Name: adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Biz Muneoka Lab ve Teksas genomik Tıp Enstitüsü (TıGM) üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Texas A & M Üniversitesi tarafından destekleniyordu.

Tüm hayvan kullanımı ve teknikleri, Texas A & M Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi 'nin standart çalışma prosedürlerine uygun olarak yapıldı.
1. yetişkin fare arka ekstremite distal P3 amputasyon
<ol><li>Anestezize bir 8 için 12 hafta-eski CD-1 fare (malzeme tablosu) oksijen Isoflurane gaz kullanarak; Başlangıçta bir odada% 3 ' te anesteziye, ardından ameliyat süresince bir burun konisi tarafından sağlanan% 2 isofluran. Anestezi al...

<ol>
	<li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children.">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li><li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children.">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li><li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes.">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li><li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phalangeal+regrowth+in+rodents:+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation.">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li><li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice.">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li><li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration.">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li><li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx.">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice.">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li><li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals.">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li><li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Regenerative Biology. , (2007).</li><li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice.">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li><li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+(Mus)+digit+regeneration.">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration.">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li><li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice.">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li><li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit.">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li><li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event.">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li><li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+science+of+fracture+healing.">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li><li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts.">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells &amp; Materials. 15, 53-76 (2008).</li><li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation.">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li><li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing.">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li><li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digit+Tip+Regeneration:+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine.">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDF-1alpha/CXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2.">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li><li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BoneJ:+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ.">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li></ol>

Bu protokol, Yetişkin fare distal P3 Amputasyonunun standartlaştırılmış bir prosedürünü, blastema oluşumunu ve Intramembranous ossifikasyonu görselleştirmek ve araştırmak için floresan immünhistokimyasal boya, ve sıralı in-vivo μct taramasını açıklar kemik morfolojik, hacim ve uzunluk değişiklikleri amputasyon sonrası tanımlayın. P3 amputasyonu, blastema oluşumunu tetikleyen bir rejeneratif yara ortamını analiz etmek için benzersiz, prosedüre basit ve tekrarlanabilir bir modeldir. Ayrıca...

İnsanlar ve fareler de dahil olmak üzere memeliler, Terminal falanks (P3)1,2,3distal amputasyon sonra rakamlarının ipuçlarını yeniden oluşturmak için kapasitesine sahip. Farelerde, rejenerasyon tepkisi amputation düzeyine bağlıdır; giderek proksimal basamaklı amputasyonlar, P3 çivi matrisine geçiş ve proksimal Amputasyonların tam rejeneratif yetmezliği4,5,6 ' ya kadar aşamalı olarak zayıflatılmış rejeneratif tepkisi görüntüler , 7 , 8. P3 rejenerasyon bacağı yapıları yeniden oluşturmak için morfojenler oluşan Proliferasyona hücrelerin bir nüfus olarak tanımlanan bir blastema oluşumu ile arabulmalı9. Amputasyon ile kayıp yapıları yeniden oluşturmak için bir blastema oluşumu, bir süreç epimorphic yenilenme olarak adlandırılan, yaralanma sonra geleneksel doku onarımı çok doku düzeyinde P3 rejenerasyon yanıtı ayırt6, 10. P3 rejenerasyon yara şifa11,12, kemik histoliz11,12dahil karmaşık rejeneratif süreçleri araştırmak için tekrarlanabilir ve procedurally basit bir modeldir, revaskülarizasyon13, periferal sinir rejenerasyonu14, ve Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemiğe blastemal dönüşümü15.
İmmunohistokimya kullanarak önceki çalışmalar blastema heterojen olduğunu göstermiştir, avasküler, hipoktik, ve yüksek proliferatif11,13,15,16. Distal P3 amputasyonu sonrasında, erken blastema başlangıçta P3 periost ve endosteum ile ilişkilidir ve kemik yüzeyinin bitişiğinde sağlam proliferasyon ve nazcent osteogenezi ile karakterize edilir15. Kemik bozulması ve yara kapanışı sonrasında, heterojen blastema periosteal ve endosteal ilişkili hücrelerin birleşmesiyle oluşur, ardından Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemik dahil olmak üzere blastemal bileşenlerin farklılaşması 15 yaşında.
Travmaya yanıt olarak kemik onarımı genellikle endokondral ossifikasyon tarafından oluşur, yani sonraki kemik oluşumu için bir şablon oluşturan ilk kıkırdak nasır üzerinden17,18. Uzun kemik Intramembranous ossifikasyon, yani, bir kıkırdak ara olmadan kemik oluşumu, yaygın karmaşık distraksiyon cihazları veya cerrahi fiks kullanılarak indüklenir19,20. Basamak rejenerasyon yanıtı konvansiyonel Intramembranous ossifikasyon modelleri üzerinde avantaj sunan bir ön klinik modeldir: 1) Intramembranous ossifikasyon uyarmak için dış veya iç fikresiyon sonrası yaralanma gerektirmez, 2) Her hayvandan 4 basamak kullanılarak gerçekleştirilen, böylece hayvanların kullanımını minimize ederken örnekleri maksimize, ve 3) sıralı in vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT) analizi kolay ve hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir.
Bu çalışmada, yeniden üretilebilen ve sağlam bir rejenerasyon tepkisi elde etmek için standartlaştırılmış P3 amputasyonu düzlemini gösteriyoruz. Ayrıca, blastema oluşumu, rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyon ve Intramembranous yoluyla kemiğe blastemal dönüşümü görselleştirmek için parafin bölümlerini kullanarak optimize edilmiş bir floresan immünhistokimya Protokolü gösteriyoruz. Kemikleşme. Ayrıca, rejenerasyon sırasında aynı basamakta kemik morfoloji, hacim ve uzunluğundaki değişiklikleri belirlemek için sıralı in-vivo μCT kullanımını da gösteriyoruz. Bu protokolün amacı, Amputasyondan sonra memelilik blastema oluşumunu araştırmak ve Intramembranous kemik rejenerasyonunun incelenmesi için 2 Teknik, floresans immünhistokimya ve sıralı in vivo μct göstermektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein Block Serum Free</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>X0909</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCNA antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab29</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-CXCR4 antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB21651</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>1:800 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab22552</td>
			<td>1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td>HPA022040</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21235</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11077</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold antifade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgipath Decalicifier 1</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3800400</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative</td>
			<td>Anatech LTD</td>
			<td>174</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD-1 Female Mouse</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>ICR(CD-1)</td>
			<td>8-12-weeks-old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vivaCT 40</td>
			<td>SCANCO Medical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adult mouse digit amputation and regeneration: a simple model to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification

