Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

무네오카 연구소와 텍사스 유전체 의학 연구소(TIGM)의 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 텍사스 A & M 대학에 의해 지원되었다.

모든 동물 사용 및 기술은 텍사스 A&M 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 표준 운영 절차를 준수했습니다.
1. 성인 마우스 뒷다리 말단 P3 절단
<ol><li>산소에 이소플루란 가스를 사용하여 8~ 12주령 CD-1마우스(물자표)를 마취; 처음에는 챔버에서 3 %에서 마취되고 수술 기간 동안 2 %의 이소플루란이 코콘에 의해 공급됩니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

이 프로토콜은 성인 마우스 말단 P3 절단, 형광 면역 조직 화학 염색의 표준화 된 절차를 설명하여 블라스트마 형성 및 비변형 골화를 시각화하고 조사하고, 순차적으로 생체 내 μCT 스캐닝을 절단 후 골형태, 부피 및 길이 변경을 식별합니다. P3 절단은 blastema 대형을 유발하는 재생 성 상처 환경을 분석하는 독특하고 절차적으로 간단하고 재현 가능한 모델입니다. 또한, P3 자리 모델은 기존의 뼈 부...

포유동물은 인간 및 마우스를 포함하며, 말단 지골(P3)의 말단 절단 후 그들의 자릿수의 팁을 재생할 수 있는 능력을 가지며,2,3. 마우스에서, 재생 반응은 절단 수준 의존; 점점 근위 수 자릿수 절단P3 네일 매트릭스4,5,6에 절단 시절단에서 완전한 재생 실패까지 점진적으로 감쇠 재생 반응을 표시 , 7명 , 8.P3 재생은 절단된 구조물을 재생하기 위해 형태 형성을 겪는 증식 세포의 집단으로서 정의되는 블라스마의 형성에 의해 매개된다9. 절단에 의해 손실 된 구조를 재생하는 블라스테마의 형성, 프로세스 는 상형 재생이라고, 부상 후 기존의 조직 수리에서 다조직 수준의 P3 재생 반응을 구별6, 10. P3 재생은 상처 치유11,12,뼈 증11,12,및 12를 포함한 복잡한 재생 과정을 조사하는 재현 가능하고 절차적으로 간단한 모델입니다. 혈관신생13,말초신경재생14, 골수변환을 통한 골수변환(15).
면역성 화학을 이용한 이전 연구는 블라마가 이질성, 혈관, 저산소성 및 매우 증식성11,13,15,16임을입증했다. 말단 P3 절단 에 이어, 초기 블라스트마는 처음에 P3 골막 및 내분과 연관되며 뼈표면(15)에인접한 강력한 증식 및 초기 골형성을 특징으로 한다. 뼈 분해 및 상처 폐쇄 후, 이질적인 blastema는 후피오스텔스와 내분과 관련된 세포의 병합에 의해 형성되고, 그 다음에는 인트라엠브라우스 골화를 통해 뼈를 포함한 골반 성분의 분화가 뒤따릅니다. 15.
상해에 응하여 뼈 수리는 전형적으로 endochondral 골화에 의해, 즉 후속 뼈 형성을 위한 템플릿을 형성하는 초기 연골 굳은 살을 통해 발생합니다17,18. 긴 뼈 intramembranous 골화, 즉, 연골 중간체없이 뼈 형성, 일반적으로 복잡한 산만 장치 또는 수술 고정을 사용하여 유도19,20. 자리 재생 반응은 기존의 intramembranous ossification 모델에 비해 이점을 제공하는 전 임상 모델입니다: 1) intramembranous ossification을 자극하기 위하여 외부 또는 내부 고정 포스트 상해를 요구하지 않습니다, 2) 각 동물의 4자리 숫자를 사용하여 수행하여 동물 사용을 최소화하면서 샘플을 최대화하고 3) 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 분석을 쉽고 빠르게 수행 할 수 있습니다.
본 연구에서, 우리는 재현 가능하고 강력한 재생 반응을 달성하기 위해 표준화 된 P3 절단 평면을 보여줍니다. 또한, 파라핀 섹션을 사용하여 파라핀 섹션을 사용하여 파라페증 형성, 재생의 맥락에서의 재혈관화, 인트라엠브러스를 통한 뼈로의 배반 변환을 시각화하는 최적화된 형광 면역조직 화학 프로토콜을 시연합니다. 고성화. 우리는 또한 재생 과정에서 동일한 숫자의 뼈 형태, 부피 및 길이의 변화를 식별하기 위해 순차적 인 생체 내 μCT의 사용을 보여줍니다. 이 프로토콜의 목적은 절단 후 포유류 배증마 형성을 조사하고 2 가지 기술, 형광 면역 조직 화학 및 생체 내 순차적 μCT를 입증하는 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

