Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Wir danken Mitgliedern des Muneoka Lab und des Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Diese Arbeit wurde von der Texas A&M University unterstützt.

Alle Tieranwendungen und -techniken entsprachen den Standardverfahren des Institutional Animal Care and Use Committee der Texas A&M University.
1. Erwachsene Maus Hind Limb Distal P3 Amputation
<ol><li>Anästhetisieren Sie eine 8 bis 12 Wochen alte CD-1-Maus (Materialtabelle) mit Isoflurangas in Sauerstoff; zunächst bei 3% in einer Kammer anästhesieren, gefolgt von 2% Isofluran, das von einem Nosecon über die Dauer der Operation geliefert wird. Tragen Sie die ophthalmolog...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt ein standardisiertes Verfahren der distalen P3-Amputation von Erwachsenenmäusen, fluoreszierende immunhistochemische Färbung zur Visualisierung und Untersuchung der Blastembildung und intramembranösen Verknöcherung sowie Knochenmorphologie, Volumen und Längenänderungen nach der Amputation zu identifizieren. P3-Amputation ist ein einzigartiges, prozedural einfaches und reproduzierbares Modell zur Analyse einer pro-regenerativen Wundumgebung, die die Blastemabildung auslöst. Darüber hina...

Säugetiere, einschließlich Menschen und Mäuse, haben die Fähigkeit, die Spitzen ihrer Ziffern nach distaler Amputation der Terminalphalanx (P3)1,2,3zu regenerieren. Bei Mäusen ist die Regenerationsreaktion amputationsniveauabhängig; zunehmend proximale Ziffernamputationen zeigen eine zunehmend abgeschwächte regenerative Reaktion bis zum vollständigen regenerativen Versagen bei Amputationen, die sich überschneiden, und proximal zur P3-Nagelmatrix4,5,6 , 7 , 8. Die P3-Regeneration wird durch die Bildung eines Blastema vermittelt, definiert als eine Population von sich ausbreitenden Zellen, die einer Morphogenese unterzogen werden, um die amputierten Strukturen zu regenerieren9. Die Bildung eines Blastema zur Regeneration der durch Amputation verlorenen Strukturen, ein Prozess, der als epimorphe Regeneration bezeichnet wird, unterscheidet die Multi-Gewebe-Level-P3-Regenerationsreaktion von der traditionellen Gewebereparatur nach Verletzung6, 10. P3 Regeneration ist ein reproduzierbares und verfahrenstechnisch einfaches Modell zur Untersuchung komplexer regenerativer Prozesse einschließlich Wundheilung11,12, Knochenhistolyse11,12, Revaskularisation13, periphere Nervenregeneration14, und blastemale Umwandlung in Knochen über intramembranöse Ossifikation15.
Frühere Studien mit Immunhistochemie haben gezeigt, dass das Blastema heterogen, avaskulär, hypoxisch und hoch proliferativ11,13,15,16ist. Nach distaler P3-Amputation wird das frühe Blastema zunächst mit dem P3-Periost und Endosteum assoziiert und zeichnet sich durch eine robuste Proliferation und aufkeimende Osteogenese neben der Knochenoberfläche15aus. Nach Knochenabbau und Wundverschluss wird das heterogene Blastema durch die Verschmelzung von periostealen und endostealassoziierten Zellen gebildet, gefolgt von der Differenzierung von blastemalen Komponenten einschließlich Knochen durch intramembranöse Verknöcherung 15.
Knochenreparatur als Reaktion auf Verletzungen tritt typischerweise durch endochondrale Verknöcherung auf, d.h. über einen ersten knorpelförmigen Callus, der eine Vorlage für die nachfolgende Knochenbildung bildet17,18. Die intramembranöse Verknöcherung des langen Knochens, d.h. die Knochenbildung ohne knorpelförmiges Zwischenprodukt, wird häufig mit komplexen Ablenkungsvorrichtungen oder chirurgischer Fixierunginduziert 19,20. Das Ziffernregenerationsverhalten ist ein präklinisches Modell, das Vorteile gegenüber herkömmlichen intramembranösen Verknöcherungsmodellen bietet: 1) es erfordert keine externe oder interne Fixierung nach verletzungen, um die intramembranöse Ossifikation zu stimulieren, 2) mit 4 Ziffern von jedem Tier durchgeführt, wodurch Proben bei gleichzeitiger Minimierung des Einsatzes von Tieren maximiert werden, und 3) sequentielle In-vivo-Mikrocomputertomographie-Analysen (CT) können mit Leichtigkeit und Geschwindigkeit durchgeführt werden.
