Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
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Diese Forschung wurde durch das KBRI-Grundlagenforschungsprogramm durch das Korea Brain Research Institute unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (19-BR-01-08) und vom National Research Foundation of Korea (NRF) gefördert wird. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmide wurden freundlicherweise von Hyun-Woo Rhee (Seoul National University) zur Verfügung gestellt. TEM-Daten wurden in Brain Research Core Facilities in KBRI erfasst.

1. Zellkultur mit gemusterter Gitterkulturschale und Zelltransfektion mit SCO1-APEX2 und HRP-KDEL Plasmidvektor
<ol><li>Samen 1 x 105 HEK293T Zellen, indem sie sie in 35-mm-Glasgitter-Boden-Kulturschalen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2 bei 37 °C in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum, 100 U/ml Penicillin und 100 U/ml Streptomycin.</li>
	<li>Am Tag nach der Aussaat der Zellen, wenn sie auf 50%-60% Konfluenz angewachsen sind, führen Sie die Plasm...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

Die Bestimmung der zellulären Lokalisierung bestimmter Proteine bei einer Nanometerauflösung mit EM ist entscheidend, um die zellulären Funktionen von Proteinen zu verstehen. Im Allgemeinen gibt es zwei Techniken, um die Lokalisation eines Zielproteins über EM zu untersuchen. Das eine ist die Immunogold-Technik, die seit 1960 in EM verwendet wird, und die andere ist eine Technik mit neu entwickelten genetisch kodierten Tags16. Herkömmliche Immunogold-Techniken haben antikörperkonjugierte Gol...

Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER) sind membrangebundene Zellorganellen. Ihre Verbindung ist für ihre Funktion notwendig, und Proteine, die mit ihrem Netzwerk zusammenhängen, wurden beschrieben1. Der Abstand zwischen den Mitochondrien und ER wurde mit Hilfe der Lichtmikroskopie2als etwa 100 nm gemeldet; Jüngste Studien der Superresolution-Mikroskopie3 und der Elektronenmikroskopie (EM)4 haben jedoch ergeben, dass sie mit etwa 10-25 nm erheblich kleiner ist. Die in der Hochauflösenden Mikroskopie erreichte Auflösung ist niedriger als EM, und eine spezifische Kennzeichnung ist erforderlich. EM ist eine geeignete Technik, um einen ausreichend hochauflösenden Kontrast für Strukturstudien der Verbindungen zwischen Mitochondrien und ER zu erreichen. Ein Nachteil sind jedoch die begrenzten Z-Achsen-Informationen, da die dünnen Abschnitte für die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) etwa 60 nm oder dünner sein müssen. Für eine ausreichende EM-Z-Achsen-Bildgebung kann die dreidimensionale Elektronenmikroskopie (3DEM)5verwendet werden. Dies beinhaltet jedoch die Vorbereitung von Hunderten von dünnen seriellen Abschnitten ganzer Zellen, was eine sehr schwierige Arbeit ist, die nur wenige erfahrene Technologen gemeistert haben. Diese dünnen Abschnitte werden auf zerbrechlichen Formwaren-Film-beschichteten Ein-Loch-TEM-Gittern gesammelt. Wenn der Film auf einem Gurt bricht, ist eine serielle Bildgebung und Volumenrekonstruktion nicht möglich. Die serielle Block-Face-Scanning-Elektronenmikroskopie (SBEM) ist eine beliebte Technik für 3DEM, bei der zerstörerische En-Block-Sektionen in der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) mit einem Diamantmesser (Dik-SBEM) oder einem fokussierten Ionenstrahl (FIB-SEM) verwendet werden. 6. Da diese Techniken jedoch nicht in allen Einrichtungen verfügbar sind, schlagen wir arraytomography7 mit seriellem Schnitt und SEM vor. In der Arraytomographie werden mit einem Ultramikrotom geschnittene serielle Abschnitte auf einen Glasdeckel anstelle eines TEM-Gitters übertragen und mittels Lichtmikroskopie und SEM8visualisiert. Um das Signal für die Rückstreuelektronen-Bildgebung (BSE) zu verbessern, haben wir ein en bloc EM-Färbeprotokoll verwendet, das Osmiumtetroxid (OsO4)-feste Zellen mit osmiophilem Thiocarbohydrazid (TCH)9verwendet, so dass wir Bilder ohne Doppelfärbung nach der Einbettung.
Zusätzlich wurde der mitochondriale Marker SCO1 (Cytochrom c Oxidase Assembly Protein 1)– Ascorbatperoxidase 2 (APEX2)10 molekulare Tags verwendet, um Mitochondrien auf EM-Ebene zu visualisieren. APEX2 ist ca. 28 kDa und wird aus Sojabohnen-Ascorbatperoxidase11abgeleitet. Es wurde entwickelt, um die detaillierte Position spezifischer Proteine auf EM-Ebene auf die gleiche Weise zu zeigen, wie grüne fluoreszierende Protein-markierte Proteine in der Lichtmikroskopie verwendet werden. APEX2 wandelt 3,3' -Diaminobenzidin (DAB) in ein unlösliches osmiophiles Polymer an der Stelle des Tagsin Gegenwart des Cofaktors Wasserstoffperoxid (H2 O2 ) um. APEX2 kann als Alternative zur herkömmlichen Antikörperkennzeichnung in EM mit einer Proteinlokalisierung in der gesamten Zelltiefe verwendet werden. Mit anderen Worten, das APEX2-markierte Protein kann durch spezifische Osmisierung11 ohne Immunogold-Etikettierung und Permeabilisierung nach Ultra-Kryosektion visualisiert werden. Meerrettichperoxidase (HRP) ist auch ein empfindliches Tag,das die H2 O2-abhängige Polymerisation von DAB in einen lokalisierten Niederschlag katalysiert und em-Kontrast nach der Behandlung mit OsO4liefert. Die ER-Zielpeptidsequenz HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 wurde angewendet, um ER innerhalb einer ganzen Zelle zu visualisieren. Um unser Protokoll der Verwendung von genetischen Tags und En-Block-Färbung mit reduziertem Osmium und TCH (rOTO-Methode) unter Verwendung des Osmisierungseffekts gleichzeitig zu bewerten, verglichen wir den Membrankontrast mit und ohne die Verwendung jedes genetischen Tags in rOTO en bloc Färbung. Obwohl 3DEM mit Arraytomographie und DAB-Färbung mit APEX bzw. HRP für andere Zwecke verwendet wurden, ist unser Protokoll einzigartig, da wir Arraytomographie für 3DEM- und DAB-Färbung für Mitochondrien und ER-Kennzeichnung kombiniert haben. Insbesondere zeigten wir fünf Zellen mit und ohne APEX-markierte Gene im selben Abschnitt, die bei der Untersuchung der Wirkung der genetischen Veränderung auf Zellen halfen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

