jouer doucement une patte arrière pour exposer la surface des chiffres médiaux.Puis en tenant le scalpel à un angle parallèle à la garniture de graisse, utilisez un scalpel stérile numéro 10 pour amputer la pointe distale de la phalange terminale des chiffres deux et quatre. Appliquez localement un microlitre supplémentaire de bupivacaine sur chaque chiffre amputé et retournez la souris dans une cage propre pour permettre aux plaies de guérir sans pansement et avec surveillance jusqu’à ce qu’elles soient complètement récumbency. Pour assurer un plan d’amputation P3 réussi, maintenez le scalpel parallèle à la graisse pendant l’amputation et effectuez le balayage de micro-CT pour confirmer la longueur correcte d’amputation.Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez un scalpel pour couper le chiffre à mi-chemin à travers l’os de phalange moyenne à peu près le deuxième tampon de graisse ventrale indent. Transférer le tissu dans un flacon de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de formaline de zinc tamponné frais fixatif pendant 24 à 48 heures. Et utilisez un microtome pour acquérir quatre à cinq sections micromètres d’épaisseur de chaque chiffre, plaçant les tranches dans un bain d’eau de 38 à 41 degrés Celsius complété par une solution adhésive histologique au fur et à mesure qu’elles sont obtenues.Ensuite, capturez les tranches sur les glissières adhésives et placez les glissières sur un chauffe-glissière de 37 degrés Celsius pour sécher. Lorsque les glissières ont été déparaffinées, plonger les échantillons dans un bocal de coloration d’une solution appropriée de récupération d’antigène, et chauffer les glissières à 95 degrés Celsius pendant 25 minutes en s’assurant que l’ébullition ne se produit pas. À la fin de l’incubation, laissez le bocal arriver à température ambiante et menter les glissières à plat dans une boîte de diapositives en plastique recouverte d’un pouce de profondeur avec du papier de soie humidifié à la base.Ajouter 100 microlitres de proteinase K préchauré à chaque échantillon. Couvrir chaque toboggan d’une petite bande de parafilm pour s’assurer que les sections ne deviennent pas sèches. Après 12 minutes à 37 degrés Celsius, retirez soigneusement le film de paraffine et égouttez doucement les glissières sur du papier de soie pour éliminer l’excès de solution de blocage.Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de la solution d’anticorps primaire d’intérêt à chaque diapositive. Retourner les sites dans la chambre humidifiante recouverte de film de paraffine pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, après avoir lavé les glissières en solution saline tamponnée tris plus TWEEN ou TBST, étiquetez les glissières avec une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation de 45 minutes à température ambiante protégée de la lumière.À la fin de l’incubation, lavez les glissières dans tbst et laissez-les sécher. Ensuite, utilisez 100 microlitres de support anti-fondu pour placer soigneusement les couvercles sur les glissières séchées et entreposer les glissières à plat à température ambiante pendant la nuit à l’abri de la lumière pour permettre au milieu de montage de sécher. Pour la tomographie micro-calculée séquentielle in vivo ou micro-CT équiper l’imageur micro-CT avec tube pour permettre l’écoulement de l’oxygène dans et hors de la chambre animale micro-CT, en s’assurant que l’oxygène sortant est équipé d’un filtre à charbon activé pour piéger l’isoflurane.Réglez le Voxelsize à 10,5 micromètres à 55 kilovoltages de pointe et 145 microampes avec 1000 projections par 180 degrés et rotation continue avec un temps d’intégration de 200 millisecondes, ce qui donne un maximum de 213 tranches par balayage. Lorsque le scanner est prêt, placez doucement la souris anesthésiée dans la chambre animale micro-CT avec les chiffres des membres postérieurs disposés en côté ventral d’association plat et étroit vers le haut avec la patte gauche sur le côté gauche et la droite sur le côté droit de la plate-forme de balayage. Appliquez ensuite du ruban chirurgical pour fixer délicatement les chiffres en place.Appliquez