Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
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हम Muneoka लैब और जीनोमिक चिकित्सा के लिए टेक्सास संस्थान (TIGM) के सदस्यों को धन्यवाद. यह काम टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था.

सभी पशु उपयोग और तकनीक संस्थागत पशु देखभाल और टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय के उपयोग समिति के मानक संचालन प्रक्रियाओं के अनुपालन में थे.
1. वयस्क माउस हिंद अंग जिला P3 विच्छेदन
<ol><li>ऑक्सीजन मे?...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल वयस्क माउस distal P3 विच्छेदन की एक मानकीकृत प्रक्रिया का वर्णन करता है, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला कल्पना और blastema गठन और intramembranous ossification की जांच करने के लिए, और अनुक्रमिक में-vivo ]CT स्कैनिं?...

मानव और चूहों सहित स्तन, टर्मिनल phalanx (P3)1,2,3के विच्छेदन के बाद अपने अंकों के सुझावों को पुनर्जीवित करने की क्षमता है। चूहों में, पुनर्जनन प्रतिक्रिया विच्छेदन स्तर पर निर्भर है; तेजी से समीपस्थ अंक विच्छेदन एक उत्तरोत्तर क्षीण पुनर्योजी प्रतिक्रिया प्रदर्शित जब तक विच्छेदन transecting पर पूर्ण पुनर्योजी विफलता और P3 नाखून मैट्रिक्स4,5,6 के लिए निकट , 7 , 8. च3 पुनर्जनन एक ब्लास्टेमा के गठन से मध्यस्थता की जाती है, जिसे अपादान कोशिकाओं की जनसंख्या के रूप में परिभाषित किया जाता है जो विच्छेदनसंरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए रूपजनन से गुजरती हैं9. विच्छेदन से खो संरचनाओं को पुनर्जीवित करने के लिए एक blastema के गठन, एक प्रक्रिया epimorphic पुनर्जनन कहा जाता है, चोट6के बाद पारंपरिक ऊतक की मरम्मत से बहु ऊतक स्तर पी 3 पुनर्जनन प्रतिक्रिया भेद, 10पी 3 पुनर्जनन एक पुनरुज्जीवन है जो घाव भरने वाले11,12, हड्डी हिस्टोलिसिस11,12, सहित जटिल पुनर्योजी प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक पुनरुत्पादक और प्रक्रियात्मक सरल मॉडल है , पुनर्संवक्षण13, परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन14, और ब्लास्टेमल रूपांतरण अस्थि के माध्यम से अंतर्विष् ट अस्थि 15 .
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करने वाले पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ब्लास्टेमा विषमांगी , अवास्कुलर , हाइपोक्सिक और अत्यधिक प्रसारी11,13,15,16है . दूरस्थ पी 3 विच्छेदन के बाद, जल्दी blastema शुरू में P3 periosteum और endosteum के साथ जुड़ा हुआ है और मजबूत प्रसार और हड्डी की सतह15के निकट नवजात अस्थिजनन की विशेषता है. हड्डी गिरावट और घाव बंद करने के बाद, विषम ब्लास्टेमा पेरिओस्टल और एंडोस्टील-संबद्ध कोशिकाओं के विलय से बनता है, इसके बाद अंतर्जातीय अस्थि के माध्यम से हड्डी सहित ब्लास्टेमल घटकों के विभेदन के बाद 15.
चोट के जवाब में हड्डी की मरम्मत आम तौर पर endochondral ossification द्वारा होता है, यानी एक प्रारंभिक उपास्थि कॉलस के माध्यम से कि बाद में हड्डी गठन के लिए एक टेम्पलेट रूपों17,18. लंबी हड्डी intramembranous ossification, अर्थात्, एक उपास्थि मध्यवर्ती बिना हड्डी गठन, आमतौर पर जटिल व्याकुलता उपकरणों या शल्य निर्धारण का उपयोग कर प्रेरित है19,20. अंक पुनर्जनन प्रतिक्रिया एक पूर्व नैदानिक मॉडल है कि पारंपरिक intramembranous ossification मॉडल पर लाभ प्रदान करता है: 1) यह बाहरी या आंतरिक निर्धारण पोस्ट चोट की आवश्यकता नहीं है intramembranous ossification को प्रोत्साहित करने के लिए, 2) यह है प्रत्येक जानवर से 4 अंक का उपयोग कर प्रदर्शन किया, इस प्रकार नमूनों को अधिकतम करते हुए पशु उपयोग को कम करने, और 3) विवो microcomputed टोमोग्राफी में अनुक्रमिक (जेडसीटी) विश्लेषण आसानी और गति के साथ किया जा सकता है।
वर्तमान अध्ययन में, हम मानकीकृत P3 विच्छेदन विमान दिखाने के लिए एक reproduible और मजबूत पुनर्जनन प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए. इसके अतिरिक्त, हम ब्लास्टेमा गठन की कल्पना करने के लिए पैराफिन वर्गों का उपयोग करके एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं, पुनर्जनन के संदर्भ में पुनर्संवहनीकरण, और अंतर्जातीय के माध्यम से हड्डी में ब्लास्टेमल रूपांतरण अस्थिकरण. हम भी पुनर्जनन के पाठ्यक्रम पर एक ही अंक में हड्डी आकृति विज्ञान, मात्रा, और लंबाई में परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुक्रमिक में विवो जेडसीटी का उपयोग प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य विच्छेदन के बाद स्तनधारी blastema गठन की जांच करने के लिए और 2 तकनीकों, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और विवो जेडसीटी में अनुक्रमिक प्रदर्शन करने के लिए है, intramembranous हड्डी पुनर्जनन के अध्ययन के लिए.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

