Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di base KBRI attraverso il Korea Brain Research Institute finanziato dal Ministero della Scienza e ICT (19-BR-01-08), e dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIT)(No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 e HRP-KDEL plasmids sono stati gentilmente forniti da Hyun-Woo Rhee (Seoul National University). I dati TEM sono stati acquisiti presso Brain Research Core Facilities in KBRI.

1. Coltura cellulare con piatto di coltura della griglia modellato e trasfezione cellulare con SCO1-APEX2 e vettore plasmid HRP-KDEL
<ol><li>Seme 1 x 105 cellule HEK293T mettendole in piatti di coltura con fondo griglia in vetro da 35 mm in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 a 37 gradi centigradi nel mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) integrato con 10% siero bovino fetale, 100 U/mL penicillina e 100 U/mL streptomycin.</li>
	<li>Il giorno dopo la semina delle cellule, quando so...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

Determinare la localizzazione cellulare di proteine specifiche a risoluzione di nanometri utilizzando EM è fondamentale per comprendere le funzioni cellulari delle proteine. In generale, ci sono due tecniche per studiare la localizzazione di una proteina bersaglio tramite EM. Una è la tecnica dell'immunogolda, che è stata utilizzata in EM dal 1960, e l'altra è una tecnica che utilizza tag geneticamente codificati di recente16. Le tecniche tradizionali di immunogold hanno impiegato particelle d...

I mitocondri e i reticoli endolasmici (ER) sono organelli cellulari legati alla membrana. La loro connessione è necessaria per la loro funzione, e le proteine legate alla loro rete sono state descritte1. La distanza tra i mitocondri e il ER è stata riportata come circa 100 nm utilizzando la microscopia luminosa2; tuttavia, recenti studi di microscopia a super-risoluzione3 ed elettroscopia (EM)4 hanno rivelato che è notevolmente più piccolo, a circa 10-25 nm. La risoluzione raggiunta nella microscopia a super-risoluzione è inferiore a EM ed è necessaria un'etichettatura specifica. EM è una tecnica adatta per ottenere un contrasto sufficientemente ad alta risoluzione per gli studi strutturali delle connessioni tra mitocondri e ER. Tuttavia, uno svantaggio è rappresentato dalle informazioni limitate sull'asse z, in quanto le sezioni sottili devono essere di circa 60 nm o più sottili per la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM). Per una sufficiente imaging dell'asse z EM, è possibile utilizzare la microscopia elettronica tridimensionale (3DEM)5. Tuttavia, questo comporta la preparazione di centinaia di sottili sezioni seriali di intere cellule, che è un lavoro molto difficile che solo pochi tecnologi qualificati hanno imparato. Queste sezioni sottili vengono raccolte su griglie TEM a foro rivestite con pellicola di forma fragile. Se il film si rompe su una cintura, l'imaging seriale e la ricostruzione del volume non sono possibili. La microscopia elettronica a scansione seriale a blocchi (SBEM) è una tecnica popolare per 3DEM che utilizza la sezionamento distruttivo del blocco all'interno della camera a vuoto del microscopio elettronico a scansione (SEM) con un coltello a diamante (Dik-SBEM) o un fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) 6. Tuttavia, poiché tali tecniche non sono disponibili in tutte le strutture, suggeriamo la tomografia array7 utilizzando il sezionamento seriale e SEM. Nella tomografia a matrice, le sezioni seriali tagliate con un ultramicrotoma vengono trasferite su una vetrina di vetro invece di una griglia TEM e visualizzate tramite microscopia leggera e SEM8. Per migliorare il segnale per l'imaging di elettroni backscatter (BSE), abbiamo utilizzato un protocollo di colorazioneen bloc EM che impiega cellule fisse osmioum tetrossido (OsO 4) con thiocarbohydrazide (TCH)9osmiofilia doppia colorazione post-incorporamento.
Inoltre, il marcatore mitocondriale SCO1 (proteina di assemblaggio citocromatico c ossidasi 1)– ascorbate peroxidase 2 (APEX2)10 tag molecolare è stato utilizzato per visualizzare i mitocondri a livello di EM. APEX2 è di circa 28 kDa ed è derivato da soia ascorbate perossidasi11. È stato sviluppato per mostrare la posizione dettagliata di proteine specifiche a livello EM nello stesso modo in cui la proteina con etichettatura proteica fluorescente verde viene utilizzata nella microscopia leggera. APEX2 converte 3,3' -diaminobenzidina (DAB) in un polimero osmiofilo insolubile nel sito del tag in presenza del cofattore di perossido di idrogeno (H2O2). APEX2 può essere utilizzato come alternativa all'etichettatura tradizionale degli anticorpi in EM, con una localizzazione delle proteine per tutta la profondità dell'intera cellula. In altre parole, la proteina con etichetta APEX2 può essere visualizzata mediante osmicazione specifica11 senza etichettatura immunogold e permeabilizzazione dopo l'ultracriosezione. La perossidasi di rafano (HRP) è anche un tag sensibile che catalizza la polimerizzazione dipendente da DAB H2O2in un precipitato localizzato, fornendo contrasto EM dopo il trattamento con OsO4. La sequenza di peptidi bersaglio ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 è stata applicata per visualizzare ER all'interno di un'intera cellula. Per valutare il nostro protocollo di utilizzo di tag genetici e di attenuazione in blocco con osmio ridotto e TCH (metodo rOTO), utilizzando l'effetto osmicazione allo stesso tempo, abbiamo confrontato il contrasto della membrana con e senza l'uso di ogni tag genetico in rOTO en bloc colorazione. Anche se 3DEM con tomografia array e colorazione DAB con APEX e HRP sono stati, rispettivamente, utilizzati per altri scopi, il nostro protocollo è unico perché abbiamo combinato la tomografia di array per la colorazione 3DEM e DAB per la colorazione dei mitocondri e del ER. In particolare, abbiamo mostrato cinque cellule con e senza geni etichettati con APEX nella stessa sezione, il che ha aiutato a studiare l'effetto della modificazione genetica sulle cellule.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

