Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث من خلال برنامج البحوث الأساسية KBRI من خلال معهد كوريا لبحوث الدماغ بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (19-BR-01-08)، ومنحة مؤسسة البحوث الوطنية الكورية (NRF) التي تمولها حكومة كوريا (MSIT) (رقم. 2019R1A2C1010634) وتتكرم جامعة سيول الوطنية بتقديم البلازميدات من قبل شركة SCO1-APEX2 وHRP-KDEL. تم الحصول على بيانات TEM في المرافق الأساسية لأبحاث الدماغ في KBRI.

1. ثقافة الخلية مع نمط طبق ثقافة الشبكة وخلية transection مع SCO1-APEX2 وHRP-KDEL بلازميد ناقلات
<ol><li>البذور 1 × 105 خلايا HEK293T عن طريق وضعها في 35 ملم الزجاج شبكة القاع أطباق الثقافة في جو رطب يحتوي على 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية في دولبكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 100 U / mL ا...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

تحديد التعريب الخلوي لبروتينات محددة بدقة نانومتر باستخدام EM أمر بالغ الأهمية لفهم الوظائف الخلوية للبروتينات. عموما، هناك نوعان من التقنيات لدراسة توطين البروتين المستهدف عن طريق EM. واحد هو تقنية مناعي، والتي تم استخدامها في EM منذ عام 1960، والآخر هو تقنية باستخدام العلامات المشفرة وراثي...

الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic (ER) هي أعضاء خلوية مرتبطة بالغشاء. اتصالهم ضروري لوظيفتها، وقد وصفت البروتينات المتعلقة بشبكتهم1. وقد تم الإبلاغ عن المسافة بين الميتوكوندريا وER ما يقرب من 100 نانومتر باستخدام المجهرية الخفيفة2; ومع ذلك، كشفت الدراسات المجهرية فائقة الدقة3 والمجهرية الإلكترون (EM)4 أن تكون أصغر بكثير، في حوالي 10-25 نانومتر. الدقة التي تم تحقيقها في الفحص المجهري فائق الدقة أقل من EM، ووضع العلامات المحددة ضروري. EM هو تقنية مناسبة لتحقيق تباين عالية الدقة بما فيه الكفاية للدراسات الهيكلية للصلات بين الميتوكوندريا وER. ومع ذلك، العيب هو معلومات محور z محدودة لأن المقاطع رقيقة يجب أن يكون حوالي 60 نانومتر أو أرق لالإرسال التقليدي الإلكترون المجهري (TEM). للحصول على تصوير ثلاثي المحاور EM z-axis، يمكن استخدامالمجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد (3DEM) 5. ومع ذلك، وهذا ينطوي على إعداد مئات من المقاطع التسلسلية رقيقة من الخلايا بأكملها، وهو عمل صعب جدا أن عدد قليل فقط من التقنيين المهرة يتقن. يتم جمع هذه المقاطع رقيقة على هشة formvar فيلم المغلفة شبكة TEM ثقب واحد. إذا كان الفيلم يكسر على حزام واحد، والتصوير التسلسلي وإعادة بناء حجم غير ممكن. الفحص المجهري الإلكتروني للمسح الضوئي التسلسلي للوجه (SBEM) هو تقنية شعبية لـ 3DEM يستخدم قسمالكتلة المدمرة داخل غرفة الفراغ بالمجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SEM) إما بسكين ألماس (Dik-SBEM) أو شعاع أيون مركز (FIB-SEM) 6.ومع ذلك، لأن هذه التقنيات غير متوفرة في جميع المرافق، نقترح التصوير المقطعي صفيف7 باستخدام التناقل التسلسلي وSEM. في التصوير المقطعي للصفيف، يتم نقل المقاطع التسلسلية المقطوعة باستخدام ميكروتومي فائق ة إلى غطاء زجاجي بدلاً من شبكة TEM وتصورها عبر الفحص المجهري الخفيف وSEM8. لتعزيز إشارة التصوير الإلكترون التشتت الخلفي (BSE)، استخدمنا بروتوكول تلطيخ EM كتلة استخدام تتكسيد أوزميوم (OsO4)-الخلايا الثابتة مع ثيوكاربوهيدرازيد osmiophilic (TCH)9،مما يتيح لنا الحصول على صور دون بعد تضمين تلطيخ مزدوج.
بالإضافة إلى ذلك, تم استخدام علامة الميتوكوندريا SCO1 (بروتين تجميع السيتوكروم ج أوكسيديز 1)– أسكوربات بيروكسيداز 2 (APEX2)10 العلامة الجزيئية لتصور الميتوكوندريا على مستوى EM. APEX2 هو ما يقرب من 28 كيلودا ومشتق من فول الصويا أسكوربات بيروكسيداز11. وقد تم تطويره لإظهار الموقع المفصل لبروتينات محددة على مستوى EM بنفس الطريقة التي يتم بها استخدام البروتين الأخضر الفلورسنت الموسومة في الفحص المجهري الخفيف. APEX2 يحول 3,3 ' -diaminobenzidine (DAB) إلى بوليمر osmiophilic غير قابل للذوبان في موقع العلامة في وجود بيروكسيد الهيدروجين العامل المساعد (H2O2). APEX2 يمكن استخدامها كبديل لوضع العلامات التقليدية للجسم المضاد في EM، مع توطين البروتين في جميع أنحاء عمق الخلية بأكملها. وبعبارة أخرى، يمكن تصور البروتين APEX2 الموسومة عن طريق التناضح محددة11 دون وضع العلامات المناعية ونفاذية بعد الترا cryoization. peroxidase الفجل (HRP) هو أيضا علامة حساسة أن يحفز H2O2تعتمد البلمرة من DAB في الرواسب المترجمة، وتوفير EM التباين بعد العلاج مع OsO4. تم تطبيق تسلسل الببتيد الهدف ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 لتصور ER داخل خلية كاملة. لتقييم بروتوكولنا لاستخدام العلامات الوراثية ووصمة عار الكتلة مع انخفاض osmium وTCH (طريقة rOTO)، وذلك باستخدام تأثير التناضح في نفس الوقت، قارنا تباين الغشاء مع وبدون استخدام كل علامة وراثية في rOTO en bloc تلطيخ. على الرغم من أن 3DEM مع التصوير المقطعي صفيف وDAB تلطيخ مع APEX وHRP قد استخدمت، على التوالي، لأغراض أخرى، بروتوكولنا فريد من نوعه لأننا قد الجمع بين التصوير المقطعي صفيف ل3DEM وDAB تلطيخ لالميتوكوندريا ووضع العلامات ER. على وجه التحديد، أظهرنا خمس خلايا مع وبدون الجينات ذات العلامات APEX في نفس القسم، مما ساعد في التحقيق في تأثير التعديل الوراثي على الخلايا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