यहाँ, हम वयस्क माउस distal टर्मिनल phalanx (P3) विच्छेदन, एक प्रक्रियात्मक सरल और epimorphic पुनर्जनन के reproducible स्तनधारी मॉडल है, जो blastema गठन और intramembranous ossification द्वारा विश्लेषण शामिल है की एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अनुक्रमिक इन-विवो माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी (जेडसीटी)। मैमली पुनर्जनन टर्मिनल phalanx (P3) के distal क्षेत्र transecting विच्छेदन के लिए प्रतिबंधित है; अधिक समीपस्थ स्तर पर विच्छेदन किए गए अंक फाइब्रोटिक उपचार और निशान गठन से गुजरना करने में विफल रहते हैं। पुनर्जनन प्रतिक्रिया एक proliferative blastema के गठन के द्वारा मध्यस्थता की है, इसके बाद हड्डी पुनर्जनन के माध्यम से intrembranous ossification के लिए विच्छेदन कंकाल लंबाई बहाल करने के द्वारा. P3 विच्छेदन स्तनधारियों में epimorphic पुनर्जनन की जांच करने के लिए एक पूर्व नैदानिक मॉडल है, और एक सफल पुनर्योजी प्रतिक्रिया के साथ फाइब्रोटिक चिकित्सा की जगह चिकित्सीय रणनीतियों के डिजाइन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. हमारे प्रोटोकॉल के लिए फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करता है 1) जल्दी और लेट blastema सेल आबादी की पहचान, 2) अध्ययन पुनर्जनन के संदर्भ में revascularization, और 3) जटिल हड्डी के लिए आवश्यकता के बिना intramembranous ossification की जांच स्थिरीकरण उपकरणों. हम विच्छेदन के बाद आकृतिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को बनाने के लिए विवो में अनुक्रमिक के उपयोग के साथ-साथ पुनर्जनन के दौरान एक ही अंक में मात्रा और लंबाई में परिवर्तन भी प्रदर्शित करते हैं। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल दोनों epimorphic और स्तनधारियों में ऊतक पुनर्योजी प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए जबरदस्त उपयोगिता प्रदान करता है.

6/7 DPA पर वयस्क माउस regenerating P3 अंक (चित्र 2A-D), 9 DPA (चित्र 2E-H), और 10 DPA (चित्र 2I-L) Runx2, OSX, और PCNA के लिए एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा किया गया था intramembranous हड्डी कल्पना करने के लिए...

