Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Agradecemos aos membros do laboratório Muneoka e do Instituto Texas de Medicina Genômica (TIGM). Este trabalho foi apoiado pelo Texas A & M University.

Todo o uso e técnicas de animais estavam em conformidade com os procedimentos operacionais padrão do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Texas A & M.
1. amputação do distal P3 do membro adulto do mouse traseiro
<ol><li>Anestesie um mouse CD-1 de 8 a 12 semanas (tabela de materiais) usando gás isoflurano em oxigênio; inicialmente anestesiados a 3% em uma câmara, seguido de 2% de isoflurano fornecido por uma nosecona durante o período ...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Este protocolo descreve um procedimento padronizado da amputação P3 longe do ponto de origem do rato adulto, mancha immunohistochemical fluorescente para visualizar e investigar a formação do blastema e a ossificação intramembranosos, e a exploração sequencial in vivo do μct a identificar alterações morfológicas ósseas, volume e comprimento pós-amputação. A amputação P3 é um modelo único, proceduralmente simples e reprodutível para analisar um ambiente pró-regenerativo da ferida que desencadeia a fo...

Os mamíferos, incluindo humanos e camundongos, têm a capacidade de regenerar as pontas de seus dígitos após a amputação distal da falange terminal (P3) 1,2,3. Em camundongos, a resposta de regeneração é dependente do nível de amputação; As amputações cada vez mais proximal do dígito exibem uma resposta regenerativa progressivamente atenuada até a falha regenerativa completa em amputações que transecting e proximal à matriz de prego P34,5,6 , 7 anos de , 8. a regeneração P3 é mediada pela formação de um blastema, definido como uma população de células proliferantes que passam por morfogênese para regenerar as estruturas amputadas9. A formação de um blastema para regenerar as estruturas perdidas pela amputação, um processo denominado regeneração epimórfica, distingue a resposta de regeneração P3 de nível multitecidual do reparo tecidual tradicional após a lesão6, 10. a regeneração P3 é um modelo reprodutível e proceduralmente simples para investigar processos regenerativos complexos, incluindo cicatrização de feridas11,12, histólise11,12, revascularização13, regeneração periférica14do nervo, e conversão de blastemal ao osso através da ossificação intramembranosos15.
Estudos prévios com imunohistoquímica demonstraram que o blastema é heterogêneo, avascular, hipóxico e altamente proliferativo11,13,15,16. Após a amputação distal do P3, o blastema precoce é inicialmente associado ao periósteo P3 e ao endoesteto e caracteriza-se por proliferação robusta e osteogênese nascente adjacente à superfície óssea15. Subseqüente à degradação do osso e ao fechamento da ferida, o blastema heterogêneo é dado forma pela fusão de pilhas periosteal e endoroubo-associadas, seguidas pela diferenciação de componentes blastemal que incluem o osso através da ossificação intramembranosos quinze anos.
O reparo ósseo em resposta à lesão ocorre tipicamente pela ossificação endocondral, ou seja, por meio de um calo cartilaginoso inicial que forma um modelo de formação óssea subseqüente17,18. A ossificação intramembranosos do osso longo, isto é, formação do osso sem um intermediário cartilaginoso, é induzida geralmente usando dispositivos complexos da distracção ou a fixação cirúrgica19,20. A resposta de regeneração de dígitos é um modelo pré-clínico que oferece vantagens sobre os modelos de ossificação intramembranosa convencional: 1) não requer lesão pós-fixação externa ou interna para estimular a ossificação intramembranosa, 2) é realizada com 4 dígitos de cada animal, maximizando as amostras e minimizando o uso de animais, e 3) a análise sequencial in vivo do tomography microcomputado (μCT) pode ser executada com facilidade e velocidade.
No presente estudo, mostramos o plano de amputação P3 padronizado para obter uma resposta de regeneração reprodutível e robusta. Adicionalmente, Nós demonstramos um protocolo aperfeiçoado da imunohistoquímica da fluorescência usando seções da parafina para visualizar a formação do blastema, o revascularização no contexto da regeneração, e a conversão blastemal ao osso através de intramembranosos Ossificação. Também demonstramos o uso de μCT in vivo sequencial para identificar alterações na morfologia óssea, volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. O objetivo deste protocolo é investigar a formação de blastema de mamíferos após a amputação e demonstrar 2 técnicas, imunohistoquímica de fluorescência e μCT in vivo sequencial, para o estudo da regeneração óssea intramembranosa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal distal do falange (P3) do rato adulto, um modelo mamífero processualmente simples e reprodutível da regeneração epimórfica, que envolve a formação do blastema e a ossificação intramembranosos analisadas por Immunohistochemistry da fluorescência e tomography microcomputado in-vivo seqüencial (μCT). A regeneração dos mamíferos é restrita a amputações que transecting a região distal do terminal falange (P3); os dígitos amputados em uns níveis mais proximal não conseguem regenerar e submeter-se à cura fibrótica e à formação da cicatriz. A resposta de regeneração é mediada pela formação de um blastema proliferativo, seguido pela regeneração óssea via ossificação intramembranosa para restaurar o comprimento esquelético amputado. A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica em mamíferos, e é uma ferramenta poderosa para o projeto de estratégias terapêuticas substituir a cura fibrótica com uma resposta regenerativa bem sucedida. Nosso protocolo usa a imunohistoquímica de fluorescência para 1) identificar populações de células de blastema precoces, 2) revascularização do estudo no contexto da regeneração e 3) investigar a ossificação intramembranosa sem a necessidade de osso complexo dispositivos de estabilização. Também demonstramos o uso de μCT sequencial in vivo para criar imagens de alta resolução para examinar as alterações morfológicas após a amputação, bem como quantificar mudanças de volume e comprimento no mesmo dígito ao longo da regeneração. Nós acreditamos que este protocolo oferece a utilidade tremenda para investigar epimórfica e respostas regenerativa do tecido nos mamíferos.