إنشاء أعضاء خلوية، مثل الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية (ER)، شبكة لأداء مجموعة متنوعة من الوظائف. يتم طي هذه الهياكل المنحنية للغاية في أشكال مختلفة لتشكيل شبكة ديناميكية اعتمادا على الظروف الخلوية. وقد جرت محاولة تصور هذه الشبكة بين الميتوكوندريا وER باستخدام التصوير الفلوري فائق الاستبانة والفحص المجهري الخفيف؛ ومع ذلك، فإن القرار المحدود غير كاف لمراقبة الأغشية بين الميتوكوندريا وER بالتفصيل. يوفر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال تباينًا جيدًا للغشاء واستبانة على نطاق النانومتر لمراقبة العضيات الخلوية؛ ومع ذلك، فإنه يستغرق وقتا ً طويلاً بشكل استثنائي عند تقييم بنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) من العضيات المنحنية للغاية. لذلك، لاحظنا مورفولوجيا الميتوكوندريا وER عن طريق الفحص المجهري الإلكترون الخفيف النسبي (CLEM) وتقنيات الفحص المجهري للإلكترون الحجم باستخدام البيروكسيداز أسكوربات معززة 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل. تم تطبيق طريقة تلطيخ الكتلة، والمقاطع التسلسلية رقيقة جدا (التصوير المقطعي للصفيف)، وحجم المجهر الإلكتروني لمراقبة بنية 3D. في هذا البروتوكول، نقترح مزيج من CLEM و3D المجهر الإلكتروني لإجراء دراسات هيكلية مفصلة من الميتوكوندريا وER.

يصف الشكل 1 الجدول الزمني وسير العمل لهذا البروتوكول. يتطلب البروتوكول 7 أيام؛ ومع ذلك، اعتماداً على الوقت المستغرق في التصوير SEM، قد يزيد هذا. لتبديل الخلايا، ينبغي التحكم في تزامن الخلايا حتى لا تغطي الجزء السفلي من لوحة الشبكة بأكملها (الشكل1A). يمكن أن تمنع كثافة الخلاي...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

نقدم بروتوكول لدراسة توزيع الميتوكوندريا والشبكية endoplasmic في الخلايا الكاملة بعد التعديل الجيني باستخدام الضوء المترابطة وحجم المجهر الإلكتروني بما في ذلك أسكوربات بيروكسيداز 2 وتلطيخ البيروكسيداز الفجل، الاستئصال التسلسلي للخلايا مع وبدون الجين المستهدف في نفس القسم، والتصوير التسلسلي عن طريق المجهر الإلكتروني.

