Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Vi tackar medlemmar i Muneoka Lab och Texas Institute for genomisk medicin (TIGM). Detta arbete stöddes av Texas A & M University.

Alla djuranvändning och tekniker var i överensstämmelse med standardrutiner för den institutionella djuromsorg och användning kommittén för Texas A & M University.
1. Adult mus bakbenen distala P3 amputation
<ol><li>Anesthetize en 8 till 12 vecka gammal CD-1 mus (tabell över material) med isofluran gas i syre; initialt söva på 3% i en kammare, följt av 2% isofluran levereras av en noskon under varaktigheten av operationen. Applicera oftalmisk salva på ögonen fö...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Detta protokoll beskriver ett standardiserat förfarande för vuxna mus distala P3 amputation, fluorescerande immunohistokemisk färgning för att visualisera och undersöka embryon bildning och intramembranös ossification, och sekventiell in vivo μct skanning till identifiera ben morfologiska, volym och längdförändringar efter amputation. P3 amputation är en unik, processuellt enkel och reproducerbar modell för att analysera en proregenerativ sårmiljö som utlöser embryon-bildning. Dessutom erbjuder den P3-siff...

Däggdjur, inklusive människor och möss, har kapacitet att regenerera tips av sina siffror efter distala amputation av terminalen falangen (P3)1,2,3. I möss är regenereringssvaret amputation-nivå-beroende; alltmer proximala amputationer visar ett progressivt försvagat regenerativt svar tills fullständig regenerativ svikt vid amputationer transekera och proximalt till P3-Nagel matrisen4,5,6 , 7 , 8. P3 Regeneration medieras av bildandet av en BLASTEMA, definierad som en population av prolifererande celler som genomgår morfogenes för att återskapa de amputerade strukturerna9. Bildandet av en embryon att regenerera strukturer förlorade genom amputation, en process som kallas epimorfiska förnyelse, skiljer multi-vävnad-nivå P3 förnyelse svar från traditionell vävnad reparation efter skada6, 10. P3 regeneration är en reproducerbar och processuellt enkel modell för att undersöka komplexa regenerativa processer inklusive sårläkning11,12, ben histolys11,12, revaskularisering13, perifer nervregeneration14, och blastemal omvandling till ben via intramembranös ossifikation15.
Tidigare studier med immunohistokemi har visat att embryon är heterogena, avaskulära, hypoxiska, och mycket proliferativ11,13,15,16. Efter den distala P3-amputation associeras tidigt embryon initialt med P3 periostet och endosteum och kännetecknas av robust proliferation och begynnande osteogenes i anslutning till ben ytan15. Efter bennedbrytning och sår stängning bildas den heterogena embryon genom sammanslagning av periostal och endosteal-associerade celler, följt av differentiering av blastemal komponenter inklusive ben via intramembranös ossifikation 15.
Ben reparation som svar på skada uppstår vanligen genom endochondral benbildning, dvs via en initial brosk förhårdnader som bildar en mall för efterföljande benbildning17,18. Långa ben intramembranös ossifikation, dvs benbildning utan en brosk intermediär, är vanligen induceras med hjälp av komplexa distraktion enheter eller kirurgisk fixering19,20. Siffran regenereringsrespons är en preklinisk modell som erbjuder fördelar jämfört med konventionella intramembranösa benbildning modeller: 1) det kräver inte yttre eller inre fixering efter skada för att stimulera intramembranös benbildning, 2) det är utförs med 4 siffror från varje djur, vilket maximerar prover samtidigt minimera djuranvändning, och 3) sekventiell in vivo mikrodatortomografi (μCT) analys kan utföras med lätthet och hastighet.
I den nuvarande studien visar vi det standardiserade P3-amputation-planet för att uppnå ett reproducerbart och robust regenereringssvar. Dessutom, vi visar en optimerad fluorescens immunohistokemi protokoll med paraffin sektioner för att visualisera embryon bildning, revaskularisering i samband med förnyelse, och blastemal omvandling till ben via Intramembranous Förbening. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att identifiera förändringar i ben morfologi, volym och längd i samma siffra under regenereringen. Målet med detta protokoll är att undersöka bildandet av embryon från däggdjur efter amputation och att demonstrera 2 tekniker, fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo μct, för studiet av intramembranös ben förnyelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Här presenterar vi ett protokoll för vuxna mus distala Terminal phalanx (P3) amputation, en processuellt enkel och reproducerbar däggdjurs modell av epimorfiska förnyelse, vilket innebär embryon bildning och intramembranös benbildning analyseras av fluorescensimmunohistokemi och sekventiell in vivo-mikrodatortomografi (μCT). Föryngring av däggdjur är begränsad till amputationer som transekera distala regionen av terminalen falangen (P3); siffror amputerade vid mer proximala nivåer misslyckas med att regenerera och genomgå fibrotisk läkning och ärrbildning. Regenereringsrespons förmedlas genom bildandet av en proliferativ BLASTEMA, följt av ben förnyelse via intramembranös ossifiering för att återställa amputerad skelett längd. P3 amputation är en preklinisk modell för att undersöka epimorfiska regenerering hos däggdjur, och är ett kraftfullt verktyg för utformningen av terapeutiska strategier för att ersätta fibrotisk läkning med en lyckad regenerativ respons. Vårt protokoll använder fluorescensimmunohistokemi till 1) identifiera tidiga och sena embryon cellpopulationer, 2) studie revaskularisering i samband med förnyelse, och 3) undersöka intramembranös ossifikation utan behov av komplexa ben stabiliseringsanordningar. Vi visar också användningen av sekventiell in vivo μCT för att skapa högupplösta bilder för att undersöka morfologiska förändringar efter amputation, samt kvantifiera volym och längdförändringar i samma siffra under loppet av förnyelse. Vi tror att detta protokoll erbjuder enorma verktyg för att undersöka både epimorfiska och vävnad regenerativ svar hos däggdjur.

