Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
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이 연구는 한국과학기술정보통신부(19-BR-01-08)의 지원을 받는 한국뇌연구원과 한국정부(MSIT)의 후원을 받은 한국뇌연구원(NRF)을 통해 지원되었다. 2019R1A2C10634). SCO1-APEX2와 HRP-KDEL 플라스미드는 이현우(서울대학교)가 친절하게 제공했다. TEM 데이터는 KBRI의 뇌 연구 핵심 시설에서 수집되었습니다.

1. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드 벡터를 가진 패턴격자 배양 접시 및 세포 형질혈을 가진 세포 배양
<ol><li>종자 1 x 105 HEK293T 세포는 Dulbecco의 수정 된 독수리 배지 (DMEM)에서 37 °C에서 5 % CO2를 포함하는 가습 된 분위기에서 35mm 유리 그리드 바닥 배양 접시에 배치하여 10 % 태아 소 혈청, 100 U / mL로 보충했습니다. 페니실린, 및 100 U / mL 연쇄상 구균.</li>
	<li>세포를 파종 한 다음 날, 50 %-...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

EM을 사용하여 나노미터 해상도에서 특정 단백질의 세포 국소화를 결정하는 것은 단백질의 세포 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 일반적으로 EM을 통해 표적 단백질의 국소화를 연구하는 두 가지 기술이 있다. 하나는 1960년부터 EM에서 사용되어 온 면역골 기술이며, 다른 하나는 최근에 개발된 유전자 부호타호16을사용하는 기술이다. 전통적인 면역금 기술은 표지된 단백질?...

미토콘드리아및기관망망소(ER)는 막결합 세포소기관입니다. 그들의 연결은 그들의 기능에 필요하고, 그들의 네트워크와관련있는 단백질은 1을 기술되었습니다. 미토콘드리아와 ER 사이의 거리는 가벼운 현미경 검사법을 사용하여 약 100 nm로 보고되었습니다2; 그러나, 최근 초고해상도 현미경 검사법3 및 전자 현미경 검사법 (EM)4 연구 결과는 대략 10-25 nm에서 상당히 더 작은 것으로 나타났습니다. 초고해상도 현미경 검사법에서 달성된 분해능은 EM보다 낮으며 특정 라벨링이 필요합니다. EM은 미토콘드리아와 ER 사이의 연결에 대한 구조적 연구를 위해 충분히 고분해능 대비를 달성하기에 적합한 기술이다. 그러나, 종래의 투과 전자현미경(TEM)의 경우 얇은 단면이 약 60 nm 또는 더 얇아야 하기 때문에 제한된 z축 정보가 제한된 단점이다. 충분한 EM z 축 화상 진찰을 위해, 3차원 전자 현미경검사법 (3DEM)는 5를 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 단지 몇몇 숙련된 기술자가 마스터한 아주 까다로운 일인 전체 세포의 얇은 직렬 단면도의 수백의 준비를 관련시킵니다. 이러한 얇은 섹션은 깨지기 쉬운 formvar 필름 코팅 한 홀 TEM 그리드에 수집됩니다. 필름이 하나의 거드에서 파손되면 직렬 이미징 및 볼륨 재구성이 불가능합니다. 직렬 블록-얼굴 주사 전자 현미경 검사법 (SBEM)은 다이아몬드 나이프 (Dik-SBEM) 또는 초점 이온 빔 (FIB-SEM) 중 하나와 주사 전자 현미경 (SEM) 진공 챔버 내부 파괴적인 enbloc 절편을 사용하는 3DEM에 대한 인기있는 기술입니다 6. 그러나 이러한 기술은 모든 시설에서 사용할 수 없기 때문에 직렬 단면 및 SEM을 사용하여 배열 단층 촬영 7을 권장합니다. 어레이 단층 촬영에서, 울트라 마이크로 톰을 사용하여 절단 된 직렬 섹션은 TEM 그리드 대신 유리커버 슬립으로 전송되고 빛 현미경 검사법 및 SEM 8을 통해 시각화됩니다. 백스캐터 전자(BSE) 이미징신호를 향상시키기 위해 오스뮴 테트옥사이드(OsO 4)-오스미오필릭티오카르보하이드라지드(TCH) 9를 사용하는 고정형 세포를활용한 엔블록 EM 염색 프로토콜을 활용하여, 없이 이미지를 얻을 수 있게 되었습니다. 포스트 임베딩 이중 염색.
부가적으로, 미토콘드리아 마커 SCO1(시토크롬 c 산화다아제 어셈블리 단백질 1)-아스코르브베이트 과산화아제 2(APEX2)10 분자 태그를 EM 수준에서 미토콘드리아를 가시화하는 데 사용되었다. APEX2는 약 28 kDa이며 대두 아스코르브베이트 과산화수지11에서 유래된다. 녹색 형광 단백질 태그 단백질이 가벼운 현미경 검사법에서 사용되는 것과 같은 방식으로 EM 수준에서 특정 단백질의 상세한 위치를 보여주기 위해 개발되었습니다. APEX2는 3,3' -다미노벤지딘(DAB)을 공동인자 과산화수소(H2O2)의 존재 시 태그 부위에 불용성OSMiophilic 폴리머로 변환합니다. APEX2는 EM에서 전통적인 항체 라벨링의 대안으로 사용될 수 있으며, 전체 세포의 깊이에 걸쳐 단백질 국소화를 할 수 있다. 즉, APEX2 태그가 부착된 단백질은 초저온 절제 후 면역골 표지 및 투과없이 특이적 삼투압(11)에 의해 가시화될 수 있다. 고추냉이 과산화 효소(HRP)는 또한 H2O2-의존적DAB를 국부화된 침전물 내로 촉매시키는 민감한 태그이며, OsO4로처리한 후 EM 대비를 제공한다. ER 표적 펩티드 서열 HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)(12)을 전체 세포 내에서 ER을 시각화하기 위해 적용하였다. 감소된 오스뮴 및 TCH(rOTO 방법)로 유전적 태그 및 enbloc 염색을 활용하는 우리의 프로토콜을 평가하기 위해, 동시에 삼투유 효과를 사용하여, 우리는 rOTO en bloc 염색에서 각 유전자 태그의 사용 없이 막 대비를 비교하였다. APEX 및 HRP를 가진 배열 단층 촬영 및 DAB 염색을 가진 3DEM이 각각, 그밖 목적을 위해 이용되었더라도, 우리가 미토콘드리아와 ER 라벨링을 위한 3DEM및 DAB 염색을 위한 배열 단층 촬영을 결합했기 때문에 우리의 프로토콜은 유일합니다. 특히, 우리는 세포에 대한 유전자 변형의 효과를 조사하는 데 도움이 같은 섹션에서 APEX 태그 유전자없이 다섯 세포를 보여 주었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