Zelluläre Organellen, wie Mitochondrien und endoplasmatisches Retikulum (ER), bilden ein Netzwerk, um eine Vielzahl von Funktionen auszuführen. Diese hochgekrümmten Strukturen werden in verschiedene Formen gefaltet, um je nach zellulären Bedingungen ein dynamisches Netzwerk zu bilden. Die Visualisierung dieses Netzwerks zwischen Mitochondrien und ER wurde mit superauflösungsklarer Fluoreszenz-Bildgebung und Lichtmikroskopie versucht; Die begrenzte Auflösung reicht jedoch nicht aus, um die Membranen zwischen den Mitochondrien und ER im Detail zu beobachten. Transmissionselektronenmikroskopie bietet einen guten Membrankontrast und eine Nanometer-Auflösung für die Beobachtung von Zellorganellen; Bei der Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Struktur hochgekrümmter Organellen ist es jedoch außerordentlich zeitaufwändig. Daher beobachteten wir die Morphologie von Mitochondrien und ER mittels korrelativer Lichtelektronenmikroskopie (CLEM) und Volumenelektronenmikroskopie-Techniken mit verbesserter Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung. Zur Beobachtung der 3D-Struktur wurden eine en bloc-Färbemethode, ultradünne serielle Schnitte (Arraytomographie) und Volumenelektronenmikroskopie angewendet. In diesem Protokoll schlagen wir eine Kombination von CLEM und 3D-Elektronenmikroskopie vor, um detaillierte Strukturstudien von Mitochondrien und ER durchzuführen.

Abbildung 1 beschreibt den Zeitplan und den Workflow für dieses Protokoll. Das Protokoll benötigt 7 Tage; Abhängig von der Zeit, die für die SEM-Bildgebung aufgewendet wird, kann dies jedoch zunehmen. Bei der Zelltransfektion sollte die Konfluenz der Zellen so gesteuert werden, dass der Boden der gesamten Gitterplatte nicht abgedeckt wird (Abbildung 1A). Eine hohe Zelldichte könnte die Identifizierung der von Interesse sindden Zelle während der Lichtmikroskop- und EM-Beobachtung ve...