تصوير الميتوكوندريا والشبكية الإندوبلازمية بواسطة الضوء المترابطة والفحص المجهري للإلكترون الحجم

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

وتستخدم تقنية المجهر الإلكتروني هذا لإجراء الدراسات البيولوجية التي تتطلب مراقبة بنية ثلاثية الأبعاد. تقديم قضيب، عرض لاعب الميدان، وتخزين العينة قبل إعادة استعادة الصورة. Fx2 Asan هندست مراحل المسار التي تحفز على إزالة للفحص لزيادة اختبار الإلكترون من الهياكل المستهدفة ويمكن استخدامها لتحديد هدف معين من الفائدة.تجمع هذه الجسيمات بين استخدام الضوء المترابط وتقنية المجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد للتحقيق في التفاعلات بين العضيات المُمَرَبة والخلايا المضيفة. 16 إلى 24 ساعة بعد transfection، وغسل بلطف الثقافة مع 250 ميكرولترات من 30 إلى 37 درجة مئوية حل التثبيت. استبدال بسرعة غسل مع 1.5 ملليلتر من حل التثبيت الطازجة، ووضع الثقافة على الجليد لمدة 30 دقيقة.في نهاية الحضانة ، شطف الخلايا مع ثلاث غسلات عشر دقائق في ملليلتر من الجليد البارد 0.1 0.1 صوديوم cacodylate العازلة في الغسيل. بعد الغسيل الأخير، إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة 0 إلى 4 درجات مئوية 20 ملليمتر 20 محلول الجليسين إلى الطبق لاحتضان لمدة عشر دقائق على الجليد تليها ثلاث يغسل خمس دقائق مع ملليلتر واحد من الطازجة، الباردة 0.1 الصوديوم الكاكويدوليت كل غسل العازلة. المقبل، تسمية الخلايا مع 500 ميكرولترات من حل DAB الطازجة.و حضن الخلايا على الجليد لمدة خمس إلى خمس وأربعين دقيقة تقريباً عندما تكون بقعة بني فاتح مرئية تحت مجهر ضوء مقلوب ، شطف الخلايا ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من الطازجة والباردة 0.1 صوديوم cacodylate العازلة لمدة عشر دقائق لكل غسل. ثم، استخدام المجهر المقلوب على النقيض من المرحلة لتصور تلطيخ DAB في تكبير 100 مرة أو أعلى ووضع علامة على الجزء السفلي من الزجاج حيث تقع المنطقة ذات الاهتمام.بالنسبة لإعداد عينة المجهر الإلكتروني ، أول ما بعد إصلاح الخلايا مع ملليلتر واحد من 2 ٪ انخفاض أوسميوم تتراوكسيد لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية. في نهاية التثبيت ، شطف الخلايا مع ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق ومليلتر واحد من الماء المقطر الطازج لكل غسل. قبل معالجة الخلايا بميليلتر واحد من محلول TCH الذي تمت تصفيته لمدة 20 دقيقة.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في الماء المقطر كما أظهرت للتو وإصلاح الخلايا مع حضانة 30 دقيقة في 2٪ انخفاض أكسيد الأوسميوم. في نهاية التثبيت الثاني، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع الماء المقطر وتغطية الثقافة مع ملليلتر واحد من خلات أورانيل مائي 1٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. في صباح اليوم التالي، غسل الخلايا ثلاث مرات مع الماء المقطر قبل تلطيخ مع ملليلتر واحد من 60 درجة مئوية سخنت المحلل التون اسبارتات الرصاص لمدة 30 دقيقة في فرن 60 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا ثلاث مرات في الماء المقطر. واحتضان الثقافة في سلسلة متدرج من 20 دقيقة 2 ملليلتر الإيثانول aliol. بعد التعرض الأخير 100٪ الإيثانول، احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في ملليلتر واحد من ثلاثة إلى واحد الإيثانول إلى انخفاض اللزوجة تضمين خليط المتوسطة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، واستبدال المتوسطة مع ملليلتر واحد من الإيثانول واحد إلى واحد إلى انخفاض اللزوجة تضمين خليط المتوسطة لاحتضان آخر 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، استبدل الوسيط بميليلتر واحد إلى ثلاثة إيثانول إلى مزيج مُدمج منخفض لمدة 30 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة. ثم، استبدال المتوسطة مع ملليلتر واحد من 100٪ اللزوجة المنخفضة تضمين المتوسطة بين عشية وضحاها، تليها تضمين العينة في 100٪ اللزوجة اللزوجة التضمين خليط لمدة 24 ساعة في 60 درجة مئوية.