O rato adulto que regenera os dígitos P3 em 6/7 DPA (Figura 2a-D), 9 DPA (Figura 2e-H), e 10 DPA (Figura 2i-L) foi immunomanchado com os anticorpos a Runx2, a OSX, e a PCNA para visualizar o osso intramembranosos regeneração, e immunomanchado com os anticorpos a CXCR4 e a fvw para visualizar a formação do blastema. Representações de μCT representativas de dígitos verificado...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Amputação e regeneração de dígitos adultos do mouse: um modelo simples para investigar a formação de blastema de mamíferos e a ossificação intramembranosa

Aqui, nós apresentamos um protocolo da amputação terminal adulta do falange do rato para investigar a formação mamífero do blastema e a ossificação intramembranosos, analisadas pelo immunohistochemistry fluorescente e pelo tomography microcomputado in-vivo seqüencial.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

A amputação P3 é um modelo pré-clínico para investigar a regeneração epimórfica dos mamíferos e uma poderosa ferramenta para identificar populações e mecanismos de células críticas que controlam a regeneração endógena. O modelo P3 permite a identificação de populações de células explosivas precoces e tardias, o estudo da revascularização durante a regeneração e a investigação da ossificação intramembrana sem requisitos complexos de dispositivo de estabilização óssea. Demonstrando o procedimento comigo estarão Osama Qureshi, Alyssa Falck, e Katherine Zimmel, técnica, e Regina Brunaeur, professora assistente de pesquisa do nosso laboratório.Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do dedo em um mouse CD-1 de oito a 12 semanas de idade, aplique pomada aos olhos do animal e coloque o mouse sob um microscópio de dissecção de 10X. Use iodo de povidona cirúrgica e 70% de etanol para esterilizar os dígitos de cada membro traseiro e usar microscisores para cortar os cabelos longe do local cirúrgico. Aplique um microliter de bupivacaína tópica localmente para anestesiar o local cirúrgico, e levemente jogar uma pata traseira para expor a superfície do dígito medial.Em seguida, segurando o bisturi em um ângulo paralelo à almofada de gordura, use um bisturi estéril número 10 para amputar a ponta distal da falange terminal de dígitos dois e quatro. Aplique um microliter adicional de bupivacaína localmente a cada dígito amputado e devolva o rato a uma gaiola limpa para permitir que as feridas se curem sem curativo de ferida e com monitoramento até a recumbência total. Para assegurar um plano de amputação P3 bem sucedido, segure o bisturi paralelo à almofada de gordura durante a amputação e realize a varredura micro-CT para confirmar o comprimento correto da amputação.No ponto final experimental apropriado, use um bisturi para cortar o dígito no meio do osso da falange média aproximadamente no segundo recuo da almofada de gordura ventral. Transfira o tecido para um frasco de cintilação de 20 mililitros contendo 10 mililitros de formalina de zinco tamponada fresca fixativa por 24 a 48 horas. E use um microtome para adquirir seções de quatro a cinco micrômetros de espessura de cada dígito, colocando as fatias em um banho de água de 38 a 41 graus Celsius complementado com uma solução adesiva histológica à medida que são obtidas.Em seguida, capture as fatias em slides adesivos e coloque os slides em um aquecedor de slides Celsius de 37 graus para secar. Quando os slides tiverem sido desparafinados, mergulhe as amostras em um frasco de coloração de uma solução de recuperação de antígeno apropriada, e aqueça os slides a 95 graus Celsius por 25 minutos, certificando-se de que a ebulição não ocorra. No final da incubação, permita que o frasco chegue à temperatura ambiente, e coloque os slides em uma caixa de slides de plástico coberta de uma polegada com papel de tecido umedecido na base.Adicione 100 microliters de proteínas pré-armadase K a cada amostra. Cubra cada slide com uma pequena faixa de parafilm para garantir que as seções não fiquem secas. Após 12 minutos a 37 graus Celsius, remova cuidadosamente o filme de parafina e drene suavemente as lâminas em papel de tecido para remover o excesso de solução de bloqueio.Em seguida, adicione 100 a 200 microliters da solução de anticorpos primária de interesse a cada slide. Devolva os locais à câmara umidificante coberta com filme de parafina para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, depois de lavar os slides em soro fisiológico tamponado tris mais etiqueta TWEEN ou TBST os slides com uma solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de 45 minutos à temperatura ambiente protegido da luz.No final da incubação, lave os slides em TBST e deixe-os secar. Em seguida, use 100 microliters de meio de montagem