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Wir präsentieren ein Protokoll zur Untersuchung der Verteilung von Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum in ganzen Zellen nach genetischer Veränderung mittels korrelativer Licht- und Volumenelektronenmikroskopie einschließlich Ascorbatperoxidase 2 und Meerrettichperoxidase-Färbung, serielle Steilerstellung von Zellen mit und ohne Zielgen im selben Abschnitt und serielle Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Diese Volumenelektronenmikroskopie wird verwendet, um biologische Studien durchzuführen, die die Beobachtung einer 3D-Struktur erfordern. Bietet eine Stab-, Felderansicht und Probenspeicherung, bevor das Bild wieder aufnimmt. Fx2 Asan entwickelte die Pfadstufen, die die Deabilation katalysieren, um den Elektronentest von Zielstrukturen zu erhöhen und kann verwendet werden, um ein bestimmtes Ziel von Interesse zu lokalisieren.Diese Teilchen kombinieren den Einsatz von korrelativen Licht und 3-D-Elektronenmikroskopie-Technik, um die Wechselwirkungen zwischen membranösen Organellen und Wirtszellen zu untersuchen. 16 bis 24 Stunden nach der Transfektion die Kultur vorsichtig mit 250 Mikrolitern 30 bis 37 Grad Celsius Fixierungslösung waschen. Ersetzen Sie die Wäsche schnell durch 1,5 Milliliter frischer Fixierungslösung und legen Sie die Kultur 30 Minuten lang auf Eis.Am Ende der Inkubation spülen Sie die Zellen mit drei zehnminütigen Waschungen in einem Milliliter eiskaltem 0,1 moligem Natriumkakodylatpuffer pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche einen Milliliter eiskalte 0 bis 4 Grad Celsius 20 Millimolar Glycin-Lösung in die Schale für eine zehnminütige Inkubation auf Eis gefolgt von drei fünfminütigen Wäschen mit einem Milliliter frischer, kalter 0,1 molar NatriumkakodylatPuffer pro Wäsche. Als nächstes beschriften Sie die Zellen mit 500 Mikroliter frisch zubereiteter DAB-Lösung.Und die Zellen auf Eis für etwa fünf bis fünfundvierzig Minuten bebrüten. Wenn ein hellbrauner Fleck unter einem invertierten Lichtmikroskop sichtbar ist, spülen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter frischen, kalten 0,1 molaren Natriumkakodylatpuffer für zehn Minuten pro Wäsche ab. Verwenden Sie dann ein phasenkontrastinvertiertes Mikroskop, um die DAB-Färbung bei einer 100-fachen Vergrößerung oder höher zu visualisieren und den Boden des Glases zu markieren, in dem sich der Interessenbereich befindet.Für die Probenvorbereitung des Elektronenmikroskops müssen die Zellen zunächst mit einem Milliliter 2% reduziertem Osmiumtetroxid für eine Stunde bei vier Grad Celsius nachfixiert werden. Am Ende der Fixierung spülen Sie die Zellen mit drei fünfminütigen Waschungen und einem Milliliter frischem destilliertem Wasser pro Wäsche ab. Vor der Behandlung der Zellen mit einem Milliliter gefilterter TCH-Lösung für 20 Minuten.Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in destilliertem Wasser waschen, wie gerade gezeigt, und fixieren Sie die Zellen mit einer 30-minütigen Inkubation in 2% reduziertem Osmiumtetroxid. Am Ende der zweiten Fixierung die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser waschen und die Kultur mit einem Milliliter wässrigem 1%uranylacetat über Nacht bei 4 Grad Celsius vor Licht geschützt bedecken. Am nächsten Morgen die Zellen dreimal mit destilliertem Wasser waschen, bevor sie mit einem Milliliter 60 Grad Celsius gefärbt werden, wärmte Waltons Blei-Aspartat-Lösung 30 Minuten lang in einem 60 Grad Celsius Ofen.Am Ende der Inkubation die Zellen dreimal in destilliertem Wasser waschen. Und inkubieren Sie die Kultur in einer abgestuften Serie von 20-Minuten 2 Milliliter Ethanol Aliquots. Nach der letzten 100%ethanol Exposition, inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten in einem Milliliter von drei bis ein Ethanol zu niedrigviskosem Einbettungsmittel bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation das Medium durch ein Milliliter Eins-zu-Eins-Ethanol bis zu einem niedrigviskosen Einbettungsmischmedium für weitere 30 Minuten inkubationsmisch bei Raumtemperatur ersetzen. Als nächstes ersetzen Sie das Medium durch einen Millilter von ein bis drei Ethanol zu niedrigviskosem Einbettungsmischmedium für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann das Medium über Nacht durch einen Milliliter mit 100% niedriger Viskosität, gefolgt von der Einbettung der Probe in eine 100%niedrige Viskositäts-Einbettungsmischung für 24 Stunden bei 60 Grad