Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Muneoka Lab og Texas Institute for genomisk Medicine (TIGM). Dette arbeidet ble støttet av Texas A & M University.

Alle dyr bruk og teknikker var inne medgjørlighet det målestokk fungerer prosedyrer av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité av Texas en & M universitet.
1. voksen mus hind lem og så P3 amputasjon
<ol><li>Bedøve en 8 til 12 uke gamle CD-1 mus (tabell av materialer) ved hjelp av isoflurane gass i oksygen; utgangspunktet bedøve på 3% i et kammer, etterfulgt av 2% isoflurane levert av en nosecone over varigheten av operasjonen. Påfør øye salve på øynene for ...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en standardisert prosedyre av voksen mus som er i ferd P3 amputasjon, fluorescerende immunhistokjemiske farging for å visualisere og undersøke blastema formasjon og Intramembranous forbening, og sekvensiell in-vivo Benvolum skanning til identifisere bein morfologiske, volum og lengde endringer etter amputasjon. P3 amputasjon er en unik, Prosedyremessig enkel, og reproduserbar modell for å analysere en Pro-regenererende sår miljø som utløser blastema formasjon. Videre, det P3 tall modell ...

Pattedyr, inkludert mennesker og mus, har kapasitet til å regenerere tuppen av sine sifre etter en slik amputasjon av Terminal falanks (P3)1,2,3. I mus, den regenerering responsen er amputasjon-nivå-avhengig; stadig proksimale siffer amputasjoner vise en gradvis svekket regenererende respons til fullstendig regenererende svikt på amputasjoner transecting og proksimale til P3 Nail Matrix4,5,6 , 7 andre er , 8. P3 regenerering er formidlet av dannelsen av en blastema, definert som en befolkning på voksende celler som gjennomgår morphogenesis å regenerere amputert strukturer9. Dannelsen av en blastema å regenerere strukturene tapt ved amputasjon, en prosess betegnes epimorphic gjenfødelse, skiller multi-vev-nivå P3 regenerering respons fra tradisjonelle vev reparasjon etter skade6, 10. P3 regenerering er en reproduserbar og Prosedyremessig enkel modell for å undersøke komplekse regenererende prosesser inkludert såret healing11,12, Bone histolysis11,12, revaskularisering13, perifere nerve regenerering14, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening15.
Tidligere studier bruker immunhistokjemi har vist at blastema er heterogen, Avascular, hypoxic, og svært proliferativ11,13,15,16. Etter den begynnende P3 amputasjon, er den tidlige blastema i utgangspunktet knyttet til P3-periosteum og endosteum og kjennetegnes av robust spredning og gryende Osteogenesis ved siden av bein overflaten15. Etter bein degradering og sår lukking, dannes den heterogene blastema ved sammenslåing av periostal og endosteal celler, etterfulgt av differensiering av blastemal komponenter, inkludert bein via Intramembranous forbening 15av dem.