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Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

वयस्क माउस अंक विच्छेदन और पुनर्जनन: एक सरल मॉडल मैमलियन Blastema गठन और Intramembranous Ossification की जांच करने के लिए

यहाँ, हम वयस्क माउस टर्मिनल phalanx विच्छेदन का एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए स्तनधारी blastema गठन और intramembranous ossification की जांच, फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अनुक्रमिक में-vivo microcomputed टोमोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 विच्छेदन स्तनधारी एपीमॉर्फिक पुनर्जनन की जांच के लिए एक पूर्व नैदानिक मॉडल है और महत्वपूर्ण सेल आबादी और तंत्र की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो अंतर्जात उत्थान को नियंत्रित करता है। पी 3 मॉडल जल्दी और देर से ब्लास्टेमल सेल आबादी की पहचान, पुनर्जनन के दौरान पुनर्संवहन के अध्ययन, और जटिल अस्थि स्थिरीकरण उपकरण आवश्यकताओं के बिना नसों में ossification की जांच के लिए अनुमति देता है । मेरे साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन ओसामा कुरैशी, एलिसा फाल्क, और कैथरीन ज़िमेल, तकनीशियन, और रेजिना ब्रूनेर, एक अनुसंधान सहायक प्रोफेसर सभी हमारी प्रयोगशाला से होगा ।आठ से 12 सप्ताह पुराने सीडी-1 माउस में अंगुली चुटकी के जवाब की कमी की पुष्टि करने के बाद, जानवर की आंखों में मरहम लगाएं और माउस को 10X विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। प्रत्येक हिंद अंग के अंकों को निष्फल करने के लिए सर्जिकल पोविडोन आयोडीन और 70% इथेनॉल का उपयोग करें और सर्जिकल साइट से बालों को ट्रिम करने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें। सर्जिकल साइट को एनेस्थेटाइज करने के लिए स्थानीय रूप से सामयिक bupivacaine के एक माइक्रोलीटर लागू करें, और धीरे-धीरे मध्य अंक की सतह को बेनकाब करने के लिए एक हिंद पंजा खेलें।फिर वसा पैड के समानांतर कोण पर स्केलपेल को पकड़ते हुए, अंकों के टर्मिनल व्यूह के डिस्टल टिप को काटना के लिए बाँझ संख्या 10 स्केलपेल का उपयोग करें। प्रत्येक विच्छेदित अंक के लिए स्थानीय रूप से bupivacaine के एक अतिरिक्त माइक्रोलीटर लागू करें और घावों को घाव ड्रेसिंग के बिना और पूर्ण recumbency तक निगरानी के साथ ठीक करने की अनुमति देने के लिए माउस को एक साफ पिंजरे में वापस करें। एक सफल पी 3 विच्छेदन विमान को आश्वस्त करने के लिए, विच्छेदन के दौरान वसा पैड के समानांतर स्केलपेल पकड़ें और सही विच्छेदन लंबाई की पुष्टि करने के लिए माइक्रो-सीटी स्कैनिंग करें।उपयुक्त प्रायोगिक अंत बिंदु पर, लगभग दूसरे वेंट्रल फैट पैड इंडेंट पर मध्य व्यूह हड्डी के माध्यम से अंकों को तोड़ने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। ऊतक को 24 से 48 घंटे के लिए ताजा बफर जिंक फॉर्मेलिन फिक्सेटिव के 10 मिलीलीटर युक्त 20 मिलीलीटर प्रस्फुटित शीशी में स्थानांतरित करें। और प्रत्येक अंक के चार से पांच माइक्रोमीटर मोटी वर्गों को प्राप्त करने के लिए एक माइक्रोटॉम का उपयोग करें, स्लाइस को 38 से 41 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में रखने के रूप में वे प्राप्त कर रहे हैं एक हिस्टोलॉजिकल चिपकने वाला समाधान के साथ पूरक।फिर चिपकने वाली स्लाइड्स पर स्लाइस कैप्चर करें और स्लाइड्स को 37 डिग्री सेल्सियस स्लाइड पर रखें जो सूखने के लिए गर्म हो। जब स्लाइड ों को एक उपयुक्त एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान के एक धुंधला जार में नमूनों को विसर्जित कर दिया गया है, और स्लाइड को 25 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उबलना नहीं होता है। इनक्यूबेशन के अंत में, जार कमरे के तापमान पर आने के लिए अनुमति देते हैं, और आधार पर गीला ऊतक कागज के साथ एक इंच गहरे कवर प्लास्टिक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड फ्लैट रखना ।प्रत्येक नमूने में प्रीवार्मेड प्रोटीनेज के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक स्लाइड को पैराफिल्म की एक छोटी पट्टी के साथ कवर करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अनुभाग सूखे न बनें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 मिनट के बाद, ध्यान से पैराफिन फिल्म को हटा दें, और अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान को हटाने के लिए टिशू पेपर पर स्लाइड को धीरे से निकालें।इसके बाद, प्रत्येक स्लाइड में ब्याज के प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 से 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। चार डिग्री सेल्सियस पर एक रात के इनक्यूबेशन के लिए पैराफिन फिल्म के साथ कवर humidifying चैंबर के लिए साइटों को वापस । अगली सुबह TRIS-बफर खारा प्लस TWEEN या TBST में स्लाइड धोने के बाद कमरे के तापमान पर एक ४५ मिनट के इनक्यूबेशन के लिए एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ स्लाइड लेबल प्रकाश से संरक्षित ।