Gli organelli cellulari, come i mitocondri e il reticolo endolasmico (ER), creano una rete per svolgere una varietà di funzioni. Queste strutture altamente curve sono piegate in varie forme per formare una rete dinamica a seconda delle condizioni cellulari. La visualizzazione di questa rete tra mitocondri ed ER è stata tentata utilizzando l'imaging a fluorescenza a super-risoluzione e la microscopia leggera; tuttavia, la risoluzione limitata non è sufficiente per osservare in dettaglio le membrane tra i mitocondri e il ER. La microscopia elettronica a trasmissione fornisce un buon contrasto della membrana e una risoluzione su scala nanometrica per l'osservazione degli organelli cellulari; tuttavia, è eccezionalmente dispendioso in termini di tempo quando si valuta la struttura tridimensionale (3D) di organelli altamente curvi. Pertanto, abbiamo osservato la morfologia dei mitocondri e del ER attraverso la microscopia correlativa degli elettroni di luce (CLEM) e le tecniche di microscopia elettronica del volume utilizzando una maggiore perossia ascorbate 2 e la colorazione della perossia di rafano. Un metodo di colorazione en bloc, la sezionamento seriale ultrasottile (tomografia a matrice) e la microscopia elettronica del volume sono stati applicati per osservare la struttura 3D. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di microscopia elettronica CLEM e 3D per eseguire studi strutturali dettagliati di mitocondri ed ER.

Nella Figura 1 vengono descritti la pianificazione e il flusso di lavoro per questo protocollo. Il protocollo richiede 7 giorni; tuttavia, a seconda del tempo dedicato all'imaging SEM, questo può aumentare. Per la trafezione cellulare, la confluenza delle cellule deve essere controllata in modo da non coprire la parte inferiore dell'intera piastra della griglia (Figura 1A). Un'alta densità cellulare potrebbe impedire l'identificazione della cellula di interesse durante il microscopio l...

