Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Мы благодарим членов лаборатории Muneoka и Техасского института геномной медицины (TIGM). Эта работа была поддержана Техасским университетом А И М.

Все виды использования и методы использования животных соответствовали стандартным оперативным процедурам Институционального комитета по уходу за животными и использованию Техасского университета.
1. Взрослая мышь Хинд Лимб Дисталь P3 Ампутация
<ol><li>Анестезия от 8 до 1...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Этот протокол описывает стандартизированную процедуру взрослой мыши дистальной ампутации P3, флуоресцентное иммуногистохимическое окрашивание для визуализации и исследования образования бластемы и интраимбранной окостенения, а также последовательное сканирование in-vivo определить ?...

Млекопитающие, в том числе люди и мыши, имеют возможность регенерировать кончики своих цифр после дистальной ампутации терминальной фаланги (P3)1,2,3. У мышей реакция регенерации зависит от уровня ампутации; все более проксимальной ампутации цифрототвают постепенно ослабленный регенеративный ответ до полного регенеративного отказа при ампутации трансэктинга и проксимальной к матрице ногтей P34,5,6 , 7 (г. , 8. Регенерация P3 опосредована образованием бластемы, определяемой как популяция размножающихсяклеток, которые проходят морфогенез для регенерации ампутированных структур 9. Формирование бластемы для регенерации структур, потерянных в результате ампутации, процесс, называемый эпиморфной регенерации, отличает многотканьья уровня P3 регенерации ответ от традиционного восстановления тканей после травмы6, 10. Регенерация P3 является воспроизводимой и процедурно простой моделью для исследования сложных регенеративных процессов, включая заживление ран11,12,гистолиза костей11,12, реваскуляризации13, периферической регенерации нерва14, и бластремальной преобразования в кости через интраимбранную окостенение15.
Предыдущие исследования с использованием иммуногистохимии показали, что бластема неоднородна, аваскулярная, гипоксическая и высоко размножается11,13,15,16. После дистальной ампутации P3, ранняя бластема первоначально связана с периостеем P3 и эндостерией и характеризуется устойчивым распространением и зарождающимся остеогенезом, примыкающим к костной поверхности15. После деградации костей и замыкания раны, неоднородная бластема формируется в результате слияния периохальных и эндостел-ассоциированных клеток, за которыми следует дифференциация бластремальных компонентов, включая кости через интраимбранное окосоединение 15.
Ремонт костей в ответ на травму обычно происходит путем эндохондральной околения, т.е. через первоначальный хрящевой каллуса, который образует шаблон для последующего формирования костей17,18. Длинная косточка интраимбранной оковласти, т.е. формирование костей без хрящевого промежуточного, обычно индуцируется с помощью сложных отвлекающих устройств или хирургической фиксации19,20. Цифра регенерации ответ является доклинической моделью, которая предлагает преимущества по сравнению с обычными интраимбранной окотопительных моделей: 1) он не требует внешней или внутренней фиксации после травмы, чтобы стимулировать интраимбранной оковласти, 2) это выполняется с использованием 4 цифр от каждого животного, тем самым максимизируя образцы при минимизации использования животных, и 3) последовательный анализ микрокомпьютерной томографии in vivo (ККТ) может быть выполнен с легкостью и скоростью.
В настоящем исследовании мы показываем стандартизированную плоскость ампутации P3 для достижения воспроизводимой и надежной реакции регенерации. Кроме того, мы демонстрируем оптимизированный протокол иммуногистохимии флуоресценции с использованием парафиновых секций для визуализации образования бластемы, реваскуляризации в контексте регенерации и бластремального преобразования в кости через интраимбранные опрокидолизм. Мы также демонстрируем использование последовательного in-vivo зКТ для выявления изменений в морфологии костей, объеме и длине в одной и той же цифре в течение регенерации. Целью этого протокола является исследование образования бластеммлекопитающих после ампутации и демонстрация 2 методов, флуоресценции иммуногистохимии и последовательной in vivo зКТ, для изучения интраимбранной регенерации костей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Здесь мы представляем протокол взрослой мыши дистальной терминальной фаланги (P3) ампутации, процедурно простой и воспроизводимой модели эпиморфной регенерации, которая включает в себя формирование бластемы и интраимбранное окосяждение, проанализированные флуоресценция иммуногистохимия и последовательная микрокомпьютерная томография in-vivo (ККТ). Регенерация млекопитающих ограничивается ампутациями, трансектирующие дистальную область терминальной фаланги (P3); цифры, ампутированные на более проксимальных уровнях, не могут регенерировать и проходят фиброзное заживление и образование рубцов. Реакция регенерации опосредована образованием пролиферативной бластемы, а затем регенерацией костей через интраимбранную окостенение для восстановления ампутированной скелетной длины. Ампутация P3 является доклинической моделью для исследования эпиморфной регенерации у млекопитающих, и является мощным инструментом для разработки терапевтических стратегий для замены фиброзного исцеления с успешной регенеративной реакции. Наш протокол использует флуоресценцию иммуногистохимии 1) определить ранне-поздние популяции бластемных клеток, 2) исследование реваскуляризации в контексте регенерации, и 3) исследовать интраммбранную окостенение без необходимости сложной кости стабилизационные устройства. Мы также демонстрируем использование последовательного in vivo зКТ для создания изображений с высоким разрешением для изучения морфологических изменений после ампутации, а также количественной оценки изменений объема и длины одной и той же цифры в ходе регенерации. Мы считаем, что этот протокол предлагает огромную полезность для исследования как эпиморфных, так и регенеративных реакций тканей у млекопитающих.

