Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת Muneoka ומכון טקסס לרפואה גנומית (TIGM). העבודה הזאת נתמכת על ידי אוניברסיטת טקסס A & M.

כל השימוש בעלי חיים וטכניקות היו בהתאם לנהלי ההפעלה הסטנדרטיים של טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש הוועדה של טקסס מ& M אוניברסיטת.
1. עכבר למבוגרים הגפיים האחוריות P3 קטיעה
<ol><li>שימוש ב-8 עד 12 שבוע בדיסק CD-1 (טבלה של חומרים) באמצעות גז isofלאנה בחמצן; בתחילה הורדם ב 3% בחדר, ו...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר הליך מתוקננת של העכבר המבוגר הP3 קטיעה, כתמים מבוססי פלורסנט מכתים כדי להמחיש ולחקור היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה, ו רציפים ב-vivo μct סריקה כדי ל זיהוי עצם מורפולוגית, נפח, ואורך שינויים לאחר קטיעה. P3 קטיעה הוא ייחודי, תהליכים פשוטה, מודל ליצירת לנתח סביבה פרו-משובי הפצ...

יונקים, כולל בני אדם ועכברים, יש את היכולת לחדש את קצות הספרות שלהם לאחר הסדר המרוחק של הטרמינל פלנקס (P3)1,2,3. בעכברים, תגובת ההתחדשות היא תלוית ברמת קטיעה; קטיעות הספרות האבותיים יותר ויותר להציג תגובת משובי בהדרגה החליש עד כשל התחדשות מלאה בקטיעות transecting ואת האבובית לתוך P3 מטריצה4,5,6 , מיכל סבן , 8. P3 התחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema, מוגדר כאוכלוסייה של תאים מתרבים העוברים מורפולגנזה כדי לחדש את המבנים הקטוע9. היווצרות של blastema כדי לחדש את המבנים שאבדו על ידי קטיעה, תהליך שנקרא התחדשות אפימורפית, מבדיל את תגובת התחדשות P3 ברמת רקמה מסורתית לאחר פציעה6, 10. P3 התחדשות היא מודל מתהליכים פשוטה לחקור תהליכים רגנרטיבית מורכבים כולל ריפוי הפצע11,12, עצם histolysis11,12, התחדשות העצביםההיקפית14, ו המרה בלסטאל עצם באמצעות intramembranous האוסיפיקציה15.
מחקרים קודמים באמצעות אימונוהיסטוכימיה הוכיחו כי blastema הוא הטרוגנית, נמק העצם, ארוי, ו מתרבים מאוד11,13,15,16. בעקבות קטיעה P3 המוקדמות, הבלסטמה המוקדמת קשורה בתחילה עם קרום העצם הP3 ו אנדוסטנום והוא מאופיין על ידי התפשטות חזקה ו אוסטגנזה המתהווה בסמוך למשטח העצמות15. בעקבות השפלה העצם וסגר הפצע, הטרוגנית blastema נוצר על ידי מיזוג של התאים קרום ולגנוב הקשורים, ואחריו הבידול של רכיבי בלסטאל כולל עצם באמצעות intramembranous האוסיפיקציה . חמש עשרה