In der vorliegenden Studie zeigen wir die standardisierte P3-Amputationsebene, um eine reproduzierbare und robuste Regenerationsreaktion zu erreichen. Zusätzlich zeigen wir ein optimiertes Fluoreszenz-Immunhistochemieprotokoll mit Paraffinabschnitten zur Visualisierung der Blastemabildung, Revaskularisation im Kontext der Regeneration und blastemalen Umwandlung in Knochen über intramembranöse Ossifikation. Wir zeigen auch die Verwendung von sequenziellem In-vivo-CT, um Veränderungen in der Knochenmorphologie, Volumen und Länge in der gleichen Ziffer im Laufe der Regeneration zu identifizieren. Ziel dieses Protokolls ist es, die Explosion bildung von Säugetieren nach der Amputation zu untersuchen und zwei Techniken, die Fluoreszenzimmunhistochemie und die sequenzielle in vivo-CT, zur Untersuchung der intramembranösen Knochenregeneration zu demonstrieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Hier stellen wir ein Protokoll der distalen Terminalphalanx (P3) amputation für Erwachsene vor, ein verfahrenstechnisch einfaches und reproduzierbares Säugetiermodell der epimorphen Regeneration, das die Blastemabildung und die intramembranöse Ossifikation umfasst, die von Fluoreszenz-Immunhistochemie und sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie (CT). Die Regeneration der Säugetiere beschränkt sich auf Amputationen, die den distalen Bereich der Terminalphalanx (P3) transsektieren; Ziffern, die auf proximaleren Ebenen amputiert werden, können sich nicht regenerieren und werden fibrotisch geheilt und narbt gebildet. Die Regenerationsreaktion wird durch die Bildung eines proliferativen Blastema summiert, gefolgt von knochenregeneration durch intramembranöse Verknöcherung, um die amputierte Skelettlänge wiederherzustellen. P3-Amputation ist ein präklinisches Modell zur Untersuchung der epimorphen Regeneration bei Säugetieren und ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung therapeutischer Strategien, um fibrotische Heilung durch eine erfolgreiche regenerative Reaktion zu ersetzen. Unser Protokoll verwendet Fluoreszenz-Immunhistochemie, um 1) früh- und späte Blastemzellpopulationen zu identifizieren, 2) Revaskularisation im Zusammenhang mit der Regeneration zu untersuchen und 3) die intramembranöse Verknöcherung ohne komplexe Knochen zu untersuchen Stabilisierungsvorrichtungen. Wir zeigen auch die Verwendung von sequenziellem in vivo -CT, um hochauflösende Bilder zu erstellen, um morphologische Veränderungen nach der Amputation zu untersuchen sowie Volumen- und Längenänderungen in derselben Ziffer im Verlauf der Regeneration zu quantifizieren. Wir glauben, dass dieses Protokoll einen enormen Nutzen bietet, um sowohl epimorphe als auch geweberegenerierende Reaktionen bei Säugetieren zu untersuchen.

Adult mouse regenerating P3 digits at 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Abbildung 2E-H) und 10 DPA (Abbildung 2I-L) wurden mit Antikörpern gegen Runx2, OSX und PCNA immunstainiert, um intramembranöse Knochen zu visualisieren und immunstainiert mit Antikörpern gegen CXCR4 und vWF, um die Blastemabildung zu visualisieren. Repräsentative 'CT-Renderings von Ziffern, die vor der Amputati...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Hier stellen wir ein Protokoll der erwachsenen Maus-Terminal-Phalanx-Amputation vor, um die Explosion von Säugetieren und die intramembranöse Ossifikation zu untersuchen, die durch fluoreszierende Immunhistochemie und sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie analysiert wird.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Die P3-Amputation ist ein präklinisches Modell zur Untersuchung der epimorphen Regeneration von Säugetieren und ein leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung kritischer Zellpopulationen und Mechanismen zur Kontrolle der endogene Regeneration. Das P3-Modell ermöglicht die Identifizierung von frühen und späten blastemalen Zellpopulationen, die Untersuchung der Revaskularisation während der Regeneration und die Untersuchung der intramembranösen Verknöcherung ohne komplexe Anforderungen an Knochenstabilisierungsgeräte. Mit mir werden Osama Qureshi, Alyssa Falck und Katherine Zimmel, Technikerin, und Regina Brunaeur, eine wissenschaftliche Assistenzprofessorin aus