Взрослая мышь регенерирующих P3 цифры на 6/7 DPA(Рисунок 2A-D), 9 DPA (Рисунок2E-H), и 10 DPA (Рисунок 2I-L) были иммуноокрашены антителами к Runx2, OSX, и PCNA для визуализации интрамбранной кости регенерации, и иммуноокрашенные анти?...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Взрослая мышь Digit Ампутации и регенерации: Простая модель для расследования формирования млекопитающих Blastema и интрамембранной оссификации

Здесь мы представляем протокол ампутации фаланги терминала для взрослых мышей для исследования образования бластемы млекопитающих и интрамембранной окостенации, анализируемый флуоресцентной иммуногистохимией и последовательной микрокомпьютерной томографией in-vivo.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Ампутация P3 является доклинковой моделью для изучения эпиморфической регенерации млекопитающих и мощным инструментом для выявления критически важных популяций клеток и механизмов, которые контролируют эндогенную регенерацию. Модель P3 позволяет идентифицировать ранние и поздние популяции бластемальных клеток, изучение реваскуляризации во время регенерации, а также исследование внутримембранного околения без сложных требований к устройству стабилизации костей. Демонстрация процедуры со мной будет Усама Куреши, Алисса Фальк, и Кэтрин Зиммель, техник, и Регина Brunaeur, доцент-исследователь все из нашей лаборатории.После подтверждения отсутствия реакции на щепотку ноша в восемь-12-недельный CD-1 мыши, Нанесите мазь на глаза животного и поместите мышь под 10X микроскопом вскрытия. Используйте хирургический йод повидоне и 70% этанола для стерилизации цифр каждой задней конечности и использовать микросхемы для обрезки волос от хирургического участка. Нанесите один микролитер актуальных bupivacaine локально для анестезии хирургического сайта, и осторожно splay одну заднюю лапу, чтобы разоблачить медиальной поверхности цифры.Затем, держа скальпель под углом, параллельным жировой прокладке, используйте стерильный скальпель номер 10, чтобы ампутировать дистальный кончик терминальной фаланги цифр два и четыре. Нанесите один дополнительный микролитер бупивакаина локально на каждую ампутированную цифру и верните мышь в чистую клетку, чтобы раны зажили без раневой повязки и с контролем до полного уценки. Чтобы обеспечить успешную плоскость ампутации P3, удерживайте скальпель параллельно жировой прокладке во время ампутации и выполняя микро-КТ сканирование, чтобы подтвердить правильную длину ампутации.В соответствующей экспериментальной конечной точке используйте скальпель, чтобы разорвать цифру на полпути через среднюю фаланговую кость примерно на втором отступе брюшной жировой прокладки. Передача ткани в 20-миллилитровый сцинтилляционный флакон, содержащий 10 миллилитров свежей буферной фиксации формалина цинка в течение 24 до 48 часов. И использовать микротому, чтобы приобрести от четырех до пяти микрометров толщиной разделов каждой цифры, размещение ломтиков в 38 до 41 градусов по Цельсию водяной бани дополняется гистологическим клеевым раствором, как они получены.Затем захватить ломтики на клеевых слайдов и место слайды на 37-градусный слайд по Цельсию теплее, чтобы высохнуть. Когда слайды были deparaffinized погрузить образцы в окрашивание банку соответствующего раствора поиска антигена, и тепло слайды до 95 градусов по Цельсию в течение 25 минут убедившись, что кипение не происходит. В конце инкубации, позвольте банку прийти к комнатной температуре, и заложить слайды плоские в один дюйм глубоко покрыты пластиковый слайд-бокс с увлажненной бумагой ткани у основания.Добавьте в каждый образец 100 микролитров довоенной протеиназы K. Обложка каждого слайда с небольшой полосой парафильма, чтобы обеспечить разделы не становятся сухими. Через 12 минут при 37 градусах по Цельсию осторожно удалите парафиновую пленку и аккуратно слейте горки на бумаге, чтобы удалить избыток блокирующего раствора.Затем добавьте к каждому слайду от 100 до 200 микролитров первичного раствора антител, представляющих интерес. Верните участки в увлажняющую камеру, покрытую парафиновой пленкой, для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро после мытья слайдов в TRIS-буферный солевой плюс TWEEN или TBST этикетки слайды с соответствующим вторичным раствором антител для 45-минутной инкубации при комнатной температуре защищены от света.В конце инкубации промыть горки в TBST и дать им высохнуть. Затем используйте 100 микролитров анти-fade монтажа среды тщательно место coverslips на сушеные горки и хранить слайды плоские при комнатной температуре ночь защищены от света, чтобы монтаж среды сухой. Для последовательной микро-компьютерной томографии in vivo или микро-КТ оснащение микро-CT-изображения с трубкой, чтобы поток кислорода в и из микро-КТ животной камеры, убедившись, что отток кислорода оснащен активированным фильтром древесного угля, чтобы поймать изофлюран.