بالنسبة لتحليل المجهر الإلكتروني للإرسال، في اليوم التالي، استخدم ميكروتوم فائقًا للحصول على 90 جزءًا سميكًا من نانومتر ومراقبة الشبكة تحت المجهر الإلكتروني انتقال في 200 كيلوفولت. قبل البدء في إعداد العينة، نظيفة أغطية الزجاج المغلفة أكسيد القصدير Indium مع التحريض لطيف في ايزوبروبانول لمدة 30 إلى 60 ثانية. في نهاية الهياج ، استنزف الكحول الزائد ووضع الأغطية في بيئة خالية من الغبار.عندما تكون الأغطية جافة، استخدم مغطي البلازما لتوهج تصريف الأغطية لمدة دقيقة واحدة. ثم إدراج الأغطية في حامل الركيزة ووضع حامل الركيزة في قارب سكين. للحصول على عينات لفحص المجهر الإلكتروني، أدخل كتلة العينة المضمنة في حامل العينة من الميكروفات الفائقة.ووضع حامل في كتلة التشذيب. استخدام شفرة حلاقة لتقليم بعيدا الراتنج الزائد حول الموقف المستهدف بحيث أن وجه كتلة يكتسب شكل شبه منحرف أو مستطيلة. يجب أن تكون الحواف الرائدة والزائدة متوازية تمامًا مع بعضها البعض.ليس من السهل الحصول على عدد كبير من المقاطع التسلسلية. ومع ذلك، يجب أن يكون لديك الحواف الرائدة وحافات زائدة موازية تماما. بعد ذلك، أدخل حامل العينة في ذراع الميكراتومية الفائقة.ضع سكين الماس في حامل السكين ، وملء قارب السكين بالماء المقطر المصفى. ثم، دفع بعناية مقبض الحامل لضبط موقف الناقل بحيث حافة الأغطية قريبة من السكين. بعد الحصول على العينة، ووقف عملية اقسام، ببطء فتح المسمار لقط الأنبوب واستنزاف قارب المياه.عند اكتمال عملية تجميع الشريط، قم بإزالة الركيزة بمقبض جهاز التحامل وجفف الشريط. استخدام البلازميدات الموسومة وراثيا التعبير عن البروتينات من الاهتمام، ويسمح لتحديد الخلايا المستهدفة عبر المصابين بعد تلطيخ للبروتينات الموسومة. ويمكن بعد ذلك المجهر الإلكتروني الخفيف المترابط أن تستخدم لتصور مزيد من ثقافة الخلية المسمى.على سبيل المثال، يتم ملاحظة البقعة الداكنة التي تولدها SCO1-APEX2 حصريًا في الفضاء المشترك بين الميتوكوندريا وليس في مساحة المصفوفة للميتوكوندريا. رمز الخلايا المصابة مع كل SCO1-APEX2 وHRP-KDEL plasmids التعبير عن إشارة الإلكترون عالية الكثافة في الفضاء intermembran في الميتوكوندريا وشوكولوم endoplasmic. ومع ذلك، لا يوجد تلطيخ إندوبلاسميكي للتشنج في الخلايا التي يتم نقل المصابين SCO1-APEX2 فقط.للتصوير التسلسلي عن طريق المسح المجهري الإلكترون، يتم إنشاء نظرة عامة على صورة مجموعة كاملة باستخدام كاشف الإلكترون backscatter على مساحة كبيرة. وبعد ذلك، توضع المنطقة موضع الاهتمام في القسم الأول وتُنشر في جميع الأقسام الأخرى. وأخيراً، يتم تصوير المنطقة ذات الاهتمام التي تحتوي على خمس خلايا مستهدفة بخمسة بيكسلات تصوير نانومترية.التكبير يكشف عن هياكل فرعية مفصلة مثل جهاز غولجي، الميتوكوندريا، وشوكولوم endpolasmic. التصوير التسلسلي يكشف بوضوح أن اتصالات إندوبلاسميك النتكولوم-الميتوكوندريا تحدث على مختلف ال الطائرات z- الوميض. يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد موقع بنية مستهدفة محددة باستخدام الضوء المترابط والمجهر الإلكتروني للتحقيق في آثار تعديل هوية محددة.ويمكن استخدام هذه التقنيات تلطيخ جنبا إلى جنب مع حجم المجهرية الإلكترونية لأوسع نطاق EM للتحقيق التفاعلات الخلوية وخاصة في يوروفيروس. تذكر الجلوتارالدهيد، وأيضا عنتيterocide وTCH هي سامة جدا، لذلك تأكد من ارتداء الملابس الواقية والعمل في غطاء الدخان عند استخدام هذه المواد.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

تصوير الأنسجة اميلويد ملطخة بالانارة أوليجوثيوفينيس مترافق بالفائقة الطيفية [كنفوكل] مجهرية والأسفار تصوير مدى الحياة

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

تحليل للتشوهات التي يسببها بيتا-اميلويد فيبرينوجين جلطة هيكل بالتحليل الطيفي، وفحص المجهر الإلكتروني

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...