Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי התוכנית מחקר בסיסי של KBRI באמצעות קוריאה מכון מחקר המוח ממומן על ידי משרד המדע והתקשוב (19-BR-01-08), וקרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) גרנט ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIT) (לא. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL פלמידס המסופקים באדיבות היאן-וו רי (האוניברסיטה הלאומית של סאול). נתוני TEM נרכשו בבית מחקר המוח מתקנים ליבה ב KBRI.

1. תרבות התא עם מיכל התרבות בדוגמת הרשת ומעבר תאים עם SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL וקטור.
<ol><li>Seed 1 x 105 HEK293T תאים על-ידי הצבת אותם לתוך 35-mm זכוכית מנות התחתית התרבות באווירה מחולל לחות המכיל 5% CO2 ב 37 ° צ' ב בינונית שונה של הנשר של דולבCO (dmem) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי, 100 U/mL פניצילין, ו 100 U/mL סטרפטומיצין...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

קביעת הלוקליזציה התאית של חלבונים ספציפיים ברזולוציית ננומטר באמצעות EM היא חיונית כדי להבין את הפונקציות הסלולר של חלבונים. בדרך כלל, ישנן שתי טכניקות ללמוד לוקליזציה של חלבון היעד באמצעות EM. אחת היא טכניקת החיסוני זהב, אשר נעשה שימוש EM מאז 1960, והשני הוא טכניקה באמצעות לאחרונה פיתח תגים מק...

הרשת המיטו, והאנדופלזמית (ER) הן ממברנות סלולאריים מאוגדות. החיבור שלהם הכרחי עבור תפקידם, וחלבונים הקשורים לרשת שלהם תוארו1. המרחק בין המיטוגרם ו-ER דווח כ 100 ננומטר באמצעות מיקרוסקופ אור2; עם זאת, מיקרוסקופ סופר ברזולוציה האחרונות3 ו מיקרוסקופ אלקטרוני (EM)4 מחקרים חשפו אותו להיות קטן במידה ניכרת, על כ 10-25 ננומטר. הרזולוציה שהושגה במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר נמוכה מ-EM, ותיוג ספציפי הוא הכרחי. EM היא טכניקה מתאימה כדי להשיג ניגודיות ברזולוציה גבוהה מספיק עבור מחקרים מבניים של הקשרים בין מיטוכונמיטוa ו-ER. עם זאת, חיסרון הוא המידע המוגבל של ציר z מכיוון שהסעיפים הדקים חייבים להיות כ-60 ננומטר או דק יותר עבור מיקרוסקופ אלקטרוני שידור קונבנציונאלי (TEM). עבור הדמיה מספקת של ציר EM z, מיקרוסקופ אלקטרוני תלת מימדי (3DEM) ניתן להשתמש5. עם זאת, זה כולל הכנת מאות חלקים סידוריים דקים של תאים שלמים, וזה עבודה מסובכת מאוד שרק כמה טכנולוגים מיומנים שולט. קטעים דקים אלה נאספים על הסרט formvar שברירי מצופה ברשתות TEM אחד-חור. אם הסרט נשבר על בחורה אחת, הדמיה טורית ושחזור נפח אינו אפשרי. בלוק סדרתי הסורק מיקרוסקופ אלקטרונים (SBEM) היא טכניקה פופולרית עבור 3DEM המשתמשת הרסני בלוקים בתוך המיקרוסקופ אלקטרון מיקרוסקופ (SEM) תא ואקום עם סכין יהלום או (דיכ-SBEM) או קרן יון ממוקדת (פרפור-SEM) 6. עם זאת, כיוון שטכניקות אלה אינן זמינות בכל המתקנים, אנו ממליצים על מערך טומוגרפיה7 באמצעות הגנות סדרתיות ו-SEM. In מערך טומוגרפיה, מקטעים סידוריים לגזור באמצעות ultramicrotome מועברים שמיכות זכוכית במקום רשת TEM ודמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור SEM8. כדי לשפר את האות עבור הדמיה לאחור (bse) להדמיה, אנו מנוצלים באמצעות שימוש בפרוטוקול של כתמי EM באמצעות השימוש אוסמיום tetroxide (OsO4)-תאים קבועים עם osmi, thiolic הידרזידה (TCH)9, המאפשר לנו להשיג תמונות ללא כתמים כפולים שלאחר ההטבעה.
בנוסף, סמן מיטוכונדריאלי SCO1 (ציטוכרום c אוקסידאז הרכבה חלבון 1) – ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 תג מולקולרי שימש להמחיש המיטו, ברמת EM. APEX2 הוא כ 28 kDa ונגזר מ סויה ascorbate peroxidase11. זה פותחה כדי להראות את המיקום המפורט של חלבונים ספציפיים ברמה EM באותו אופן שבו חלבון פלורסנט ירוק מתויג חלבונים משמש במיקרוסקופ אור. APEX2 ממירה 3, 3 '-diaminobenzidine (בתוספת) לתוך פולימר מסיסים אוסמיפילית באתר של התג בנוכחות מימן הקופמי חמצן (H2O2). APEX2 יכול לשמש כחלופה לתיוג נוגדנים מסורתיים EM, עם לוקליזציה חלבון לאורך כל העומק של התא כולו. במילים אחרות, חלבון APEX2 מתויג יכול להיות מדמיינו על ידי ספציפי osmication11 ללא התוויות חיסוני והחדירות לאחר ההקפאה האולטרה. חזרת peroxidase (HRP) הוא גם תג רגיש אשר מזרז את ה-H2O התלויים החומר של התוספת לתוך מהפך מקומי, מתן ניגודיות EM לאחר הטיפול עם OsO4. רצף פפטיד היעד של המטרה HRP-KDEL (ליס-asp-לגלו-leu)12 הוחל על הדמיה של ER בתוך תא שלם. כדי להעריך את הפרוטוקול שלנו של ניצול התגים הגנטיים ואת הגוש בלוקים עם אוסמיום מופחת ו TCH (שיטת roto), באמצעות אפקט osmication באותו זמן, השוונו את הניגודיות הממברנה עם וללא שימוש של כל תג גנטי ב-roto בלוק בלוקים. למרות 3DEM עם טומוגרפיה מערך ו מכתים את השילוב עם איפקס ו HRP יש, בהתאמה, היה מנוצל למטרות אחרות, הפרוטוקול שלנו הוא ייחודי כי יש לנו מערך טומוגרפיה משולבת עבור 3DEM ו-מכתים את השילוב של המיטו, ותיוג ER. באופן ספציפי, הראנו חמישה תאים עם ובלי הגנים מתויגים איפקס באותו סעיף, אשר סייעה בחקירת ההשפעה של השינוי הגנטי על תאים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