תיקון עצם בתגובה לפציעה מתרחשת בדרך כלל על ידי endochondral אוסיפיקציה, כלומר באמצעות סחוס השבר הראשוני המהווה תבנית להיווצרות העצם העוקבים17,18. עצם ארוך intramembranous פיקציה, כלומר, היווצרות העצם ללא ביניים סחוס הרסניות, הוא המושרה בדרך כלל באמצעות מכשירים הסחת דעת מורכבים או קיבעון כירורגי19,20. התגובה התחדשות הספרה הוא מודל טרום קליני המציעה יתרונות על מודלים intramembranous האוסיפיקציה קונבנציונאלי: 1) זה לא דורש פגיעה חיצונית או פנימית הפוסט לעורר intramembranous האוסיפיקציה, 2) זה שבוצעו באמצעות 4 ספרות מכל בעל חיים, ובכך למקסם דגימות תוך מזעור שימוש בעלי חיים, ו 3) רציפים בvivo מיקרו טומוגרפיה (μCT) ניתוח ניתן לבצע בקלות ובמהירות.
במחקר הנוכחי, אנו מציגים את המטוס P3 קטיעה סטנדרטית כדי להשיג תגובה התחדשות חזקה ואיתנה. בנוסף, אנו מדגימים פרוטוקול ממוטב האימונוהיסטוכימיה ממוטבת באמצעות מקטעי פרפין כדי להמחיש היווצרות blastema, revascularization בהקשר של התחדשות, והמרה בלסטאל עצם באמצעות intramembranous תאבנות. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב-vivo μCT כדי לזהות שינויים מורפולוגיה העצם, נפח, ואורך באותה ספרה במהלך התחדשות. המטרה של פרוטוקול זה היא לחקור את היווצרות היונקים בלסטי לאחר קטיעה ולהדגים 2 טכניקות, אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ו רציפים ב vivo μCT, לחקר התחדשות העצם intramembranous.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של העכבר המבוגר מהטרמינל פלנקס (P3) קטיעה, המודל התהליכים פשוטה ומתחדעה של התחדשות אפימורדית, אשר כרוך היווצרות blastema ו intramembranous האוסיפיקציה שנותחו על ידי אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיה (μCT). התחדשות היונקים מוגבלת לקטיעות המעבר באזור המרוחק של הטרמינל (P3); ספרות הנככרות ברמות הגבוהות יותר אינן מצליחות להתחדש ולעבור ריפוי פיברוטי והיווצרות צלקת. תגובת ההתחדשות מתווכת על ידי היווצרות blastema שהתרבות, ואחריו התחדשות העצם דרך intramembranous אוסיפיקציה כדי לשחזר את אורך השלד הקטוע. P3 קטיעה היא מודל טרום קליני לחקור התחדשות אפימורמכולה יונקים, והוא כלי רב עוצמה לעיצוב של אסטרטגיות טיפוליות להחליף ריפוי פיברוטיק עם תגובת התחדשות מוצלחת. הפרוטוקול שלנו משתמש אימונוהיסטוכימיה הפלואורסצנטית ל 1) לזהות אוכלוסיות מוקדמות ומאוחרות של בלסטאמה, 2) מחקר revascularization בהקשר של התחדשות, ו 3) לחקור האוסיפיקציה intramembranous ללא צורך בעצם מורכב מכשירי ייצוב. אנו גם להדגים את השימוש רציפים ב vivo μCT כדי ליצור תמונות ברזולוציה גבוהה כדי לבחון שינויים מורפולוגיים לאחר קטיעה, כמו גם לכמת נפח ושינויי אורך באותה ספרה במהלך התחדשות. אנו מאמינים פרוטוקול זה מציע כלי השירות העצום כדי לחקור את התגובות שניהם התחדשות מנוונת ורקמות ביונקים.