unserem Labor, das Verfahren demonstrieren.Nachdem Sie eine fehlende Reaktion auf Zehenkniff in einer acht bis 12 Wochen alten CD-1-Maus bestätigt haben, tragen Sie die Salbe auf die Augen des Tieres auf und legen Sie die Maus unter ein 10-faches Seziermikroskop. Verwenden Sie chirurgisches Povidon-Jod und 70%Ethanol, um die Ziffern jeder Hinterbeine zu sterilisieren und Mikroschere zu verwenden, um Haare von der chirurgischen Stelle weg zu trimmen. Tragen Sie einen Mikroliter topischen Bupivacaine lokal auf, um die chirurgische Stelle zu beäschden, und spielen Sie vorsichtig eine Hinterpfote, um die mediale ZifferOberfläche freizulegen.Halten Sie dann das Skalpell in einem Winkel parallel zum Fettpolster, verwenden Sie eine sterile Zahl 10 Skalpell, um die distale Spitze der Terminalphalanx der Ziffern zwei und vier zu amputieren. Tragen Sie einen zusätzlichen Mikroliter Bupivacaine lokal auf jede amputierte Ziffer auf und geben Sie die Maus in einen sauberen Käfig zurück, damit die Wunden ohne Wundverband und mit Überwachung bis zur vollständigen Resumbenität heilen können. Um eine erfolgreiche P3-Amputationsebene zu gewährleisten, halten Sie das Skalpell während der Amputation parallel zum Fettpolster und führen Sie Mikro-CT-Scans durch, um die korrekte Amputationslänge zu bestätigen.Verwenden Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt ein Skalpell, um die Ziffer in der Mitte des mittleren Phalanxknochens bei etwa dem zweiten ventralen Fettpolstereinzug zu trennen. Übertragen Sie das Gewebe in eine 20-Milliliter-Szintillationsflasche mit 10 Milliliter frisch gepuffertem Zinkformalin fixativ für 24 bis 48 Stunden. Und verwenden Sie ein Mikrotome, um vier bis fünf Mikrometer dicke Abschnitte jeder Ziffer zu erwerben, indem Sie die Scheiben in ein 38 bis 41 Grad Celsius Wasserbad legen, das mit einer histologischen Klebstofflösung ergänzt wird, wie sie erhalten werden.Dann erfassen Sie die Scheiben auf Klebeschlitten und legen Sie die Dias auf einem 37-Grad-Celsius-Diawärmer zum Trocknen. Wenn die Dias deparaffinisiert wurden, tauchen Sie die Proben in ein Färbeglas einer geeigneten Antigen-Retrieval-Lösung ein und erhitzen Sie die Dias 25 Minuten lang auf 95 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass das Kochen nicht stattfindet. Lassen Sie das Glas am Ende der Inkubation auf Raumtemperatur kommen und legen Sie die Dias flach in eine ein Zoll tiefe, bedeckte Kunststoff-Diabox mit befeuchteten Tissuepapier an der Basis.Fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmte Proteinase K zu jeder Probe hinzu. Bedecken Sie jede Folie mit einem kleinen Streifen Parafilm, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht trocken werden. Nach 12 Minuten bei 37 Grad Celsius den Paraffinfilm vorsichtig entfernen und die Dias vorsichtig auf Tissuepapier abtropfen lassen, um eine überschüssige Blockierlösung zu entfernen.Als Nächstes fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter der primären Antikörperlösung hinzu, die für jedes Dia von Interesse ist. Bringen Sie die Standorte in die mit Paraffinfolie bedeckte Befeuchtungskammer zurück, um eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius zu erhalten. Am nächsten Morgen nach dem Waschen der Dias in TRIS-gepufferter Kochnische plus TWEEN oder TBST beschriften Sie die Dias mit einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine 45-minütige Inkubation bei lichtgeschützter Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation die Dias in TBST waschen und trocknen lassen. Verwenden Sie dann 100 Mikroliter Anti-Fade-Montagemedium, um Die Deckel sorgfältig auf die getrockneten Dias zu legen und die Dias flach bei Raumtemperatur über Nacht vor Licht geschützt zu lagern, damit das Montagemedium trocknen kann. Für die sequenzielle In-vivo-Mikrocomputertomographie oder das Mikro-CT-Outfit wird der Micro-CT-Imager mit Schläuchen, um den Sauerstofffluss in und aus der Mikro-CT-Tierkammer zu ermöglichen, sichergestellt, dass der ausströmende Sauerstoff mit einem Aktivkohlefilter ausgestattet ist, um das Isofluran zu fangen.Stellen Sie die Voxelsize auf 10,5 Mikrometer bei 55 Spitzen-Kilovoltund und 145 Mikroampere mit 1.000 Projektionen pro 180 Grad und kontinuierlicher Rotation mit einer Integrationszeit von 200 Millisekunden ein, was zu maximal 213 Slices pro Scan führt. Wenn der Scanner bereit ist, legen Sie die anästhesierte Maus vorsichtig in die Mikro-CT-Tierkammer mit den hinteren Gliedmaßenziffern, die in flachen, engen, venralen Seiten mit der linken Pfote auf der linken Seite und der rechten Seite auf der rechten Seite der Scanplattform angeordnet sind. Dann chirurgisches Klebeband auftragen, um die Ziffern vorsichtig an Ort und Stelle zu sichern.Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen des Tieres auf, bevor Sie den Scan einleiten. Nach dem Scannen, kehren Sie das Tier in einen sauberen Käfig mit Überwachung bis zur vollständigen Rekonbergung zurück und lassen Sie bis zu mehreren Stunden für die Mikro-CT-Bildrekonstruktion. Zur Analyse des rekonstruierten 3D-Knochenbildes, mit der Software mit dem micro-CT, konvertieren Sie die Bilddateien in eine Reihe von DICOM-Dateien.Wenn alle Dateien konvertiert wurden, laden Sie die DICOM-Serie in einem einzigen Ordner mit einem Batchdatei-Downloader in einem Webbrowser herunter. Laden Sie das BoneJ-Plug-In in den ImageJ-Plug-In-Ordner. Ziehen Sie den Ordner der DICOM-Dateiserie in die ImageJ-Leiste, um die Dateien zu öffnen.Ein 16-Bit-Bildstapel, der alle Grauwerte anzeigt, wird geöffnet. Um nur Bone anzuzeigen, klicken Sie auf Bildanpassung und Schwellenwert. Schieben Sie den oberen Schwellenbalken nach ganz rechts, und passen Sie den unteren Schwellenwertbalken an, bis nur der Knochen rot hervorgehoben ist.Der untere Schwellenwert wird etwa 10.000 bis 13.000 bei einer maximalen Signalintensität von 32, 767 betragen. Klicken Sie auf Übernehmen, und klicken Sie im neuen Dialogfeld auf Schwarzhintergrund. Klicken Sie als Nächstes auf OK. Es wird ein Acht-Bit-Bild mit Schwarzweißwerten generiert.Mit dem Weiß, das dem Knochen entspricht. Zeichnen Sie ein Rechteck um den P3-Bone, um ihn auszuwählen und den Stapel zu duplizieren. Um ein 3D-Bild zu generieren, klicken Sie auf Plugins und 3D Viewer und verwenden Sie das Freihandauswahl-Tool, um den zu löschenden Knochen einzukreisen.Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, und wählen Sie Auswahl ausfüllen aus, um unnötigen Bone aus dem Bild zuzuschneiden. Um das Knochenvolumen aus dem 3D-Rendering zu quantifizieren, öffnen Sie das BoneJ-Plug-In, und wählen Sie Volume Fraction aus. Ein Ergebnisfenster wird angezeigt und das Knochenvolumen in Millimetern gewürfelt.Um die Knochenlänge aus dem 3D-Rendering zu quantifizieren, verwenden Sie das ImageJ-Multipoint-Werkzeug. Um ein Bild des 3D-Renderings zu erfassen, klicken Sie auf Anzeigen, und erstellen Sie einen Snapshot. Speichern Sie dann das Bild als TIF- oder JPEG-Datei.In diesen Bildern wurden Abschnitte einer erwachsenen Maus regenerierenden P3-Ziffer mit Antikörpern immungefärbt, um die intramembranöse Knochenregeneration und Blastemabildung an Tag sechs bis sieben, neun und zehn nach der Amputation zu visualisieren. Hier werden repräsentative Mikro-CT-Renderings von Ziffern angezeigt, die vor der Amputation gescannt wurden, und zu verschiedenen Zeitpunkten im Laufe der Regeneration mit Landmarken, die zur Identifizierung von Längenmessungen verwendet werden. Das Mausziffernmodell ist ein leistungsfähiges System zur Analyse einer pro-regenerativen Wundumgebung, die Blastemabildung auslöst, wenn sie auf distaler Ebene amputiert wird.Umgekehrt dient die proximale Amputation der Ziffern als Modellsystem zur Untersuchung von regenerativem Versagen sowie als Standort für Teststrategien zur Verbesserung der Regeneration.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetische Umwandlung als eine sichere und einfache Methode, Insulin absondernden Zellen aus adulten Fibroblasten der Haut zu erhalten

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Der Aufbau Finite-Elemente-Modelle zu Zebrabärbling Jaw Biomechanik Untersuchen

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Kultur von murinen embryonalen Mittelfuß: ein physiologisches Modell der enchondralen Verknöcherung

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Gründung der Larven Zebrafisch als Tier-Modell zu untersuchen Trypanosomen Trypanosoma Motilität In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...