Burada, biz bir protokol yetişkin fare distal Terminal falanks (P3) amputation, epimorphic rejenerasyon, bir procedurally basit ve tekrarlanabilir memeli modeli mevcut blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon tarafından analiz içerir Floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi (μCT). Memelinin rejenerasyonu Terminal falanks distal bölgesini (P3) aktaran amputasyonlar ile sınırlıdır; daha proksimal düzeylerde bacağı rakamları yeniden ve fibrotik şifa ve yara oluşumu geçmesi başarısız. Rejenerasyon tepkisi, amputasyonlu iskelet uzunluğunu geri yüklemek için Intramembranous ossifikasyon yoluyla kemik rejenerasyonu takiben proliferatif bir blastema oluşumu ile aracılık edilir. P3 amputasyon memelilerde epimamorfik rejenerasyon araştırmak için bir preklinik model, ve başarılı bir rejeneratif tepki ile fibrotik şifa yerine terapötik stratejilerin tasarımı için güçlü bir araçtır. Protokolimiz 1) erken ve geç blastema hücre nüfus, 2) rejenerasyon bağlamında revaskülarizasyon çalışma ve 3) tanımlamak için floresan immünhistokimya kullanır karmaşık kemik gerek kalmadan Intramembranous ossifikasyon araştırmak stabilize cihazları. Ayrıca, amputasyon sonrası morfolojik değişiklikleri incelemek için yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için sıralı in vivo μCT kullanımını da gösteriyoruz, aynı basamak içindeki hacim ve uzunluk değişikliklerini yenilenme sırasında ölçmek. Bu protokolün memelilerde hem epimamorfik hem de doku rejeneratif yanıtlarını araştırmak için muazzam bir yarar sunuyor olduğuna inanıyoruz.

6/7 DPA (Şekil 2a-D), 9 DPA (Şekil 2e-H) ve 10 DPA (Şekil 2i-L) ' de P3 basamakları rejenere yetişkin fare, Runx2, OSX ve PCNA antikorları ile immünosteli Intramembranous kemik görselleştirmek için rejenerasyon ve CXCR4 ve vWF antikorları ile immünostasyon blastema oluşumu görselleştirin. Amputasyon öncesinde taranan basamak ve yenilenme sırasında çeşitli zaman n...

Watch this Scientific Journal Video about Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification at JoVE.com

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Yetişkin fare basamak amputasyon ve rejenerasyonu: Mammalin Blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için basit bir model

Burada, meme blastema oluşumu ve Intramembranous ossifikasyon araştırmak için yetişkin fare terminali falanks amputasyon bir protokol sunuyoruz, floresan immünhistokimya ve sıralı in-vivo MİKROBİLGİSAYARLI tomografi ile analiz.