עכבר למבוגרים מתחדשות P3 ספרות ב 6/7 DPA (איור 2A-D), 9 Dpa (איור 2a-H), ו 10 dpa (איור 2a-L) היו מוכתמים בנוגדנים ל Runx2, OSX, ו pcna להמחיש intramembranous עצם התחדשות, ומוכתם בנוגדנים ל CXCR4 ו-vWF כדי להמחיש היווצרות blastema. הנציג μCT העיבודים של ספרו...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

כריתה של ספרות עכבר למבוגרים והתחדשות: מודל פשוט כדי לחקור ממגי בלסטאמה היווצרות הIntramembranous פיקציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של מסוף העכבר למבוגרים פלקים כריתת כריתה לחקור היווצרות בלסטאמה blastema ו intramembranous להתקשות, מנותח על ידי הפלורסנט אימונוהיסטוכימיה ו רציפים ב-vivo מיקרו טומוגרפיית.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

קטיעה P3 היא מודל פרה-קליני לחקירת התחדשות אפימורפית של יונקים וכלי רב עוצמה לזיהוי אוכלוסיות תאים קריטיות ומנגנונים השולטים בהתחדשות אנדוגנית. מודל P3 מאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים בלסטמליות מוקדמות ומאוחרות, חקר revascularization במהלך התחדשות, ואת החקירה של ossification תוך-ממברני ללא דרישות התקן ייצוב עצם מורכבות. הדגימו את ההליך איתי יהיו אוסאמה קורשי, אליסה פאלק וקתרין צימל, טכנאית, ורג'ינה ברונאור, עוזרת מחקר פרופסור הכל מהמעבדה שלנו.לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר CD-1 בן שמונה עד 12 שבועות, להחיל משחה על העיניים של החיה ולמקם את העכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח 10X. השתמש יוד povidone כירורגית ו 70% אתנול כדי לעקר את הספרות של כל איבר אחורי ולהשתמש microscissors כדי לקצץ את השיער הרחק מהאתר הכירורגי. החל מיקרוליטר אחד של bupivacaine אקטואלי באופן מקומי כדי להרים את האתר הכירורגי, בעדינות splay כפה אחורית אחת כדי לחשוף את פני השטח ספרה המדיה.לאחר מכן מחזיקים את האזמל בזווית המקבילה ל כרית השומן, משתמשים באזמל סטרילי מספר 10 כדי לקטוע את הקצה הדיסטלי של הפלנקס המסוף של ספרות 2 ו-4. החל מיקרוליטר נוסף אחד של bupivacaine באופן מקומי על כל ספרה קטועה ולהחזיר את העכבר לכלוב נקי כדי לאפשר את הפצעים לרפא ללא ההלבשה הפצע עם ניטור עד שליטה מלאה. כדי להבטיח מישור קטיעה מוצלח P3, להחזיק את האזמל במקביל כרית השומן במהלך קטיעה ולבצע סריקת מיקרו CT כדי לאשר את אורך קטיעה הנכון.בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש באזמל כדי לנתק את הספרה באמצע דרך עצם הפלנקס האמצעית בערך בכניסה השנייה של כרית השומן הגחונית. מעבירים את הרקמה לבקבוקון נצנוץ של 20 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של מתקן פורמלין אבץ טרי למשך 24 עד 48 שעות. ולהשתמש microtome לרכוש ארבעה עד חמישה חלקים עבים מיקרומטר של כל ספרה, הצבת הפרוסות לתוך 38 עד 41 מעלות צלזיוס אמבט מים בתוספת פתרון דבק היסטולוגי כפי שהם מתקבלים.לאחר מכן ללכוד את הפרוסות על מגלשות דבק ולמקם את המגלשות על 37 מעלות צלזיוס להחליק חם לייבוש. כאשר השקופיות כבר deparaffinized לטבול את הדגימות בצנצנת מכתים של פתרון אחזור אנטיגן המתאים, לחמם את השקופיות ל 95 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות לוודא כי הרתיחה לא מתרחשת. בסוף הדגירה, אפשר לצנצנת להגיע לטמפרטורת החדר, והנח את המגלשות שטוחות בקופסת מגלשת פלסטיק מכוסה בעומק סנטימטר אחד עם נייר טישו לח בבסיס.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חלבון K לפני המלחמה לכל דגימה. מכסים כל שקופית ברצועה קטנה של פרפילם כדי להבטיח שהקטעים לא יתייבשו. לאחר 12 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, להסיר בזהירות את הסרט פרפין, בעדינות לנקז את השקופיות על נייר טישו כדי להסיר פתרון חסימה עודף.