Bone reparasjon som svar på skade vanligvis oppstår ved endokondral forbening, dvs via en innledende cartilaginous Callus som danner en mal for påfølgende bein formasjon17,18. Lange ben Intramembranous forbening, dvs., beindannelse uten cartilaginous mellomliggende, er vanligvis indusert ved hjelp av komplekse distraksjon enheter eller kirurgisk fiksering19,20. Den sifrede regenerering responsen er en pre-klinisk modell som gir fordeler fremfor konvensjonelle Intramembranous forbening modeller: 1) det krever ikke ekstern eller intern fiksering etter skade for å stimulere Intramembranous forbening, 2) det er utført benytter 4 sifre fra hver dyr, således maksimere eksemplar stund minimere dyr bruk, og 3) sammenhengende inne vivo microcomputed tomografi (Benvolum) analyse kan utført med lette og fart.
I denne studien viser vi standardisert P3 amputasjon flyet for å oppnå en reproduserbar og robust regenerering respons. I tillegg viser vi en optimalisert fluorescens immunhistokjemi protokoll ved hjelp av para fin seksjoner for å visualisere blastema formasjon, revaskularisering i sammenheng med regenerering, og blastemal konvertering til bein via Intramembranous forbening. Vi demonstrerer også bruken av sekvensielle in-vivo Benvolum for å identifisere endringer i bein morfologi, volum og lengde i samme siffer i løpet av regenerering. Målet med denne protokollen er å undersøke pattedyr blastema formasjon etter amputasjon og å demonstrere 2 teknikker, fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in vivo Benvolum, for studiet av Intramembranous bein gjenfødelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Her presenterer vi en protokoll av voksen mus falanks Terminal (P3) amputasjon, en Prosedyremessig enkel og reproduserbar pattedyr modell av epimorphic gjenfødelse, som innebærer blastema dannelse og Intramembranous forbening analysert av fluorescens immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi (Benvolum). Regenerering av pattedyr er begrenset til amputasjoner transecting den delen av Terminal falanks (P3). sifre amputert på mer proksimale nivåer mislykkes i å regenerere og gjennomgå antifibrotiske healing og arrdannelse. Den regenerering responsen er formidlet av dannelsen av en proliferativ blastema, etterfulgt av bein regenerering via Intramembranous forbening å gjenopprette amputert skjelett lengde. P3 amputasjon er en prekliniske modell for å undersøke epimorphic regenerering i pattedyr, og er et kraftig verktøy for utforming av terapeutiske strategier for å erstatte antifibrotiske helbredelse med en vellykket regenererende respons. Vår protokoll bruker fluorescens immunhistokjemi til 1) identifisere tidlig-og-sent blastema celle populasjoner, 2) studie revaskularisering i sammenheng med regenerering, og 3) undersøke Intramembranous forbening uten behov for komplekse bein og stabiliserings enheter. Vi demonstrerer også bruken av sekvensiell in vivo Benvolum for å lage bilder med høy oppløsning for å undersøke morfologiske endringer etter amputasjon, i tillegg til å kvantifisere volum-og lengde endringer i samme siffer i løpet av regenerering. Vi tror denne protokollen tilbyr enorm nytte å undersøke både epimorphic og vev regenererende svar i pattedyr.