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3 amputasyonu memeli epimorfik rejenerasyonunu araştırmak için bir preklinik model ve kritik hücre popülasyonlarını ve endojen rejenerasyonu kontrol eden mekanizmaları belirlemek için güçlü bir araçtır. P3 modeli erken ve geç blastemal hücre popülasyonlarının tanımlanmasına, rejenerasyon sırasında revaskülarizasyon çalışmasına ve kompleks kemik stabilizasyon cihazı gereksinimleri olmadan intramembranöz kemikleşmenin araştırılmasına olanak sağlar. Benimle prosedürü gösteren Usame Qureshi, Alyssa Falck ve Katherine Zimmel, teknisyen ve Regina Brunaeur, bir Araştırma Görevlisi Profesör tüm laboratuvardan olacaktır.Sekiz ila 12 haftalık BIR CD-1 farede ayak parmak kıskacına yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın ve fareyi 10X diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin. Her arka ekstremitenin basamaklarını sterilize etmek için cerrahi povito iyot ve %70 etanol kullanın ve kılları cerrahi bölgeden uzaklaştırmak için mikrosksörü kullanın. Cerrahi siteyi anestezik için yerel topikal bupivacaine bir mikrolitre uygulayın ve yavaşça medial basamak yüzeyini ortaya çıkarmak için bir arka pençe splay.Daha sonra neşteri yağ yastığına paralel bir açıda tutarak, iki ve dört basamaklı terminal falanksın distal ucunu kesecek steril bir sayı 10 neşter kullanın. Her amputated rakam yerel bupivacaine bir ek mikrolitre uygulayın ve yara pansuman olmadan ve tam recumbency kadar izleme ile yaraların iyileşmesini sağlamak için temiz bir kafes için fare dönmek. Başarılı bir P3 ampütasyon düzlemi sağlamak için, amputasyon sırasında yağ yastığına paralel neşter tutun ve doğru ampütasyon uzunluğunu doğrulamak için mikro-CT tarama yapın.Uygun deneysel bitiş noktasında, yaklaşık ikinci ventral yağ yastığı girinti de orta falanks kemiği ile orta daki basamak kesmek için bir neşter kullanın. 24 ila 48 saat boyunca taze tamponlu çinko formalin fiksatif 10 mililitre içeren bir 20 mililitre sintillation şişe doku aktarın. Ve her basamaktan 4-5 mikrometre kalınlığında kesitler elde etmek için bir mikrotom kullanın, elde edildiklerinde histolojik yapışkan çözeltisi ile desteklenen 38 ila 41 derece lik bir su banyosuna dilimleri yerleştirin.Ardından dilimleri yapışkan slaytlarda yakalayın ve slaytları kuruması için 37 derecelik santigrat kaydırak ısıtıcısına yerleştirin. Slaytlar deparafinize edildiğinde numuneleri uygun bir antijen alma çözeltisinin boyama kavanozuna batırın ve slaytları kaynamanın oluşmadığından emin olmak için 25 dakika boyunca 95 dereceye ısıtın. Kuluçka sonunda, kavanoz oda sıcaklığına gelmek için izin ve tabanında nemlendirilmiş doku kağıt ile bir inç derin kaplı plastik slayt kutusunda slaytlar düz yatıyordu.Her numuneye 100 mikrolitre önceden ısınmış proteinaz K ekleyin. Bölümlerin kurumaması için her slaytı küçük bir parafilm şeridiile kaplayın. 37 santigrat derece 12 dakika sonra, dikkatle parafin film kaldırmak ve yavaşça fazla engelleme solüsyonu kaldırmak için doku kağıt üzerinde slaytlar drenaj.Daha sonra, her slayt ilgi birincil antikor çözeltisi 100 ila 200 mikrolitre ekleyin. Dört santigrat derece bir gecede kuluçka için parafin film ile kaplı nemlendirici odasına siteleri dönün. Ertesi sabah TRIS-tamponlu tuzlu artı TWEEN veya TBST etiket slaytlar yıkandıktan sonra Oda sıcaklığında ışıktan korunan 45 dakikalık kuluçka için uygun bir ikincil antikor çözeltisi ile slaytlar.Kuluçka sonunda, TBST slaytlar yıkayın ve onları kurumasını bekleyin. Daha sonra 100 mikrolitre anti-fade montaj ortamı nı kullanarak kapakları kurutulmuş kaydıraların üzerine dikkatlice yerleştirin ve kayaçları gece boyunca ışıktan korunan oda sıcaklığında düz bir şekilde saklayın ve montaj ortamının kurumasını bekleyin. Sıralı in vivo mikro-bilgisayarlı tomografi veya mikro-CT kıyafeti için mikro-CT görüntüleyici tüp ile mikro-CT görüntüleyici içine ve mikro-CT hayvan odası içine oksijen akışını sağlamak için, dışarı akan oksijen isoflurane tuzak için aktif bir kömür filtresi ile donatılmış