Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
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本研究は、科学・ICT省(19-BR-01-08)の助成を受けた韓国脳研究所(19-BR-01-08)と、韓国政府(MSIT)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けたKBRI基礎研究プログラム(No)の支援を受けています。2019R1A2C1010634) SCO1-APEX2とHRP-KDELプラスミドは、ヒョンウ・リー(ソウル大学)によって親切に提供されました。TEMデータは、KBRIの脳研究コア施設で取得されました。

1. SCO1-APEX2およびHRP-KDELプラスミドベクターを用いたパターングリッド培養皿および細胞トランスフェクションを用いた細胞培養
<ol><li>種子1 x 105 HEK293T細胞を35mmガラス格子底培養食に置き、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で37°Cで5%CO2を含む加湿雰囲気中に置き、10%の胎児ウシ血清、100U/mLを補充した。ペニシリン、および100 U/mL連鎖虫菌。</li>
	<li>細胞を播種した翌日、50%...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

EMを用いたナノメートル分解能で特定のタンパク質の細胞局在を決定することは、タンパク質の細胞機能を理解するために重要です。一般に、EMを介した標的タンパク質の局在化を研究する2つの技術がある。一つは、1960年からEMで使用されている免疫金技術であり、もう一つは最近開発された遺伝子組み換えタグ16を用いた技術である。従来の免疫ゴールド技術は、標識タン...

ミトコンドリアおよび小プラズム網膜(ER)は、膜結合細胞小器官である。その接続は、その機能のために必要であり、彼らのネットワークに関連するタンパク質は1について説明されています。ミトコンドリアとERの間の距離は、光顕微鏡2を用いて約100nmと報告されている。しかし、最近の超解像顕微鏡3および電子顕微鏡(EM)4の研究は、約10〜25nmでかなり小さいことを明らかにした。超解像顕微鏡で達成される分解能はEMより低く、特異的な標識が必要である。EMは、ミトコンドリアとERとの間の接続の構造研究に十分に高分解能コントラストを達成するのに適した技術である。しかし、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)では薄い切片が約60nmまたは薄くなければならないため、Z軸情報が限られているのが不利です。十分なEM Z軸イメージングのために、3次元電子顕微鏡(3DEM)を使用することができる5.しかし、これは、少数の熟練した技術者だけが習得した非常にトリッキーな作業である、細胞全体の薄いシリアルセクションの数百の準備を含みます。これらの薄いセクションは壊れやすいフォルバーフィルムコーティングされた1穴TEMグリッドに集められている。フィルムが1つのガードで壊れた場合、シリアルイメージングとボリュームの再構築は不可能です。シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBEM)は、ダイヤモンドナイフ(Dik-SBEM)または集集型イオンビーム(FIB-SEM)のいずれかで走査型電子顕微鏡(SEM)真空チャンバ内の破壊的なブロック断面を使用する3DEMの一般的な技術です。6.しかし、これらの技術はすべての施設で利用できないため、シリアル断面とSEMを使用して配列断層撮影7を提案します。アレイ断層撮影では、超マイクロトームを使用して切断されたシリアルセクションは、TEMグリッドの代わりにガラスカバースリップに転送され、光顕微鏡とSEM8を介して視覚化されます。バックスキャッタ電子(BSE)イメージングのシグナルを増強するために、四酸化オスミウム(OsO4)固定細胞を用いたen blocEM染色プロトコルを利用し、オスミオフィリックチオカルボヒドラジエード(TCH)9を用いて画像を得ることを可能にした。ポスト埋め込み二重染色。
さらに、ミトコンドリアマーカーSCO1(シトクロムcオキシダーゼ集合タンパク質1)-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2(APEX2)10分子タグを用いて、EMレベルでミトコンドリアを可視化した。APEX2は約28kDaであり、大豆アスコルビン酸ペルオキシダーゼ11に由来する。これは、光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質タグ付きタンパク質が使用されるのと同じ方法で、EMレベルでの特定のタンパク質の詳細な位置を示すために開発されました。APEX2は、3,3' -ジアミノベンジジン(DAB)を、過酸化水素(H2O2)の存在下でタグの部位で不溶性オスミオフィリックポリマーに変換する。APEX2は、細胞全体の深さを通してタンパク質局在化を伴うEMにおける従来の抗体標識の代替として使用することができる。言い換えれば、APEX2タグ付きタンパク質は、超凍結切除後の免疫金標識および透過化なしに、特定の浸透11によって可視化することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)はまた、H2O-依存性重合DABを局所沈殿物に触媒する敏感なタグであり、OsO4による処理後のEMコントラストを提供する。ER標的ペプチド配列HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)12を用い、細胞全体でERを可視化した。減少したオスミウムおよびTCH(rOTO法)を用いた遺伝的タグおよびenブロック染色を利用する我々のプロトコルを評価するために、同時にオスミケーション効果を用いて、rOTO enブロック染色における各遺伝的タグの使用の有無にかかわらず膜コントラストを比較した。 アレイ断層撮影とAPEXおよびHRPによるDAB染色を用いた3DEMは、それぞれ他の目的のために利用されていますが、ミトコンドリアおよびERラベリング用の3DEMとDAB染色用の配列断層撮影を組み合わせたため、当社のプロトコルはユニークです。具体的には、APEXタグ付き遺伝子の有無にかかわらず5つの細胞を同じセクションで示し、細胞に対する遺伝子改変の効果を調べに役立った。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