Voksen mus regenererer P3 sifre på 6/7 DPA (figur 2a-D), 9 DPA (figur 2e-H), og 10 DPA (figur 2i-L) ble immunostained med antistoffer mot Runx2, OSX og PCNA å visualisere Intramembranous bein regenerering, og immunostained med antistoffer mot CXCR4 og vWF for å visualisere blastema dannelse. Representative Benvolum gjengivelser av sifre skannet før amputasjon og ved ulike tidspu...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Voksen mus siffer amputasjon og regenerering: en enkel modell for å undersøke pattedyr blastema formasjon og Intramembranous forbening

Her presenterer vi en protokoll av voksen mus Terminal falanks amputasjon å undersøke pattedyr blastema dannelse og Intramembranous forbening, analysert av fluorescerende immunhistokjemi og sekvensiell in-vivo microcomputed tomografi.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 amputasjon er en preklinisk modell for å undersøke pattedyr epimorfe regenerering og et kraftig verktøy for å identifisere kritiske cellepopulasjoner og mekanismer som kontrollerer endogene regenerering. P3-modellen gjør det mulig å identifisere tidlige og sene blastemale cellepopulasjoner, studiet av revaskularisering under regenerering, og undersøkelse av intramembranøs ossifikasjon uten komplekse beinstabiliseringsenhetskrav. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Osama Qureshi, Alyssa Falck, og Katherine Zimmel, tekniker, og Regina Brunaeur, en forskningsassistent professor alle fra vårt laboratorium.Etter å ha bekreftet mangel på respons på tåklemme i en åtte til 12 uker gammel CD-1-mus, Påfør salve på dyrets øyne og plasser musen under et 10X disseksjonsmikroskop. Bruk kirurgisk povidone jod og 70% etanol for å sterilisere sifrene i hvert baklem og bruke mikroscissorer til å trimme håret vekk fra operasjonsstedet. Påfør en mikroliter av aktuell bupivakain lokalt for å bedøve operasjonsstedet, og spill forsiktig en bakpote for å avsløre den mediale sifferoverflaten.Deretter holder skalpell i en vinkel parallelt med fettputen, bruk et sterilt nummer 10 skalpell for å amputere den distale spissen av terminalfalanksen av sifre to og fire. Påfør en ekstra mikroliter bupivakain lokalt til hvert amputerte siffer og returner musen til et rent bur for å la sårene helbrede uten sårdressing og med overvåking til full recumbency. For å sikre et vellykket P3 amputasjonsplan, hold skalpell parallelt med fettputen under amputasjonen og utfør mikro-CT-skanning for å bekrefte riktig amputasjonslengde.På riktig eksperimentelt endepunkt, bruk en skalpell for å bryte sifferet midtveis gjennom den midterste phalanx bein på omtrent den andre ventral fett pad innrykk. Overfør vevet til et 20-milliliter scintillasjons hetteglass som inneholder 10 milliliter fersk bufret sink formalin fixative i 24 til 48 timer. Og bruk en mikrotom til å skaffe fire til fem mikrometer tykke deler av hvert siffer, plassere skiver i en 38 til 41 grader Celsius vannbad supplert med en histologisk limløsning som de oppnås.Deretter fanger skivene på selvklebende lysbilder og plasserer lysbildene på en 37-graders Celsius lysbilde varmere til tørk. Når lysbildene er deparaffinisert, dypp prøvene i en farskrukke med en passende antigenhentingsløsning, og varme lysbildene til 95 grader Celsius i 25 minutter, og pass på at koking ikke oppstår. På slutten av inkubasjonen, la krukken komme til romtemperatur, og legg lysbildene flatt i en en-tommers dypdekket plastsklieboks med fuktet vevspapir ved basen.Tilsett 100 mikroliter med forvarmede proteiner K til hver prøve. Dekk hvert lysbilde med en liten parafilmstripe for å sikre at seksjonene ikke blir tørre. Etter 12 minutter ved 37 grader Celsius, fjern parafinfilmen forsiktig, og tøm forsiktig lysbildene på papir for å fjerne overflødig blokkeringsløsning.Deretter legger du til 100 til 200 mikroliter av den primære antistoffløsningen av interesse for hvert lysbilde. Returner stedene til fuktingskammeret dekket med parafinfilm for en overnattingsinkubasjon ved fire grader Celsius. Neste morgen etter vasken i TRIS-bufret saltvann pluss TWEEN eller TBST merke lysbildene med en passende sekundær antistoffløsning for en 45-minutters inkubasjon ved romtemperatur beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen vasker du lysbildene i TBST og lar dem tørke. Bruk deretter 100 mikroliter anti-fade monteringsmedium for å forsiktig plassere dekkslips på de tørkede lysbildene og lagre lysbildene flatt ved romtemperatur over natten beskyttet mot lys slik at monteringsmediet tørker. For sekvensiell in vivo mikro-computertomografi eller mikro-CT antrekk mikro-CT imager med rør for å aktivere