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Questa tecnica di microscopia elettronica a volume è usata per eseguire studi biologici che richiedono l'osservazione di una struttura 3D. Offre un'asta, una vista del fielder e una memoria di esempio prima che l'immagine ripresta. Fx2 Asan ha progettato gli stadi del percorso che catalizzano la deabilazione per aumentare il test elettronico delle strutture bersaglio e possono essere utilizzati per individuare uno specifico bersaglio di interesse.Queste particelle combinano l'uso della luce correlativa e della tecnica di microscopia elettronica 3D per indagare le interazioni tra organelli membrianosi e cellule ospiti. Da 16 a 24 ore dopo la trasfezione, lavare delicatamente la coltura con soluzione di fissaggio da 250 microlitri da 30 a 37 gradi Celsius. Sostituire rapidamente il lavaggio con 1,5 millilitri di soluzione di fissaggio fresco e mettere la coltura sul ghiaccio per 30 minuti.Alla fine dell'incubazione, sciacquare le cellule con tre lavaggi di dieci minuti in un millilitro di tampone di cacodilato di sodio molare 0,1 per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di ghiacciato da 0 a 4 gradi Celsius soluzione di glicina millimolare al piatto per un'incubazione di dieci minuti sul ghiaccio seguita da tre lavaggi di cinque minuti con un millilitro di tampone di cacodilato di sodio molare fresco e freddo 0,1 per lavaggio. Successivamente, etichettare le celle con 500 microlitri di soluzione DAB preparata al momento.E incubare le cellule sul ghiaccio per circa cinque-quarantacinque minuti. Quando una macchia marrone chiaro è visibile al microscopio a luce invertita, sciacquare le cellule tre volte con un millilitro di cacodilato di sodio molare fresco e freddo 0,1 per dieci minuti per lavaggio. Quindi, utilizzare un microscopio invertito a contrasto di fase per visualizzare la colorazione DAB con un ingrandimento 100 volte superiore o superiore e contrassegnare il fondo del vetro in cui si trova la regione di interesse.Per la preparazione del campione di blocchi al microscopio elettronico, prima post-fissare le cellule con un millilitro di tetrossido di osmio ridotto del 2% per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine della fissazione, sciacquare le cellule con tre lavaggi di cinque minuti e un millilitro di acqua distillata fresca per lavaggio. Prima di trattare le cellule con un millilitro di soluzione TCH filtrata per 20 minuti.Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in acqua distillata come appena dimostrato e fissare le cellule con un'incubazione di 30 minuti in tetrossido di osmio ridotto del 2%. Alla fine della seconda fissazione, lavare le cellule tre volte con acqua distillata e coprire la coltura con un millilitro di acetato acquoso dell'1%uranil durante la notte a 4 gradi Celsius protetto dalla luce. La mattina seguente, lavare le cellule tre volte con acqua distillata prima di macchiare con un millilitro di 60 gradi Celsius riscaldato la soluzione di aspartato di piombo di Walton per 30 minuti in un forno a 60 gradi Celsius.Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in acqua distillata. E incubare la coltura in una serie graduata di aliquote di etanolo da 20 minuti e 2 millilitri. Dopo l'ultima esposizione al 100% all'etanolo, incubare le cellule per 30 minuti in un millilitro da tre a uno etanolo a mezzo miscela incorporante a bassa viscosità a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione, sostituire il mezzo con un millilitro di etanolo uno-a-uno a mezzo miscela incorporante a bassa viscosità per un'altra incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, sostituire il mezzo con un millilter di etanolo uno-a-tre a mezzo miscela di incorporamento a bassa viscosità per altri 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sostituire il mezzo con un millilitro di mezzo di incorporamento di viscosità bassa al 100% durante la notte, seguito dall'incorporamento del campione in una miscela di incorporamento di viscosità bassa al 100% per 24 ore a 60 gradi Celsius.Per l'analisi della microscopia elettronica a trasmissione, il