anti-fade para colocar cuidadosamente as tampas nos slides secos e armazenar os slides plano à temperatura ambiente durante a noite protegidos da luz para permitir que o meio de montagem seque. Para a tomografia microcomputante in vivo ou micro-CT, o microcsor com tubos para permitir o fluxo de oxigênio dentro e fora da câmara animal micro-CT, certificando-se de que o oxigênio de saída está equipado com um filtro de carvão ativado para prender o isoflurane.Defina o Voxelsize para 10,5 micrômetros a 55 quilovoltage de pico e 145 microamps com 1.000 projeções por 180 graus e rotação contínua com um Tempo de Integração de 200 milissegundos, resultando em um máximo de 213 fatias por varredura. Quando o scanner estiver pronto, coloque suavemente o rato anestesiado na câmara animal micro-CT com os dígitos do membro traseiro dispostos em lado ventral de associação plana e próxima para cima com a pata esquerda no lado esquerdo e a direita no lado direito da plataforma de varredura. Em seguida, aplique fita cirúrgica para fixar suavemente os dígitos no lugar.Aplique pomada oftálmica aos olhos do animal antes de iniciar o exame. Após a varredura, devolva o animal a uma gaiola limpa com monitoramento até a recumbência total, e permita até várias horas para reconstrução de imagens microcS. Para análise da imagem óssea 3D reconstruída, usando o software fornecido com o micro-CT, converta os arquivos de imagem em uma série de arquivos DICOM.Quando todos os arquivos tiverem sido convertidos, baixe a série DICOM em uma única pasta usando um downloader de arquivos em lote em um navegador da Web. Carregue o plug-in BoneJ na pasta plug-in ImageJ. Arraste e solte a pasta da série de arquivos DICOM na barra ImageJ para abrir os arquivos.Uma pilha de imagens de 16 bits exibindo todos os valores cinzentos será aberta. Para exibir somente osso, clique em Ajustar e Limiar de imagem. Deslize a barra superior para a extrema direita e ajuste a barra inferior até que apenas o osso seja destacado vermelho.O menor valor de limiar será de aproximadamente 10.000 a 13.000 a uma intensidade máxima de sinal de 32.767. Clique em Aplicar e na nova caixa de diálogo, clique em Plano de Fundo Preto. Em seguida, clique em OK. Uma imagem de oito bits exibindo valores em preto e branco será gerada.Com o branco correspondente ao osso. Desenhe um retângulo ao redor do osso P3 para selecioná-lo e duplicar a pilha. Para gerar uma imagem 3D, clique em Plugins e 3D Viewer e use a ferramenta de seleção à mão livre para circular o osso a ser excluído.Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Preencher a seleção para cortar qualquer osso desnecessário da imagem. Para quantificar o volume ósseo da renderização 3D, abra o plug-in BoneJ e selecione a Fração de Volume. Uma janela de resultados aparecerá e o volume ósseo exibido em milímetros cúbicos.Para quantificar o comprimento do osso da renderização 3D, use a ferramenta ImageJ multipoint. Para capturar uma imagem da renderização 3D, clique em Exibir e tirar uma foto. Em seguida, salve a imagem como um arquivo TIF ou JPEG.Nestas imagens, seções de um rato adulto regenerando dígito P3 foram imunossuídas com anticorpos para visualizar a regeneração óssea intramembrana e a formação de blastema nos dias seis a sete, nove e 10 pós-amputação. Aqui, são mostradas renderizações representativas de microcsps de dígitos digitalizados antes da amputação e em vários pontos de tempo ao longo da regeneração com marcos utilizados para identificar medidas de comprimento. O modelo de dígito do rato é um sistema poderoso para analisar um ambiente de ferida pró-regenerativa que desencadeia a formação de blastema quando amputado a um nível distal.Por outro lado, a amputação proximal dos dígitos serve como um sistema modelo para investigar a falha regenerativa, bem como um local para testar estratégias para melhorar a regeneração.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Conversão epigenética como um método seguro e simples para obter células secretoras de insulina a partir de fibroblastos da pele de adultos

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Cultura de murino embrionárias Metatarsos: Um modelo fisiológico de Endocondral ossificação

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Estabelecimento de Zebrafish Larval como um modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidade In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Hepatectomy parcial de Lobular: Um modelo cirúrgico para regeneração hepática morfológica

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Um método simplificado e eficiente para isolar os queratinócitos humanos primários do tecido da pele de adultos

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...