לאחר מכן, הוסיפו 100 עד 200 מיקרוליטר של פתרון הנוגדנים העיקרי שמעניין כל שקופית. החזירו את האתרים לתא הלח המרופד בסרט פרפין עבור דגירה לילית בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר לאחר שטיפת השקופיות מלוחים TRIS-buffered בתוספת TWEEN או TBST תווית השקופיות עם פתרון נוגדנים משני מתאים עבור דגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות ב- TBST ולאפשר להם להתייבש. לאחר מכן השתמשו ב-100 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום כדי למקם בזהירות כיסויים על השקופיות המיובשות ולאחסן את השקופיות שטוחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה המוגנות מפני אור כדי לאפשר למדיום ההרכבה להתייבש. עבור טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת רציף של vivo או מיקרו-CT, התלבושת המיקרו-CT עם צינורות כדי לאפשר זרימת חמצן לתוך ומחוץ לתא החיה מיקרו-CT, לוודא כי החמצן העולה מצויד במסנן פחם פעיל כדי ללכוד את isoflurane.הגדר את ה- Voxelsize ל- 10.5 מיקרומטר ב- 55 קילו-וולטאז' שיא ו- 145 מיקרואמפ עם 1,000 תחזיות לכל 180 מעלות וסיבוב רציף עם זמן אינטגרציה של 200 אלפיות שניה, וכתוצאה מכך 213 פרוסות לכל היותר לכל סריקה. כאשר הסורק מוכן, מניחים בעדינות את העכבר הרדמה בתא החיות micro-CT עם ספרות הגפיים האחוריות מסודרות שטוח, צד גחון קשר קרוב למעלה עם הכף השמאלית בצד שמאל וימינה בצד ימין של פלטפורמת הסריקה. לאחר מכן להחיל קלטת כירורגית כדי לאבטח בעדינות את הספרות במקום.החל משחה עיניים על העיניים של החיה לפני תחילת הסריקה. לאחר הסריקה, החזירו בעלי חיים לכלוב נקי עם ניטור עד לשיקום מלא, ואפשרו עד מספר שעות לשחזור תמונה מיקרו-CT. לניתוח של תמונת העצם 3D משוחזר, באמצעות התוכנה המסופקת עם מיקרו CT, להמיר את קבצי התמונה לסדרה של קבצי DICOM.לאחר המרת כל הקבצים, הורד את סדרת DICOM בתיקיה אחת באמצעות מוריד קבצי אצווה בדפדפן אינטרנט. טען את יישום ה- Plug-in של BoneJ לתיקיית התוסף ImageJ. גרור ושחרר את תיקיית סידרת הקבצים DICOM לתוך סרגל ImageJ כדי לפתוח את הקבצים.ערימת תמונות של 16 סיביות המציגה את כל הערכים האפורים תיפתח. לתצוגת עצם בלבד, לחצו על 'התאמת תמונה' ו'סף'. החלק את סרגל הסף העליון לימין הקיצוני והתאם את סרגל הסף התחתון עד שרק העצם מסומנת באדום.ערך הסף התחתון יהיה בערך 10, 000 עד 13, 000 בעוצמת אות מקסימלית של 32, 767. לחץ על החל ובתיבת הדו-שיח החדשה, לחץ על רקע שחור. לאחר מכן, לחץ על אישור. תמונה של שמונה סיביות המציגה ערכים בשחור-לבן תיווצר.עם הלבן המתאים לעצם. צייר מלבן מסביב לעצם P3 כדי לבחור אותה ולשכפל את הערימה. ליצירת תמונה תלת-מימדית, לחצו על 'תוספים' ו'מציג תלת-מימד' ולהשתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי להקיף את העצם למחיקה.לאחר מכן לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'מלאו את הבחירה' כדי לחתוך עצם מיותרת מהתמונה. לכימות נפח העצם מהעיבוד תלת-ממדי, פתחו את תוסף BoneJ ובחרו 'שבר נפח'. יופיע חלון תוצאות ונפח העצם יוצג במילימטרים.לכימות אורך העצם מהעיבוד תלת-ממדי, השתמשו בכלי הרב-נקודתי ImageJ. ללכידת תמונה של הרינדור תלת-ממדי, לחצו על 'תצוגה' וצלמו תמונה. לאחר מכן שמרו את התמונה כקובץ TIF או JPEG.בתמונות אלה קטעים של עכבר בוגר התחדשות P3 ספרות היו immunostained עם נוגדנים לדמיין התחדשות עצם תוך-מטרית היווצרות blastema ביום שש עד שבע, תשע ו 10 לאחר קטיעה. כאן, עיבודי מיקרו-CT מייצגים של ספרות שנסרקו לפני קטיעה ובנקודות זמן שונות במהלך התחדשות עם ציוני דרך המשמשים לזיהוי מדידות אורך מוצגים. מודל ספרות העכבר הוא מערכת רבת עוצמה לניתוח סביבת פצעים פרו-רגנרטיבית המפעילה היווצרות blastema כאשר נקטעה ברמה דיסטלית.לעומת זאת, קטיעה פרוקסימלית של הספרות משמשת כמערכת מודל לחקירת כשל רגנרטיבי, כמו גם אתר לבדיקת אסטרטגיות לשיפור התחדשות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Loss- ו-של-פונקצית רווח גישה לחקר תא מוקדם קובעי גורל preimplantation עכבר עובר

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

מרת אפיגנטיים כאמצעי בטוח ופשוט להשיג תאי מפרישי אינסולין פיברובלסטים עור בוגרים

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

בניית מודלים אלמנטים סופיים לחקור ביומכניקה לסת דג הזברה

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

הקמתה של הזחל דג זברה כמודל חיה כדי Investigate Trypanosoma cruzi תנועתיות Vivo ב

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

מבוסס רנקל אוסטאוקלסט תרבות וזמינותו של העכבר מח העצם כדי לחקור את התפקיד של mTORC1 במבנה אוסטאוקלסט

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...