ミトコンドリアや小プスミック網膜(ER)などの細胞小器官は、様々な機能を実行するネットワークを作成します。これらの高度に湾曲した構造は、細胞の状態に応じて動的ネットワークを形成するために様々な形状に折り畳まれています。ミトコンドリアとERの間のこのネットワークの可視化は、超解像蛍光イメージングと光顕微鏡を用いて試みられた。しかし、限られた分解能は、ミトコンドリアとERの間の膜を詳細に観察するには不十分である。透過電子顕微鏡は、細胞小器官の観察のための良好な膜コントラストとナノメートルスケールの分解能を提供します。しかし、高度に湾曲した小器官の3次元(3D)構造を評価する場合、非常に時間がかかります。そこで、強化されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ2とワサビペルオキシダーゼ染色を用いて、相対光電子顕微鏡(CLEM)と体積電子顕微鏡技術を用いてミトコンドリアとERの形態を観察した。enブロック染色法、超薄型連続断面(アレイ断層撮影)、体積電子顕微鏡を用いて3D構造を観察した。このプロトコルでは、ミトコンドリアとERの詳細な構造研究を行うためにCLEMと3D電子顕微鏡の組み合わせを提案する。

図 1は、このプロトコルのスケジュールとワークフローについて説明します。プロトコルは7日間必要です。ただし、SEM イメージングに費やされる時間によっては、この値が増加する可能性があります。細胞透過のために、細胞の合流は、グリッドプレート全体の底部を覆わないように制御されるべきである(図1A)。高い細胞密度は、光顕微鏡およびEM観察の間に目的?...