Vuxna mus regenerering P3 siffror på 6/7 DPA (figur 2A-D), 9 DPA (figur 2e-H) och 10 DPA (figur 2i-L) var immunostained med antikroppar mot Runx2, OSX, och PCna att visualisera intramembranösa ben och immunfärgade med antikroppar mot CXCR4 och VWF för att visualisera embryon-bildningen. Representativa μCT-tolkningar av siffror som skannats före amputation och vid olika tidpunk...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Vuxen mus siffra amputation och regenerering: en enkel modell för att undersöka bildandet av BLASTEMA hos däggdjur och Intramembranös ossifiering

Här presenterar vi ett protokoll för Adult Mouse Terminal phalanx amputation för att undersöka däggdjur embryon formation och intramembranös ossification, analyseras med fluorescerande immunohistokemi och sekventiell in-vivo mikrodatortomografi.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 amputation är en preklinisk modell för att undersöka däggdjurseporfaft regenerering och ett kraftfullt verktyg för att identifiera kritiska cellpopulationer och mekanismer som styr endogen regenerering. P3-modellen möjliggör identifiering av tidiga och sena blastemal cell populationer, studiet av revascularization under regenerering, och undersökningen av intramembranous benbildning utan komplexa ben stabilisering enhet krav. Demonstrera förfarandet med mig kommer att Osama Qureshi, Alyssa Falck, och Katherine Zimmel, tekniker, och Regina Brunaeur, en forskarassistent professor alla från vårt laboratorium.Efter att ha bekräftat en brist på svar på tå nypa i en åtta till 12 veckor gamla CD-1 mus, Applicera salva på djurets ögon och placera musen under en 10X dissektion mikroskop. Använd kirurgiska povidone jod och 70%etanol för att sterilisera siffrorna i varje bakben och använda microscissors för att trimma hår bort från operationsområdet. Applicera en mikroliter av aktuell bupivakain lokalt för att bedöva operationsområdet, och splay försiktigt en baktass för att exponera den mediala siffran ytan.Håll sedan skalpell i en vinkel parallellt med fett pad, använd ett sterilt nummer 10 skalpell för att amputera den distala spetsen av terminalen falangen av siffror två och fyra. Applicera ytterligare en mikroliter bupivakain lokalt på varje amputerad siffra och återföra musen till en ren bur för att låta såren läka utan sårförband och med övervakning tills full recumbency. För att försäkra en framgångsrik P3 amputation plan, håll skalpell parallellt med fett pad under amputationen och utföra mikro-CT skanning för att bekräfta rätt amputation längd.Vid lämplig experimentell endpoint, använd en skalpell för att bryta siffran halvvägs genom mitten falangbenet vid ungefär den andra ventrala fett pad indrag. Överför vävnaden till en 20-milliliter scintillationsflaska som innehåller 10 milliliter färsk buffrad zink formalin fixeringsmedel i 24 till 48 timmar. Och använd en mikrotom för att förvärva fyra till fem mikrometer tjocka sektioner av varje siffra, placera skivorna i en 38 till 41 grader Celsius vattenbad kompletteras med en histologisk limlösning som de erhålls.Fånga sedan skivorna på självhäftande diabilder och placera bilderna på en 37-graders Celsius diavärmare för att torka. När objektglasen har avparaffiniserats sänk ner proverna i en färgningsburk av en lämplig antigenhämtningslösning, och värm objektglasen till 95 grader Celsius i 25 minuter och se till att kokning inte sker. I slutet av inkubationen, låt burken komma till rumstemperatur, och lägg bilderna platt i en en tum djup täckt plast slide box med fuktad mjukpapper vid basen.Tillsätt 100 mikroliter av förvärmda proteinas K till varje prov. Täck varje bild med en liten remsa av parafilm för att säkerställa att sektionerna inte blir torra. Efter 12 minuter vid 37 grader Celsius, försiktigt bort paraffin filmen, och försiktigt dränera bilderna på mjukpapper för att avlägsna överskott blockerande lösning.Därefter lägger du till 100 till 200 mikroliter av den primära antikroppslösningen av intresse för varje bild. Returnera platserna till den befuktande kammaren täckt med paraffinfilm för en övernattningsinkubation vid fyra grader Celsius. Nästa morgon efter tvättning av objektglasen i TRIS-buffrad saltlösning plus TWEEN- eller TBST-etikett på objektglasen med en lämplig sekundär antikroppslösning för en 45-minuters inkubation vid rumstemperatur skyddad från ljus.Vid slutet av inkubationen tvättar du objektglasen i TBST och låter dem torka. Använd sedan 100 mikroliter av anti-fade monteringsmedium för att försiktigt placera täcken på de torkade rutschbanorna och förvara rutschbanorna plant vid rumstemperatur över natten skyddad från ljus för att låta monteringsmediet torka. För sekventiell in vivo mikro-datortomografi eller