इनक्यूबेशन के अंत में, स्लाइड्स को टीबीस्ट में धोएं और उन्हें सूखने दें। फिर सूखे स्लाइडों पर कवरस्लिप को ध्यान से रखने के लिए एंटी-फीका बढ़ते माध्यम के 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करें और बढ़ते माध्यम को सूखने की अनुमति देने के लिए रात भर कमरे के तापमान पर स्लाइड फ्लैट को स्टोर करें। वीवो माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी या माइक्रो-सीटी संगठन में अनुक्रमिक के लिए माइक्रो-सीटी इमेजर को माइक्रो-सीटी पशु कक्ष में और बाहर ऑक्सीजन प्रवाह को सक्षम करने के लिए ट्यूबिंग के साथ, यह सुनिश्चित करना कि आउटफ्लोइंग ऑक्सीजन आइसोफ्लाणे को ट्रैप करने के लिए एक सक्रिय चारकोल फिल्टर से लैस है।स्वराइज़ को 55 पीक किलोवोल्टेज पर 10.5 माइक्रोमीटर और 145 माइक्रोएम्प्स के साथ 180 डिग्री और 200 मिलीसेकंड के एकीकरण समय के साथ निरंतर रोटेशन के साथ सेट करें, जिसके परिणामस्वरूप प्रति स्कैन अधिकतम 213 स्लाइस होते हैं। जब स्कैनर तैयार हो जाता है, तो धीरे-धीरे माइक्रो-सीटी पशु कक्ष में एनेस्थेटाइज्ड माउस को फ्लैट में व्यवस्थित हिंद अंग अंकों के साथ रखें, बाईं ओर बाएं पंजा के साथ और स्कैनिंग प्लेटफॉर्म के दाईं ओर दाईं ओर क्लोज एसोसिएशन वेंट्रल साइड। फिर जगह में अंकों को धीरे से सुरक्षित करने के लिए सर्जिकल टेप लागू करें।स्कैन शुरू करने से पहले जानवर की आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं। स्कैनिंग के बाद, पूर्ण recumbency तक निगरानी के साथ एक साफ पिंजरे में पशु वापसी, और माइक्रो सीटी छवि पुनर्निर्माण के लिए कई घंटे तक की अनुमति देते हैं । पुनर्निर्मित 3डी बोन इमेज के विश्लेषण के लिए, माइक्रो-सीटी के साथ प्रदान किए गए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, छवि फ़ाइलों को DICOM फ़ाइलों की एक श्रृंखला में परिवर्तित करें।जब सभी फाइलों को परिवर्तित कर दिया गया हो, तो वेब ब्राउज़र में बैच फाइल डाउनलोडर का उपयोग करके एक ही फ़ोल्डर में DICOM श्रृंखला डाउनलोड करें। इमेजजे प्लग-इन फोल्डर में बोनजे प्लग-इन लोड करें। फाइलों को खोलने के लिए डीआईकॉम फाइल सीरीज फोल्डर को इमेजजे बार में खींचें और छोड़ दें।ग्रे मूल्यों के सभी प्रदर्शित एक 16 बिट छवि ढेर खोला जाएगा । केवल हड्डी प्रदर्शित करने के लिए, इमेज एडजस्ट और थ्रेसहोल्ड पर क्लिक करें। ऊपरी सीमा पट्टी को दूर तक स्लाइड करें और निचले सीमा पट्टी को समायोजित करें जब तक कि केवल हड्डी लाल रंग पर प्रकाश न डाला जाए।कम सीमा मूल्य लगभग 10, 000 से 13, 000 32, 767 की अधिकतम संकेत तीव्रता पर होगा। लागू करें और नए संवाद बॉक्स में, ब्लैक बैकग्राउंड पर क्लिक करें। इसके बाद, ओके पर क्लिक करें। काले और सफेद मूल्यों को प्रदर्शित करने वाली आठ-बिट छवि उत्पन्न की जाएगी।हड्डी के अनुरूप सफेद के साथ। इसे चुनने और स्टैक को डुप्लिकेट करने के लिए पी 3 हड्डी के चारों ओर एक आयत ड्रा करें। 3D इमेज जेनरेट करने के लिए, प्लगइन्स और 3डी व्यूअर पर क्लिक करें और हड्डी को हटाने के लिए फ्रीहैंड चयन टूल का उपयोग करें।फिर सही क्लिक करें और छवि से किसी भी अनावश्यक हड्डी फसल के लिए चयन भरें चुनें। 3डी रेंडरिंग से हड्डी की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बोनजे प्लग-इन खोलें और वॉल्यूम फ्रैक्शन का चयन करें। एक परिणाम खिड़की दिखाई देगी और मिलीमीटर क्यूब में प्रदर्शित हड्डी की मात्रा।3डी रेंडरिंग से हड्डी की लंबाई की मात्रा निर्धारित करने के लिए, इमेजजे मल्टीपॉइंट टूल का उपयोग करें। 3D रेंडरिंग की इमेज कैप्चर करने के लिए व्यू पर क्लिक करें और स्नैपशॉट लें। फिर छवि को टीआईएफ या जेपीईजी फ़ाइल के रूप में सहेजें।पी 3 अंकों को पुनर्जीवित करने वाले वयस्क माउस के इन छवियों वर्गों में नसों की हड्डी उत्थान और ब्लास्टेमा गठन की कल्पना करने के लिए एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोडांड किया गया था, जो छह से सात, नौ और 10 के बाद विच्छेदन पर था। यहां, विच्छेदन से पहले स्कैन किए गए अंकों के प्रतिनिधि माइक्रो-सीटी प्रतिपादन और लंबाई माप की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले स्थलों के साथ पुनर्जनन के दौरान विभिन्न समय बिंदुओं पर दिखाए जाते हैं। माउस अंक मॉडल एक समर्थक पुनर्योजी घाव वातावरण का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली है जो डिस्टल स्तर पर काटने पर ब्लास्टेमा गठन को ट्रिगर करती है।इसके विपरीत, अंकों का समीपस्थ विच्छेदन पुनर्जनन को बढ़ाने के लिए परीक्षण रणनीतियों के लिए एक साइट के साथ-साथ पुनर्योजी विफलता की जांच के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में कार्य करता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamicin प्रेरित चोट से वयस्क zebrafish में किडनी पुनर्जनन