מארגני הסלולר, כגון רשתית המיטובית והאנדופלמיק (ER), יוצרים רשת לביצוע מגוון פונקציות. מבנים אלה מעוקל במיוחד מקופלים לצורות שונות כדי ליצור רשת דינמית בהתאם לתנאים הסלולריים. הדמיה של רשת זו בין המיטוגרם ו-ER כבר ניסה להשתמש ברזולוציה סופר פלואורסצנטית הדמיה ומיקרוסקופ אור; עם זאת, הרזולוציה המוגבלת אינה מספיקה להתבונן בקרומים שבין המיטו, ו-ER בפרוטרוט. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור מספק ניגודיות ממברנה טובה רזולוציה בקנה מידה ננו להתבוננות של אורגלים סלולריים; עם זאת, היא צורכת זמן רב במיוחד כאשר מעריכים את מבנה תלת-מימדי (3D) של אורגלים מעוקלים במיוחד. לכן, הבחנו במבנה של המיטוסקופיה ו-ER באמצעות מיקרוסקופ האור אלקטרון (קלם) וטכניקות המיקרוסקופיה אלקטרונים באמצעות ascorbate peroxidase 2 משופר ומחזרת peroxidase צביעת. שיטה מכתימה בלוקים, מיקרוסקופ סדרתי דק (טומוגרפיה ממוחשבת), והמיקרוסקופיה אלקטרונית של אמצעי האחסון הוחלו כדי להתבונן במבנה התלת-ממדי. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של המיקרוסקופיה אלקטרון תלת-ממד כדי לבצע מחקרים מבניים מפורטים של המיטולוגיה ו-ER.

איור 1 מתאר את לוח הזמנים וזרימת העבודה עבור פרוטוקול זה. הפרוטוקול דורש 7 ימים; עם זאת, בהתאם לזמן שהושקע על הדמיה SEM, זה עשוי להגדיל. עבור העברה של תא, השטף של התאים צריך להיות נשלט כדי לא לכסות את החלק התחתון של לוח הרשת כולו (איור 1A). צפיפות תא גבוהה עלולה למנוע זיהוי של תא ה...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את התפלגות המיטוסקופיה ורשתית העין בתאים שלמים לאחר שינוי גנטי באמצעות מיקרוסקופ האור והנפח האלקטרונים כולל ascorbate peroxidase 2 ו לחזרת peroxidase צביעת, שינוי סדרתי של תאים עם ובלי גן היעד באותו מקטע, והדמיה טורית דרך אלקטרון מיקרוסקופ.