mikro-CT outfit mikro-CT imager med slangar för att möjliggöra syre flöde in och ut ur mikro-CT djurkammaren, se till att utströmning syre är utrustad med ett aktivt kol filter för att fälla isofluran.Ställ in Voxelsize till 10,5 mikrometer vid 55 topp kilovoltage och 145 mikromuggar med 1, 000 prognoser per 180 grader och kontinuerlig rotation med en IntegrationStid på 200 millisekunder, vilket resulterar i högst 213 skivor per skanning. När skannern är klar, försiktigt placera den sövda musen i mikro-CT djur kammare med bakbenen siffror ordnade i plana, nära förening ventrala sidan upp med vänster tass på vänster sida och höger på höger sida av skanningsplattformen. Applicera sedan operationsband för att försiktigt säkra siffrorna på plats.Applicera oftalmisk salva på djurets ögon innan du påbörjar skanningen. Efter skanning, återvända djur till en ren bur med övervakning tills full recumbency, och tillåta upp till flera timmar för mikro-CT bild återuppbyggnad. För analys av den rekonstruerade 3D-benbilden, med hjälp av programvaran som medföljer mikro-CT, konvertera bildfilerna till en serie av DICOM-filer.När alla filer har konverterats hämtar du DICOM-serien i en enda mapp med hjälp av en kommandofilsladdare i en webbläsare. Ladda plugin-programmet BoneJ i plugin-mappen ImageJ. Dra och släpp mappen med DICOM-filserier i ImageJ-fältet för att öppna filerna.En 16-bitars bildstapel som visar alla de grå värdena kommer att öppnas. Om du vill visa enbart ben klickar du på Bildjustera och Tröskelvärde. Skjut det övre tröskelfältet längst till höger och justera det nedre tröskelstrecket tills endast benet är rödmarkerat.Det lägre tröskelvärdet kommer att vara ungefär 10, 000 till 13, 000 vid en maximal signalintensitet på 32, 767. Klicka på Använd och klicka på Svart bakgrund i den nya dialogrutan. Därefter klickar du på OK. En åtta-bitars bild som visar svartvita värden kommer att genereras.Med den vita som motsvarar ben. Rita en rektangel runt P3-benet för att markera den och duplicera stacken. För att generera en 3D-bild, klicka på Plugins och 3D Viewer och använda frihandsmarkeringsverktyget för att ringa in benet som ska tas bort.Högerklicka sedan och välj Fyllningsmarkering om du vill beskära eventuellt onödigt ben från bilden. Om du vill kvantifiera benvolymen från 3D-renderingen öppnar du plugin-programmet BoneJ och väljer Volymfraktion. Ett resultatfönster kommer att visas och benvolymen som visas i millimeter kubik.Om du vill kvantifiera benlängden från 3D-renderingen använder du multipunktverktyget ImageJ. Om du vill ta en bild av 3D-renderingen klickar du på Visa och tar en ögonblicksbild. Spara sedan bilden som en TIF- eller JPEG-fil.I dessa bilder delar av en vuxen mus regenererande P3 siffra var immunostained med antikroppar för att visualisera intramembranous ben regenerering och blastema bildandet på dag sex till sju, nio och 10 post-amputation. Här visas representativa mikro-CT-renderingar av siffror som skannats före amputation och vid olika tidpunkter under regenereringens gång med landmärken som används för att identifiera längdmätningar. Mussiffermodellen är ett kraftfullt system för att analysera en pro-regenerativ sårmiljö som utlöser blastemabildning när den amputeras på en distal nivå.Omvänt fungerar proximal amputation av siffrorna som ett modellsystem för att undersöka regenerativt fel samt en plats för testning av strategier för att förbättra regenereringen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Njure Regeneration i vuxen Zebrafish av Gentamicin inducerad skada

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Förlust- och Gain-of-funktionsansatsen att undersöka tidiga Cell Fate bestämmelse i preimplantatorisk musembryon

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Epigenetiska Konvertering som en säker och enkel metod för att få insulinfrisättande cellerna från sex hudfibroblaster

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Att bygga Finita Element Modeller för att undersöka Zebrafish Jaw biomekanik

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Odling av Murina embryonala fotbenen: En fysiologisk modell av endokondral benbildning

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av Larval zebrafiskar som ett djur-modell för att undersöka Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Kemiska Amputation och förnyelse i svalget i Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partiell lobulär Hepatectomy: En kirurgisk modell för Morphologic lever regenerering

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

En förenklad och effektiv metod att isolera primära mänskliga keratinocyter från vuxen hudvävnad

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...