olduğundan emin olun.Voxelsize'ı 55 pik kilovoltajda 10,5 mikrometreye ve 180 derece başına 1.000 projeksiyonla 145 mikrometreye ve 200 milimetrelik entegrasyon süresiyle sürekli döndürmeye ayarlayarak tarayın başına en fazla 213 dilim elde edin. Tarayıcı hazır olduğunda, anestezili fareyi yavaşça mikro-CT hayvan odasına, arka ekstremite rakamları düz olarak düzenlenmiş, sol tarafta sol pençe ile yakın ilişkilendirme ventral tarafı ve tarama platformunun sağ tarafında sağ tarafta yerleştirin. Sonra yavaşça yerinde basamakları güvenli cerrahi bant uygulayın.Taziyi başlatmadan önce hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın. Taradıktan sonra, hayvanı tam recumbency kadar izleme ile temiz bir kafese geri dönün ve mikro-CT görüntü rekonstrüksiyonu için birkaç saat kadar izin verin. Yeniden oluşturulan 3D kemik görüntüsünün analizi için, mikro-CT ile sağlanan yazılımı kullanarak, görüntü dosyalarını bir dizi DICOM dosyasına dönüştürün.Tüm dosyalar dönüştürüldüğünde, dicom serisini bir web tarayıcısında toplu dosya indirici kullanarak tek bir klasöre indirin. BoneJ eklentisini ImageJ eklentisi klasörüne yükleyin. Dosyaları açmak için DICOM dosya serisi klasörünü ImageJ çubuğuna sürükleyip bırakın.Tüm gri değerleri görüntüleyen 16 bitlik bir görüntü yığını açılır. Yalnızca kemik görüntülemek için Görüntü Ayarla ve Eşik'i tıklatın. Üst eşik çubuğunu en sağa kaydırın ve yalnızca kemik kırmızı vurgulanana kadar alt eşik çubuğunu ayarlayın.Alt eşik değeri yaklaşık 10, 000 ila 13, 000 32, 767 maksimal sinyal yoğunluğu nda olacaktır. Uygula'yı tıklatın ve yeni iletişim kutusunda Siyah arka planı tıklatın. Ardından, Tamam'ı tıklatın. Siyah ve beyaz değerleri görüntüleyen sekiz bitlik bir görüntü oluşturulur.Beyaz, kemiğe karşılık geliyor. Seçmek ve desteyi çoğaltmak için P3 kemiğinin etrafına bir dikdörtgen çizin. 3B görüntü oluşturmak için Eklentiler ve 3B Görüntüleyici'yi tıklatın ve silinecek kemiği daire içine almak için serbest seçim aracını kullanın.Ardından sağ tıklayın ve görüntüden gereksiz kemik kırpmak için Seçim'i seçin. 3B işlemedeki kemik hacmini ölçmek için BoneJ eklentisini açın ve Hacim Fraksiyonu'nu seçin. Bir sonuç penceresi görünür ve kemik hacmi milimetre küp olarak görüntülenir.3B işlemedeki kemik uzunluğunu ölçmek için ImageJ çok noktalı aracını kullanın. 3B işlemenin görüntüsünü yakalamak için Görüntüle'yi tıklatın ve anlık görüntü alın. Ardından görüntüyü TIF veya JPEG dosyası olarak kaydedin.Bu görüntülerde P3 haneyenileyen yetişkin bir farenin bölümleri, amputasyon sonrası 6, 9 ve 10 pmasyon sonrası günde intramembranöz kemik rejenerasyonu ve blastema oluşumunu görselleştirmek için antikorlarla immünosentez yapıldı. Burada, amputasyon dan önce ve yenileme boyunca çeşitli zaman noktalarında taranmış basamakların temsili mikro-CT görüntüleri, uzunluk ölçümlerini tanımlamak için kullanılan işaretlerle gösterilir. Fare basamak modeli, distal düzeyde ampütasyonu tetikleyen projeneratif yara ortamını analiz etmek için güçlü bir sistemdir.Tersine, basamak proksimal amputasyon rejeneratif başarısızlık araştırmak için bir model sistemi olarak hizmet yanı sıra rejenerasyon geliştirmek için stratejiler test etmek için bir site.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Preimplantasyon Fare Embriyolar Erken Hücre Kader Belirleyicileri Araştırma kaybı: ve Kazanç fonksiyon-Yaklaşımı

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

Yetişkin Cilt Fibroblastları gelen İnsülin salgılayan hücreler elde edilir Güvenli ve Basit Yöntem olarak epigenetik Dönüşüm

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Zebra balığı Çeneli Biyomekanik Araştırma Sonlu Elemanlar Modelleri Bina

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

Fare Embriyonik metatarsallara Kültürü: endokondral Kemikleşmenin bir Fizyolojik Modeli

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Kısmi Lobular Hepatectomy: Morfolojik karaciğer rejenerasyonu için cerrahi bir Model

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...