oksygenflyt inn og ut av mikro-CT dyrekammeret, sørg for at utstrømning oksygen er utstyrt med en aktivert kull filter for å fange isofluran.Sett Voxelsize til 10,5 mikrometer ved 55 topp kilovoltage og 145 mikroamper med 1000 projeksjoner per 180 grader og kontinuerlig rotasjon med en integrasjonstid på 200 millisekunder, noe som resulterer i maksimalt 213 skiver per skanning. Når skanneren er klar, plasserer du forsiktig den bedøvede musen i mikro-CT-dyrekammeret med baklemmersifrene anordnet i flat, nær tilknytning ventral side opp med venstre pote på venstre side og høyre på høyre side av skanneplattformen. Påfør deretter kirurgisk tape for å forsiktig feste sifrene på plass.Påfør oftalmisk salve på dyrets øyne før du starter skanningen. Etter skanning, returnere dyr til et rent bur med overvåking til full recumbency, og tillate opptil flere timer for mikro-CT bilde rekonstruksjon. For analyse av det rekonstruerte 3D-beinbildet, ved hjelp av programvaren som følger med mikro-CT, konvertere bildefilene til en rekke DICOM-filer.Når alle filene er konvertert, laster du ned DICOM-serien i en enkelt mappe ved hjelp av en satsvis filnedlaster i en nettleser. Last inn BoneJ-plugin-modulen i mappen ImageJ-plugin-modulen. Dra og slipp mappen DICOM filserie i ImageJ-linjen for å åpne filene.En 16-biters bildestakk som viser alle de grå verdiene, åpnes. Hvis du bare vil vise bein, klikker du Bildejustering og Terskel. Skyv den øvre terskellinjen helt til høyre og juster den nedre terskelstangen til bare beinet er uthevet rødt.Den lavere terskelverdien vil være ca 10.000 til 13.000 med en maksimal signalintensitet på 32.767. Klikk Bruk, og klikk Svart bakgrunn i den nye dialogboksen. Deretter klikker du OK. Et åtte-biters bilde som viser svart-hvitt-verdier, genereres.Med den hvite som tilsvarer bein. Tegn et rektangel rundt P3-beinet for å velge det og duplisere stabelen. Hvis du vil generere et 3D-bilde, klikker du på Plugins og 3D Viewer og bruker frihåndsvalgverktøyet til å sirkle rundt beinet som skal slettes.Høyreklikk deretter og velg Fyllvalg for å beskjære unødvendig bein fra bildet. Hvis du vil kvantifisere beinvolumet fra 3D-gjengivelsen, åpner du BoneJ-plugin-modulen og velger Volumfraksjon. Et resultatvindu vises og beinvolumet vises i millimeter cubed.Hvis du vil kvantifisere beinlengden fra 3D-gjengivelsen, bruker du ImageJ multipunktsverktøyet. Hvis du vil ta et bilde av 3D-gjengivelsen, klikker du Vis og tar et øyeblikksbilde. Lagre deretter bildet som en TIF- eller JPEG-fil.I disse bildene ble deler av en voksen mus som regenererer P3-siffer immunostet med antistoffer for å visualisere intramembranøs beinregenerering og blastemadannelse på dag seks til syv, ni og 10 etter amputasjon. Her vises representative mikro-CT-gjengivelser av sifre som ble skannet før amputasjon og på ulike tidspunkter i løpet av regenerering med landemerker som brukes til å identifisere lengdemålinger. Musesiffermodellen er et kraftig system for å analysere et pro-regenerativt sårmiljø som utløser blastemadannelse når det amputeres på et distalt nivå.Omvendt fungerer proksimal amputasjon av sifrene som et modellsystem for å undersøke regenerativ svikt, samt et nettsted for teststrategier for å forbedre regenerering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Sebrafisk av Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Taps og Gain-of-funksjon tilnærming for å undersøke Tidlig Cell Fate Determinanter i Før implantasjon Mouse Embryoer

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetisk konvertering som en trygg og enkel metode for å skaffe insulin-sekresjon celler fra voksne hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Bygge Finite Element Modeller for å etterforske sebrafisk Jaw Biomekanikk

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Culture of Murine embryonale metatarsals: en fysiologisk modell av endochondral Forbening

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av larver sebrafisk som et dyr-modellen for å undersøke Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserte Osteoclast kultur analysen av musen benmarg å undersøke rollen som mTORC1 i Osteoclast-formasjonen

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Kjemiske amputasjon og regenerering av Pharynx i Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Delvis Lobular Hepatectomy: En kirurgisk modell for morfologiske leveren gjenfødelse

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En forenklet og effektiv metode å isolere primære menneskelige keratinocytter fra voksen hud vev

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...