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

この体積電子顕微鏡法は、3次元構造の観察を必要とする生物学的研究を行うために使用される。イメージを取り返す前にロッド、野手ビュー、サンプルストレージを提供します。Fx2 Asanは、脱衰弱を触媒してターゲット構造の電子試験を増加させ、特定の対象を特定するために使用できるパスステージを設計しました。これらの粒子は、相関光と3次元電子顕微鏡技術を組み合わせて、膜状の小器官と宿主細胞の相互作用を調べる。トランスフェクション後16~24時間、250マイクロリットルの30~37度の固定液で培養液を静かに洗浄します。洗浄液を1.5ミリリットルの新鮮な固定溶液に素早く交換し、培養液を氷の上に30分間置く。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき氷冷0.1モルカコチル酸緩衝液の1ミリリットルで30分間の洗浄で細胞をすすぐ。最後の洗浄の後、氷冷0〜4度20ミリモルグリシン溶液を1ミリリットル加え、氷の上に10分間のインキュベーションを行い、その後、洗浄ごとに新鮮で冷たい0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液を1ミリリットルで3回5分間洗浄します。次に、500マイクロリットルの新しく調製されたDAB溶液で細胞にラベルを付けます。そして、約5〜45分間氷上の細胞をインキュベートします。逆光顕微鏡下で薄茶色の汚れが見える場合は、1回の洗浄で1ミリリットルの新鮮な冷たい0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液で細胞を3回洗い流します。次に、位相差反転顕微鏡を使用して、DAB染色を100倍以上の倍率で可視化し、対象領域が配置されているガラスの底部に印を付けます。電子顕微鏡用ブロック試料調製物については、まず、4度で1時間四酸化オスミウムを2%減少させた1ミリリットルで細胞を後固定する。固定の終わりに、3回の5分間の洗浄と1回の新鮮な蒸留水で細胞を洗い流します。20分間濾過TCH溶液の1ミリリットルで細胞を処理する前に.インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように蒸留水で細胞を3回洗浄し、2%減少した四酸化オスミウムで30分のインキュベーションで細胞を固定します。2回目の固定の終わりに、蒸留水で細胞を3回洗浄し、1ミリリットルの酢酸水溶液を光から保護した摂氏4度で一晩で覆います。翌朝、60度の1ミリリットルの摂氏1ミリリットルで染色する前に、蒸留水で細胞を3回洗い、ウォルトンの鉛アスパラギンス溶液を60°Cのオーブンで30分間温めた。インキュベーションの終わりに、蒸留水で細胞を3回洗浄します。20分2ミリリットルエタノールアリコートのグレードシリーズで培養を行います。最後の100%エタノール暴露後、3~1エタノールの1ミリリットルで30分間、室温で低粘度埋め込み混合物培地にインキュベートする。インキュベーションの終了時に、培地を1対1のエタノールの1ミリリットルに置き換え、室温でさらに30分間インキュベーションするために低粘度埋め込み混合物培地にします。次に、培地を1~3個のエタノールの1ミリルターで、低粘度埋め込み混合物培地に対して、室温でさらに30分間交換する。次いで、培地を1ミリリットルの100%低粘度埋め込み培地で一晩交換し、続いて、60°Cで24時間混合した低粘度でサンプルを埋め込む。透過型電子顕微鏡分析では、翌日、超ミクロトームを使用して90ナノメートルの厚い切片を得て、200キロボルトの透過電子顕微鏡下でグリッドを観察します。サンプル調製を開始する前に、きれいなインジウムスズオキシドは30〜60秒間イソプロパノールで穏やかな攪拌でガラスカバーリップをコーティングしました。攪拌の終わりに、余分なアルコールを排出し、ほこりのない環境にカバーリップを置きます。カバーリップが乾燥しているときは、プラズマコーターを使用してカバーリップを1分間放電します。次にカバーリップを基板ホルダーに挿入し、基板ホルダーをナイフボートに入れます。走査型電子顕微鏡のサンプルを得るために、埋め込まれたサンプルブロックをウルトラミクロトームのサンプルホルダーに挿入します。そして、ホルダーをトリミングブロックにセットします。カミソリの刃を使用して、ブロックの面が台形または長方形になるように、ターゲット位置の周りに余分な樹脂をトリミングします。先頭と末尾のエッジは、互いに厳密に平行にする必要があります。多数のシリアルセクションを取得するのは容易ではありません。ただし、リーディング エッジと後続エッジは完全に平行である必要があります。次に、サンプルホルダーをウルトラミクロトームのアームに挿入します。ナイフホルダーにダイヤモンドナイフを入れ、ナイフボートにろ過蒸留水を入れます。次に、ホルダーのハンドルを慎重に押して、カバーリップの端がナイフに近づくようにキャリアの位置を調整します。サンプルを入手した後、切り抜きプロセスを停止し、チューブのクランプスクリューをゆっくりと開け、水上ボートを排出します。リボンの収集プロセスが完了したら、クランプ装置のハンドルで基板を取り外し、リボンを乾かします。目的のタンパク質を発現する遺伝的にタグ付きプラスミドを用い、タグ付きタンパク質の染色後にトランスフェクトされた標的細胞の同定を可能にする。その後、コ相対光電子顕微鏡法を用いて、標識された細胞培養をさらに可視化することができる。例えば、SCO1-APEX2によって生成された暗い汚れは、ミトコンドリアのマトリックス空間ではなくミトコンドリア膜間空間においてのみ観察される。コードトランスフェクト細胞は、SCO1-APEX2およびHRP-KDELプラスミドの両方を用いて、ミトコンドリア膜間空間および小胞体において高密度の電子信号を発現する。しかし、SCO1-APEX2にトランスフェクトされた細胞では小胞体染色は認められていない。走査型電子顕微鏡による逐次イメージングでは、大面積の後方散乱電子検出器を用いてアレイ全体の画像全体の概要を作成します。次に、対象となる領域が最初のセクションに配置され、他のすべてのセクションに反映されます。最後に、5つの標的細胞を含む対象領域を5ナノメートルの画像化されたピクセルで画像化する。拡大は、ゴルジ装置、ミトコンドリア、およびエンドポラス系レチクルムなどの詳細な細胞下構造を明らかにする。シリアルイメージングは、異なるZプレーンで小胞子ミトコンドリア接点が起こることを明確に明らかにします。相関光と電子顕微鏡を使用して特定のターゲット構造を特定の識別法の影響を調べる方法を理解しておく必要があります。これらの染色技術と体積電子顕微鏡を組み合わせることで、特にユーロウイルスにおける細胞相互作用を調査するために、より大きなスケールのEMに使用できる。グルタルアルデヒド、またエンテロサイドおよびTCHは非常に有毒ですので、防護服を着用し、これらの材料を使用する際にヒュームフードで動作するようにしてください覚えておいてください。

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Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

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Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

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The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子線トモグラフィー用デュアルビーム走査電子顕微鏡を用いたガラス質生体試料からのラメラの調製(英語)

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...