여기에서, 우리는 성인 마우스 말단 말두 지골 (P3) 절단의 프로토콜을 제시, 상형 재생의 절차적으로 간단하고 재현 가능한 포유류 모델, 이는 배반 형성및 분석 된 비정형 골화를 포함 형광 면역 조직 화학 및 순차적 인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT). 포유류 재생은 말단 지골(P3)의 말단 영역을 경각시키는 절단으로 제한된다; 더 근위 수준에서 절단 된 숫자는 재생및 섬유 성 치유와 흉터 형성을 받아야하지 않습니다. 재생 반응은 증식 블라스트ema의 형성에 의해 매개되고, 절단 된 골격 길이를 복원하기 위해 intramembranous 골화를 통한 뼈 재생이 뒤따릅니다. P3 절단은 포유동물에서 의상 재생을 조사하는 전임상 모델이며, 성공적인 재생 반응으로 섬유성 치유를 대체하는 치료 전략의 설계를 위한 강력한 도구이다. 우리의 프로토콜은 1) 형광 면역 성 화학을 사용하여 1) 조기 및 후기 블라베ema 세포 집단을 식별하고, 2) 재생의 맥락에서 연구 revascularization, 3) 복잡한 뼈에 대한 필요없이 intramembranous 골화를 조사 안정화 장치. 우리는 또한 절단 후 형태 학적 변화를 검사할 뿐만 아니라 재생 과정에서 동일한 숫자의 볼륨과 길이 변화를 정량화하기 위해 고해상도 이미지를 만들기 위해 생체 내 μCT에서 순차적 사용을 입증합니다. 우리는 이 프로토콜이 포유류에서 에피소드및 조직 재생 반응을 조사하기 위해 엄청난 유용성을 제공한다고 믿습니다.

6/7 DPA(그림 2A-D), 9DPA(그림 2E-H) 및 10DPA(그림2I-L)에서P3 자릿수를 재생성 마우스를 렌x2, OSX 및 PCNA에 대한 항체로 면역으로 염색하여 인화골을 시각화하였다. 재생, 및 VWF에 대한 항체로 면역을 염색하여 blastema 형성을 시각화합니다. 절단 전 및 재생 과정에 걸쳐 다양한 시점에서 스캔된 자릿수?...

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Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