Celsius.Für die Transmissionselektronenmikroskopie-Analyse verwenden Sie am nächsten Tag ein Ultramikrotome, um 90 Nanometer dicke Abschnitte zu erhalten und das Raster unter der Transmissionselektronenmikroskopie bei 200 Kilovolt zu beobachten. Vor Beginn der Probenvorbereitung, reinigen Indium Zinn oxidbeschichtete Glasabdeckungenmitlipsmitlips mit sanfter Rührung in Isopropanol für 30 bis 60 Sekunden. Am Ende der Agitation den überschüssigen Alkohol abtropfen lassen und die Deckelinen in eine staubfreie Umgebung stellen.Wenn die Abdeckungen trocken sind, verwenden Sie einen Plasma-Coater, um die Abdeckungen für eine Minute zu glühen. Dann legen Sie die Abdeckungen in den Substrathalter und legen Sie den Substrathalter in das Messerboot. Um Proben für die Rasterelektronenmikroskopie zu erhalten, legen Sie den eingebetteten Probenblock in den Probenhalter des Ultramikrotomeins ein.Und stellen Sie den Halter in den Trimmblock. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das überschüssige Harz um die Zielposition zu schneiden, so dass die Fläche des Blocks eine Trapez- oder rechteckige Form erhält. Die führenden und nachfolgenden Kanten sollten strikt parallel zueinander sein.Es ist nicht einfach, eine große Anzahl von seriellen Abschnitten zu erwerben. Allerdings müssen die vorderen Kanten und hinteren Kanten vollständig parallel sein. Als nächstes legen Sie den Probenhalter in den Arm des Ultramikrotom ein.Legen Sie das Diamantmesser in den Messerhalter und füllen Sie das Messerboot mit gefiltertem destilliertem Wasser. Drücken Sie dann vorsichtig den Griff des Halters, um die Trägerposition so einzustellen, dass die Kante der Abdeckungen in der Nähe des Messers liegt. Nach Dem Erhalt der Probe, stoppen Sie den Schnittprozess, öffnen Sie langsam die Spannschraube des Rohres und entleeren Sie das Wasserboot.Wenn der Bandsammelvorgang abgeschlossen ist, entfernen Sie das Substrat mit dem Griff der Spannvorrichtung und trocknen Sie das Band. Die Verwendung von genetisch markierten Plasmiden, die Proteine von Interesse ausdrücken, ermöglicht die Identifizierung der transfizierten Zielzellen nach der Färbung der markierten Proteine. Die korrelative Lichtelektronenmikroskopie kann dann verwendet werden, um die beschriftete Zellkultur weiter zu visualisieren.Beispielsweise wird der durch SCO1-APEX2 erzeugte dunkle Fleck ausschließlich im mitochondrialen Intermembranraum und nicht im Matrixraum der Mitochondrien beobachtet. Codetransfikierte Zellen mit SCO1-APEX2- und HRP-KDEL-Plasmiden drücken ein hochdichtes Elektronensignal im mitochondrialen Intermembranraum und im endoplasmatischen Retikulum aus. Allerdings wird keine endoplasmatische Retikulumfärbung in Zellen beobachtet, die nur mit SCO1-APEX2 transfiziert werden.Für die serielle Bildgebung mittels Rasterelektronenmikroskopie wird mit einem Rückstreuelektronendetektor über eine große Fläche ein Überblick über das gesamte Arraybild erstellt. Als nächstes wird der Interessenbereich im ersten Abschnitt platziert und an alle anderen Abschnitte weitergegeben. Schließlich wird der Interessenbereich mit fünf Zielzellen mit fünf nanometer abgebildeten Pixeln abgebildet.Die Vergrößerung zeigt detaillierte subzelluläre Strukturen wie den Golgi-Apparat, Mitochondrien und das endpolasmische Retikulum. Die serielle Bildgebung zeigt deutlich, dass endoplasmatische Retikulum-Mitochondrien-Kontakte auf verschiedenen Z-Ebenen auftreten. Sie sollten ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine bestimmte Zielstruktur mithilfe der korrelativen Licht- und Elektronenmikroskopie lokalisieren können, um die Auswirkungen einer bestimmten Identitätsänderung zu untersuchen.Diese Färbetechniken in Kombination mit volumenelektronenmikroskopischem Volumen könnten für größere EM verwendet werden, um zelluläre Wechselwirkungen insbesondere im Eurovirus zu untersuchen. Denken Sie daran, das Glutaraldehyd, auch Enteterocide und TCH sind sehr giftig, so achten Sie darauf, Schutzkleidung zu tragen und in einer Rauchhaube zu arbeiten, wenn Sie diese Materialien verwenden.

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Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Forschung

Biochemie

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

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Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

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Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...