giorno successivo, utilizzare un ultra microtomo per ottenere sezioni spesse 90 nanometri e osservare la griglia sotto microscopia elettronica a trasmissione a 200 kilovolt. Prima di iniziare la preparazione del campione, pulire le coperture in vetro rivestito in ossido di stagno indio con delicata agitazione in isopropanolo per 30-60 secondi. Alla fine dell'agitazione, scolare l'alcol in eccesso e posizionare i copriparsi in un ambiente privo di polvere.Quando i copricapo sono asciutti, utilizzare un rivestimento al plasma per brillare scaricare i copricapo per un minuto. Quindi inserire le coverlips nel supporto del substrato e posizionare il supporto del substrato nella barca del coltello. Per ottenere campioni per la microscopia elettronica a scansione, inserire il blocco campione incorporato nel portacampioni dell'ultramicrotoma.E impostare il supporto nel blocco di taglio. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare via la resina in eccesso intorno alla posizione di destinazione in modo che la faccia del blocco acquisisca una forma trapezoidale o rettangolare. I bordi iniziali e d'avanguardia dovrebbero essere strettamente paralleli l'uno all'altro.Non è facile acquisire un gran numero di sezioni seriali. Tuttavia, è necessario avere i bordi iniziali e gli spigoli d' trainato completamente paralleli. Quindi, inserire il portacampioni nel braccio dell'ultramicrotomo.Posizionare il coltello diamantato nel portapenne e riempire la barca del coltello con acqua distillata filtrata. Quindi, spingere con attenzione la maniglia del supporto per regolare la posizione del supporto in modo che il bordo dei copripavimenti sia vicino al coltello. Dopo aver ottenuto il campione, interrompere il processo di sessatura, aprire lentamente la vite di bloccaggio del tubo e drenare la barca ad acqua.Al termine del processo di raccolta del nastro, rimuovere il substrato con la maniglia del dispositivo di bloccaggio e asciugare il nastro. L'uso di plasmidi geneticamente taggati che esprimono proteine di interesse, consente l'identificazione delle cellule bersaglio trasfette dopo la colorazione per le proteine taggate. La microscopia elettronica a luce correlativa può quindi essere utilizzata per visualizzare ulteriormente la coltura cellulare etichettata.Ad esempio, la macchia scura generata da SCO1-APEX2 è osservata esclusivamente nello spazio intermembrana mitocondriale e non nello spazio matriciale dei mitocondri. Le cellule trasfette di codice con plasmidi SCO1-APEX2 e HRP-KDEL esprimono un segnale elettronico altamente denso nello spazio intermembrana mitocondriale e nel reticolo endoplasmatico. Tuttavia, nessuna colorazione del reticolo endoplasmatico si osserva nelle cellule che sono trasfette solo con SCO1-APEX2.Per l'imaging seriale mediante microscopia elettronica a scansione, viene creata una panoramica dell'intera immagine dell'array utilizzando un rivelatore di elettroni backscatter su una vasta area. Successivamente, la regione di interesse viene posizionata nella prima sezione e propagata a tutte le altre sezioni. Infine, l'area di interesse contenente cinque celle di destinazione viene immagine con cinque pixel di immagine nanometrici.L'ingrandimento rivela strutture subcellulari dettagliate come l'apparato di Golgi, i mitocondri e il reticolo endpolasmico. L'imaging seriale rivela chiaramente che i contatti endoplasmatici tra reticolo e mitocondri si verificano su diversi piani z. Dovresti avere una buona comprensione di come localizzare una specifica struttura bersaglio usando la luce correlativa e la microscopia elettronica per indagare gli effetti di una specifica modifica dell'identità.Queste tecniche di colorazione combinate con la microscopia elettronica a volume potrebbero essere utilizzate per i mercati emergenti su larga scala per studiare le interazioni cellulari in particolare nell'eurovirus. Ricorda che la glutaraldeide, anche l'enteterocida e il TCH sono molto tossici, quindi assicurati di indossare indumenti protettivi e di lavorare in una cappa aspirante quando usi questi materiali.

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