성인 마우스 숫자 절단 및 재생 : 포유류 블라스터 마 형성 및 intramembranous Ossification을 조사하는 간단한 모델

여기에서, 우리는 형광 성 면역 조직 화학 및 순차적인 생체 내 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 분석된 포유류 배반증 의 형성 및 intramembranous 골화를 조사하기 위하여 성숙한 마우스 말두 지골 절단의 프로토콜을 제시합니다.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 절단은 포유류 상형 재생을 조사하기 위한 전임상 모델이며 내인성 재생을 제어하는 중요한 세포 집단 및 메커니즘을 식별하기위한 강력한 도구입니다. P3 모델은 조기 및 후기 발아 세포 집단의 식별, 재생 중 의 재변 성 연구, 복잡한 뼈 안정화 장치 요구 사항없이 내성 골화의 조사를 허용합니다. 저와 함께 절차를 시연하는 것은 오사마 쿠레시, 알리사 팔크, 그리고 캐서린 짐멜, 기술자, 레지나 브루나에르, 우리의 실험실에서 모두 연구 조교수가 될 것입니다.8 주에서 12 주 된 CD-1 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 동물의 눈에 연고를 적용하고 10배 해부 현미경 아래에 마우스를 배치합니다. 수술용 포비도네 요오드와 70%에탄올을 사용하여 각 뒷다리의 숫자를 살균하고 미세 시저를 사용하여 수술 부위에서 머리카락을 다듬습니다. 국소 부피바카인 1개를 국소 부피바카인 1개를 현지에서 적용하여 수술 부위를 마취하고, 한 뒷발을 부드럽게 재생하여 내측 자릿수 표면을 노출시합니다.그런 다음 메스를 지방 패드와 평행하게 각도로 잡고 멸균 번호 10 메스를 사용하여 2 자리와 4 자리의 단말 지골의 단부 끝을 절단합니다. 절단된 각 수분에 부피바카인 을 추가로 적용하고 마우스를 깨끗한 케이지로 돌려보내 상처 드레싱 없이 완전한 재조정까지 모니터링할 수 있도록 하십시오. 성공적인 P3 절단 평면을 보장하기 위해 절단 중에 메스를 지방 패드와 평행하게 잡고 미세 CT 스캐닝을 수행하여 올바른 절단 길이를 확인합니다.적절한 실험 종점에서 메스를 사용하여 약 두 번째 복부 지방 패드 들여쓰기에서 중간 지골 뼈를 통해 중간 지골 뼈를 통해 숫자를 끊습니다. 24~48시간 동안 10밀리리터의 신선한 완충 아연 포르말린 고정을 포함하는 20밀리리터 신발성 바이알로 조직을 옮기다. 그리고 마이크로토메를 사용하여 각 자릿수의 4~5마이크로미터 두께의 부분을 획득하여 슬라이스를 38~41도의 수조에 배치하여 조직학적 접착제 용액을 획득합니다.그런 다음 점착 슬라이드에 슬라이스를 캡처하고 건조 37도 섭씨 슬라이드 워머에 슬라이드를 배치합니다. 슬라이드가 적절한 항원 검색 용액의 염색 용기에 샘플을 담그고 슬라이드를 25분 동안 섭씨 95도로 가열하여 끓이지 않도록 합니다. 인큐베이션의 끝에서 항아리가 실온에 와서 바닥에 촉촉한 티슈 페이퍼가있는 1 인치 깊이 덮인 플라스틱 슬라이드 상자에 슬라이드를 평평하게 놓습니다.각 샘플에 미리 따뜻해지는 단백질Ase K 100 마이크로리터를 추가합니다. 각 슬라이드를 작은 파라필름 스트립으로 덮어 섹션이 건조하지 않도록 합니다. 섭씨 37도에서 12분 후, 파라핀 필름을 조심스럽게 제거하고 티슈 페이퍼의 슬라이드를 부드럽게 배출하여 과도한 차단 용액을 제거합니다.다음으로, 각 슬라이드에 관심있는 1 차 항체 용액의 100 ~ 200 마이크로 리터를 추가합니다. 4도에서 하룻밤 잠복을 위해 파라핀 필름으로 덮인 가습 챔버로 사이트를 반환하십시오. 다음날 아침 TRIS 완충식식염수와 TWEEN 또는 TBST라벨은 빛으로부터 보호되는 실온에서 45분 배양에 적합한 이차 항체 용액으로 슬라이드를 라벨로 표시합니다.인큐베이션이 끝나면 TBST에서 슬라이드를 세척하고 건조시키십시오. 그런 다음 100 마이크로리터의 페이드 장착 매체를 사용하여 말린 슬라이드에 커버립을 조심스럽게 배치하고 매끄러움으로부터 보호되는 실온에서 슬라이드를 평평하게 보관하여 장착 매체가 건조할 수 있도록 합니다. 순차적으로 생체 내 마이크로 컴퓨팅 단층 촬영 또는 마이크로 CT 복장을 위해 마이크로 CT 동물 챔버안팎으로 산소 흐름을 가능하게 하는 튜브가 있는 마이크로 CT 이미저를 사용하여 유출된 산소에 이소플루란을 포획하기 위한 활성탄 필터가 장착되어 있는지 확인합니다.Voxelsize를 55피크 킬로전압에서 10.5마이크로미터로 설정하고 180도당 1, 000프로젝션, 연속 회전 시간은 200밀리초로 연속 회전하여 스캔당 최대 213개의 슬라이스를 생성합니다. 