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

नुकसान और लाभ के समारोह दृष्टिकोण Preimplantation माउस भ्रूण के प्रारंभिक दिनों में सेल भाग्य अवधारक जांच

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

एक सुरक्षित और सरल विधि वयस्क त्वचा fibroblasts से इंसुलिन स्रावित कोशिकाओं को प्राप्त करने के रूप में Epigenetic रूपांतरण

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

सीमित तत्व मॉडल के निर्माण Zebrafish जबड़ा बायोमैकेनिक्स जांच

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Murine भ्रूण Metatarsals की संस्कृति: endochondral हड्डी बन जाना के एक शारीरिक मॉडल

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

वीवो में Trypanosoma cruzi गतिशीलता की जांच के लिए एक पशु मॉडल के रूप में लार्वा Zebrafish की स्थापना

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

माउस अस्थि मज्जा की एक RANKL आधारित अस्थिशोषक संस्कृति परख अस्थिशोषक गठन में mTORC1 की भूमिका की जांच करने के लिए

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

रासायनिक विच्छेदन और Planarian में ग्रसनी के पुनर्जनन Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

आंशिक Lobular Hepatectomy: सुघड़ जिगर पुनर्जनन के लिए एक शल्य मॉडल

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

वयस्क त्वचा ऊतक से प्राथमिक मानव Keratinocytes को अलग करने के लिए एक सरलीकृत और कुशल विधि

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...