de l’onguent ophtalmique sur les yeux de l’animal avant d’amorcer l’analyse. Après la numérisation, retourner l’animal dans une cage propre avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence, et laisser jusqu’à plusieurs heures pour la reconstruction de l’image micro-CT. Pour l’analyse de l’image osseuse 3D reconstruite, à l’aide du logiciel fourni avec le micro-CT, convertir les fichiers d’image en une série de fichiers DICOM.Lorsque tous les fichiers ont été convertis, téléchargez la série DICOM dans un seul dossier à l’aide d’un téléchargeur de fichiers par lots dans un navigateur Web. Chargez le plug-in BoneJ dans le dossier plug-in ImageJ. Faites glisser et déposer le dossier de la série de fichiers DICOM dans la barre ImageJ pour ouvrir les fichiers.Une pile d’images 16 bits affichant toutes les valeurs grises sera ouverte. Pour afficher l’os uniquement, cliquez sur Ajuster l’image et seuil. Faites glisser la barre supérieure du seuil vers l’extrême droite et ajustez la barre inférieure du seuil jusqu’à ce que seul l’os soit mis en évidence en rouge.La valeur seuil inférieure sera d’environ 10 000 à 13 000 à une intensité maximale du signal de 32 767. Cliquez sur Appliquer et dans la nouvelle boîte de dialogue, cliquez sur Fond noir. Ensuite, cliquez sur OK. Une image huit bits affichant des valeurs en noir et blanc sera générée.Avec le blanc correspondant à l’os. Dessinez un rectangle autour de l’os P3 pour le sélectionner et dupliquer la pile. Pour générer une image 3D, cliquez sur Plugins et 3D Viewer et utilisez l’outil de sélection à main levée pour encercler l’os à supprimer.Puis cliquez à droite et sélectionnez Sélection fill pour recadrer tout os inutile de l’image. Pour quantifier le volume osseux du rendu 3D, ouvrez le plug-in BoneJ et sélectionnez Fraction volume. Une fenêtre de résultats apparaîtra et le volume d’os affiché en millimètres coupé en cubes.Pour quantifier la longueur osseuse du rendu 3D, utilisez l’outil multipoint ImageJ. Pour capturer une image du rendu 3D, cliquez sur Afficher et prendre un instantané. Enregistrez ensuite l’image sous forme de fichier TIF ou JPEG.Dans ces sections d’images d’une souris adulte régénérant le chiffre de P3 ont été immunotachées avec des anticorps pour visualiser la régénération intramembranous d’os et la formation de blastema au jour six à sept, neuf et 10 post-amputation. Ici, des rendus micro-CT représentatifs des chiffres numérisés avant l’amputation et à divers moments au cours de la régénération avec des repères utilisés pour identifier les mesures de longueur sont montrés. Le modèle de chiffre de souris est un système puissant pour analyser un environnement pro-régénérateur de blessure qui déclenche la formation de blastema une fois amputé à un niveau distal.Inversement, l’amputation proximale des chiffres sert de système modèle pour étudier l’échec régénérateur ainsi qu’un site pour tester des stratégies pour améliorer la régénération.

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Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Conversion épigénétique comme une méthode sûre et simple pour obtenir des cellules sécrétrices d&#39;insuline à partir des adultes fibroblastes cutanés

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Construire des modèles éléments finis pour enquêter sur Zebrafish Jaw Biomécanique

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture de murines embryonnaires Métatarsiens: un modèle physiologique de endochondrale ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Mise en place du poisson-zèbre larvaire comme modèle Animal pour enquêter sur Trypanosoma cruzi motilité In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Amputation chimique et la régénération du Pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Une hépatectomie partielle lobulaire : Un modèle chirurgical pour la régénération du foie morphologique

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Une méthode simple et efficace d’isoler des kératinocytes humains primaires provenant de tissus de la peau adulte

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...