스캐너가 준비되면 마취된 마우스를 마이크로 CT 동물 챔버에 부드럽게 배치하고 뒷다리 숫자가 평평하고 가까운 접견 복부 면을 왼쪽 에 있는 왼쪽 발과 스캐닝 플랫폼의 오른쪽에 배치합니다. 그런 다음 수술 용 테이프를 적용하여 숫자를 부드럽게 고정하십시오.검사를 시작하기 전에 동물의 눈에 안과 연고를 바치면 됩니다. 스캔 후, 완전한 recumncy까지 모니터링깨끗한 케이지에 동물을 반환하고 마이크로 CT 이미지 재구성을 위해 최대 몇 시간을 허용합니다. 재구성된 3D 골격 이미지를 분석하려면 마이크로 CT와 함께 제공된 소프트웨어를 사용하여 이미지 파일을 일련의 DICOM 파일로 변환합니다.모든 파일이 변환되면 웹 브라우저에서 일괄 처리 파일 다운로더를 사용하여 단일 폴더에서 DICOM 시리즈를 다운로드합니다. ImageJ 플러그인 폴더에 BoneJ 플러그인을 로드합니다. DICOM 파일 시리즈 폴더를 ImageJ 막대에 드래그 앤 드롭하여 파일을 엽니다.모든 회색 값을 표시하는 16비트 이미지 스택이 열립니다. 골격만 표시하려면 이미지 조정 및 임계값을 클릭합니다. 위쪽 임계값 막대를 맨 오른쪽으로 밀어 내고 골격만 빨간색으로 강조 표시될 때까지 아래 임계값 막대를 조정합니다.낮은 임계값은 32, 767의 최대 신호 강도에서 약 10, 000 ~ 13, 000이 될 것이다. 적용을 클릭하고 새 대화 상자에서 검은 배경을 클릭합니다. 다음으로 확인을 클릭합니다. 흑백 값을 표시하는 8비트 이미지가 생성됩니다.뼈에 해당하는 흰색으로. P3 골격 주위에 사각형을 그려 서 선택하고 스택을 복제합니다. 3D 이미지를 생성하려면 플러그인 및 3D 뷰어를 클릭하고 프리핸드 선택 도구를 사용하여 삭제할 골격을 동그라미로 조정합니다.그런 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 채우기 선택을 선택하여 이미지에서 불필요한 골격을 자르게 합니다. 3D 렌더링에서 골격 볼륨을 정량화하려면 BoneJ 플러그인을 열고 볼륨 분수를 선택합니다. 결과 창이 나타나고 골격 볼륨이 밀리미터 큐브단위로 표시됩니다.3D 렌더링에서 골격 길이를 정량화하려면 ImageJ 멀티포인트 도구를 사용합니다. 3D 렌더링의 이미지를 캡처하려면 보기를 클릭하고 스냅샷을 찍습니다. 그런 다음 이미지를 TIF 또는 JPEG 파일로 저장합니다.P3 숫자를 재생하는 성인 마우스의 이러한 이미지 섹션에서는 6일째에서 7일, 9일 및 10일째에 자궁내 골 재생 및 블라데마 형성을 시각화하기 위해 항체로 면역염색하였다. 여기서, 절단 전에 스캔된 숫자의 대표적인 마이크로 CT 렌더링과 길이 측정을 식별하는 데 사용되는 랜드마크를 사용하여 재생하는 동안 다양한 시점에서 스캔한 것이 표시됩니다. 마우스 자리 모델은 말단 수준에서 절단 할 때 블라데마 형성을 트리거 프로 재생 상처 환경을 분석하기위한 강력한 시스템입니다.반대로, 숫자의 근위 절단은 재생 실패를 조사하기 위한 모델 시스템뿐만 아니라 재생을 향상시키기 위한 테스트 전략을 위한 사이트역할을 합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

성인 피부 섬유 아 세포에서 인슐린 분비 세포를 얻을 수있는 안전하고 간단한 방법으로 성적인 변환

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Zebrafish의 턱 역학을 조사하기 위해 유한 요소 모델을 구축

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

조사 Trypanosoma cruzi 운동 비보 를 동물 모델로 서 애벌레 Zebrafish의 설립

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

화학 절단 및 Planarian Schmidtea 지중해 에 인 두의 재생

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

부분 Lobular Hepatectomy: Morphologic 간 재생에 대 한 수술 모델

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...