הדמיה של מיקרוסקופיה ואנדופלזמית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים באור ונפח

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

טכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים נפחית זו משמשת לביצוע מחקרים ביולוגיים הדורשים תצפית של מבנה תלת-מימדי. מציע מוט, תצוגת שדה ואחסון לדוגמה לפני שהתמונה תחזור. Fx2 Asan תכנן את שלבי הנתיב הממזמזמים את הדיבילציה כדי להגדיל את בדיקת האלקטרונים של מבני המטרה ונועץ להשתמש בהם כדי לאתר יעד מסוים של עניין.חלקיקים אלה משלבים את השימוש באור מאכל ובטכניקת מיקרוסקופ אלקטרונים תלת-מיתת כדי לחקור את האינטראקציות בין אורגנים ממברניים לתאים מארחים. 16 עד 24 שעות לאחר ההמרה, לשטוף בעדינות את התרבות עם 250 microliters של 30 עד 37 מעלות צלזיוס פתרון קיבוע. החלפת שטיפה במהירות עם 1.5 מיליליטר של פתרון קיבוע טרי, ומניחים את התרבות על הקרח במשך 30 דקות.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם שלוש עשר דקות שוטף במיליליטר אחד של קר כקרח 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחן לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, מוסיפים מיליליטר אחד של קרח קר 0 עד 4 מעלות צלזיוס 20 מילימולר גליצין פתרון למנה עבור דגירה של עשר דקות על קרח ואחריו שלוש חמש דקות שטיפה עם מיליליטר אחד של טרי, קר 0.1 חיץ נתרן קאודילאט טוחן לכל לשטוף. לאחר מכן, סמן את התאים עם 500 מיקרוליטרים של פתרון DAB שהוכן טרי.ולהידגר את התאים על קרח במשך כחמש עד ארבעים וחמש דקות. כאשר כתם חום בהיר נראה תחת מיקרוסקופ אור הפוך, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של טרי, קר 0.1 מאגר נתרן קאודילאט טוחן במשך עשר דקות לכל לשטוף. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך ניגודיות פאזה כדי לדמיין את ויטראז' ה- DAB בהגדלה של פי 100 ומעלה ולסמן את תחתית הזכוכית שבה ממוקם אזור העניין.להכנת דגימת בלוק מיקרוסקופ אלקטרונים, תחילה לאחר לתקן את התאים עם מיליליטר אחד של 2% מופחת osmium tetroxide במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. בסוף קיבעון, לשטוף את התאים עם שלוש שטיפות חמש דקות ומיליליטר אחד של מים מזוקקים טריים לכל לשטוף. לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של פתרון TCH מסונן במשך 20 דקות.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים כפי שהוכח רק ולתקן את התאים עם דגירה של 30 דקות ב 2% מופחת osmium tetroxide. בסוף קיבעון השני, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מים מזוקקים לכסות את התרבות עם מיליליטר אחד של אצטט 1%uranyl מימית לילה ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם מים מזוקקים לפני הכתם עם מיליליטר אחד של 60 מעלות צלזיוס חימם את הפתרון אספרטט עופרת של וולטון במשך 30 דקות בתנור 60 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים במים מזוקקים. ותדגירה את התרבות בסדרה מדורגת של 20 דקות 2 מיליליטר אתנול aliquots. לאחר החשיפה האחרונה של 100%אתנול, הדגירה את התאים במשך 30 דקות במיליליטר אחד של שלושה עד אחד אתנול צמיגות נמוכה הטממעת תערובת בינונית בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, להחליף את המדיום עם מיליליטר אחד של אתנול אחד לאחד כדי צמיגות נמוכה הטממעת תערובת בינונית עוד 30 דקות דגירה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את המדיום עם מילטר אחד של אתנול אחד עד שלושה צמיגות נמוכה הטממעת תערובת בינונית במשך 30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של 100% צמיגות נמוכה הטבעה בינונית לילה, ואחריו הטבעה של המדגם ב 100% צמיגות נמוכה להטמיע תערובת במשך 24 שעות ב 60 מעלות צלזיוס.לניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים שידור, למחרת, להשתמש microtome אולטרה כדי להשיג 90 ננומטר עבה חלקים ולצפות ברשת תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 200 קילו-וולט. לפני תחילת הכנת המדגם, נקי אינדיום בדיל אוקסיד מצופה כיסויי זכוכית עם תסיסה עדינה isopropanol במשך 30 עד 60 שניות. בסוף התסיסה, לנקז את האלכוהול העודף ולמקום את coverslips בסביבה ללא אבק.כאשר הכיסויים יבשים, השתמש במעיל פלזמה כדי לזהור את הכיסויים למשך דקה אחת. לאחר מכן הכנס את הכיסויים למחזיק המצע והנח את מחזיק המצע בסירת הסכין. כדי להשיג דגימות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, הכנס את בלוק הדגימה המוטבע למחזיק הדגימה של האולטרה-מיקרוטום.ולהגדיר את המחזיק לתוך בלוק גיזום. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את שרף עודף סביב מיקום היעד, כך הפנים של הבלוק רוכש צורה טרפז או מלבני. הקצוות המובילים והנגררים צריכים להיות מקבילים לחלוטין זה לזה.זה לא קל לרכוש מספר גדול של חלקים סידוריים. עם זאת, אתה צריך את הקצוות המובילים ואת הקצוות נגרר מקביל לחלוטין. לאחר מכן, הכנס את מחזיק הדגימה לזרוע האולטרה-מיקרוטום.מניחים את סכין היהלום במחזיק הסכין וממלאים את סירת הסכינים במים מזוקקים מסוננים. לאחר מכן, לחץ בזהירות על ידית המחזיק כדי להתאים את מיקום המוביל כך שקצה הכיסויים יהיה קרוב לסכין. לאחר קבלת הדגימה, לעצור את תהליך ההקטעה, לאט לפתוח את בורג ההידוק של הצינור לנקז את סירת המים.לאחר השלמת תהליך איסוף רצועת הכלים, הסר את המצע באמצעות נקודת האחיזה של התקן ההידוק וייבש את רצועת הכלים. השימוש בפלסמידים מתויגים גנטית המבטאים חלבונים מעניינים, מאפשר זיהוי של תאי היעד המעודפים לאחר הכתמת החלבונים המתויגים. לאחר מכן ניתן להשתמש במיקרוסקופ אלקטרונים אור מאכל כדי לדמיין עוד יותר את תרבות התא המסומן.לדוגמה, הכתם הכהה שנוצר על ידי SCO1-APEX2 נצפה אך ורק בחלל המיטוכונדריאלי הבין-ממברנה ולא בחלל המטריצה של המיטוכונדריה. פלסמידים של קוד מפוספס עם פלסמידים של SCO1-APEX2 ו-HRP-KDEL מבטאים אות אלקטרונים צפוף מאוד במרחב המיטוכונדריאלי הבין-ממברני וברשת האנדופלסמית. עם זאת, אין כתמי רטיקוליום אנדופלזמי הוא ציין בתאים כי הם מגולפים עם SCO1-APEX2 בלבד.להדמיה סדרתית על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, סקירה כללית של תמונת המערך כולה נוצרת באמצעות גלאי אלקטרונים אחורי על פני שטח גדול. לאחר מכן, אזור העניין ממוקם במקטע הראשון ומופצת לכל המקטעים האחרים. לבסוף, אזור העניין המכיל חמישה תאי יעד הוא בתמונה עם חמישה ננומטר פיקסלים בתמונה.ההגדלה חושפת מבנים תת-תאיים מפורטים כגון מנגנון גולגי, מיטוכונדריה ומרטיקוליום אנדפולסמי. הדמיה סדרתית מגלה בבירור כי מגעי ריקולום-מיטוכונדריה אנדופלזמית מתרחשים במישורי z שונים. אתה צריך הבנה טובה של איך לאתר מבנה יעד ספציפי באמצעות אור בקורלטיבי מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לחקור את ההשפעות של שינוי זהות ספציפי.טכניקות מכתים אלה בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים נפח יכול לשמש EM בקנה מידה גדול יותר כדי לחקור אינטראקציות הסלולר במיוחד eurovirus. זכור את glutaraldehyde, גם enteterocide ו TCH הם רעילים מאוד, כדי להיות בטוח ללבוש בגדים מגן ולעבוד ברדס אדים בעת שימוש בחומרים אלה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

הדמיה עמילואיד ברקמות מוכתם Oligothiophenes מצומדת זורח על ידי היפרספקטרליות קונאפוקלית מיקרוסקופ והדמיה שלמים קרינה פלואורסצנטית

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...