Установите Voxelsize до 10,5 микрометров на 55 пиковых килоэлектрограмм и 145 микроампер с 1000 проекций на 180 градусов и непрерывное вращение с интеграционным временем 200 миллисекунд, в результате чего максимум 213 ломтиков на сканирование. Когда сканер будет готов, аккуратно поместите анестезированной мыши в микро-КТ животной камеры с задними конечностями цифры расположены в плоской, тесной ассоциации брюшной стороне вверх с левой лапой на левой стороне и правой на правой стороне сканирующей платформы. Затем нанесите хирургическую ленту, чтобы мягко закрепить цифры на месте.Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного перед началом сканирования. После сканирования, вернуть животное в чистую клетку с мониторингом до полной лежачих, и позволяют до нескольких часов для микро-КТ реконструкции изображения. Для анализа реконструированного 3D-изображения кости с помощью программного обеспечения, предоставляемого микро-CT, преобразуете файлы изображений в ряд файлов DICOM.Когда все файлы были преобразованы, загрузите серию DICOM в одну папку с помощью загрузщика пакетных файлов в веб-браузере. Загрузите плагин BoneJ в папку плагина ImageJ. Перетащите папку серии файлов DICOM в бар ImageJ, чтобы открыть файлы.Будет открыт 16-битный стек изображений, отображающий все серые значения. Чтобы отобразить только кость, нажмите На кнопку «Отрегулировать изображение» и «Порог». Сдвиньте верхнюю планку порога в крайнем правом направлении и отрегулируйте нижнюю планку порога до тех пор, пока только кость не будет выделена красным цветом.Нижнее пороговое значение составит от 10 000 до 13 000 при максимальной интенсивности сигнала 32 767. Нажмите Применить и в новом диалоговом поле, нажмите Черный фон. Далее щелкните OK. Будет создано восьмибелое изображение, отображая черно-белые значения.С белым, соответствующим кости. Нарисуйте прямоугольник вокруг кости P3, чтобы выбрать его и дублировать стек. Чтобы создать 3D-изображение, нажмите Plugins и 3D Viewer и используйте инструмент выбора от руки, чтобы обвести кость, чтобы быть удалены.Затем нажмите правой кнопкой мыши и выберите выбор заполнения, чтобы обрезать любую ненужную кость из изображения. Для количественной оценки объема кости от 3D-рендеринга откройте плагин BoneJ и выберите фракцию объема. Появится окно результатов и объем кости отображается в миллиметрах куб.Для количественной оценки длины кости от 3D-рендеринга используйте многоапунктный инструмент ImageJ. Чтобы запечатлеть изображение 3D-рендеринга, нажмите View и сделайте снимок. Затем сохраните изображение в виде файла TIF или JPEG.На этих снимках разделы взрослой мыши, регенерирующей цифру P3, были иммунотелены антителами для визуализации внутримембранной регенерации костей и формирования бластемы в день 6-7, 9 и 10 после ампутации. Здесь показаны репрезентативные микроКТ-рендеры цифр, отсканированных до ампутации и в различные моменты времени в течение регенерации с ориентирами, используемыми для определения измерений длины. Модель мышиная цифра является мощной системой для анализа про-регенеративной среды раны, которая вызывает образование бластеремы при ампутации на дистального уровня.И наоборот, проксимальная ампутация цифр служит модельной системой для расследования регенеративных сбоев, а также площадкой для тестирования стратегий повышения регенерации.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Почки Регенерация у взрослых данио рерио по гентамицина поражении

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Построение конечно-элементных моделей по расследованию данио рерио Щековые биомеханики

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Культура мышиных эмбриональных плюсны: физиологическую модель Эндохондральный окостенение

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Создание личиночной данио рерио как модель животного к расследованию Trypanosoma cruzi подвижности In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Химические ампутации и регенерации глотки в Планарии Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Частичной гепатектомии лобулярного: Хирургические модель для морфологической регенерации печени

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Упрощенная и эффективный метод для изоляции первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожной ткани

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...