미토콘드리아 및 기관망망(ER)과 같은 세포 소기관은 다양한 기능을 수행하는 네트워크를 만듭니다. 이러한 고곡선 구조는 셀룰러 조건에 따라 동적 네트워크를 형성하기 위해 다양한 모양으로 접혀 있습니다. 미토콘드리아와 ER 사이 이 네트워크의 가시화는 초고해상도 형광 화상 진찰 및 광 현미경 검사법을 사용하여 시도되었습니다; 그러나, 제한된 해결책은 미토콘드리아와 ER 사이 막을 상세히 관찰하기에 불충분하다. 전송 전자 현미경 검사법은 세포 소기관의 관찰을 위한 좋은 막 대조 및 나노미터 규모 해결책을 제공합니다; 그러나 고곡선 소기관의 3차원(3D) 구조를 평가할 때 는 매우 시간이 많이 걸립니다. 따라서, 우리는 강화된 아스코르브베이트 과산화공2 및 고추냉이 과옥시다아제 염색을 사용하여 상관경연산빛전자현미경법(CLEM) 및 부피 전자현미경기술을 통해 미토콘드리아와 ER의 형태를 관찰하였다. 3D 구조를 관찰하기 위해 엔블록 염색 방법, 초박형 직렬 단면화(배열 단층 촬영) 및 부피 전자 현미경을 적용하였다. 이 프로토콜에서는, 우리는 미토콘드리아와 ER의 상세한 구조적인 연구를 능력을 발휘하기 위하여 CLEM와 3D 전자 현미경 검사법의 조합을 건의합니다.

그림 1은 이 프로토콜의 일정및 워크플로를 설명합니다. 프로토콜은 7 일이 필요합니다. 그러나 SEM 이미징에 소요된 시간에 따라 증가할 수 있습니다. 세포 형질감염의 경우, 세포의 결합은 전체 그리드 플레이트의 바닥을 덮지 않도록 제어되어야 한다(도1A). 높은 세포 밀도는 빛 현미경 및 EM 관찰 도중 관심 있는 세포의 확인을 방지할 수 있었습니다. 우리는 배양 접시에 ...

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

우리는 아스코르바테 과산화수역 2 및 고추냉이 과산화증 염색을 포함하는 상관경 및 부피 전자 현미경을 사용하여 유전자 변형 후 전체 세포에서 미토콘드리아 및 호반 망상염식의 분포를 연구하는 프로토콜을 제시하고, 동일한 섹션에 있는 표적 유전자의 유무에 관계없이 세포의 직렬 단면도, 및 전자 현미경 검사법을 통해 직렬 화상 진찰.

미토콘드리아 및 코피포지티컬 라이트 및 부피 전자 현미경에 의한 산후성 망상 이미징

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

이 부피 전자 현미경 기술은 3-D 구조의 관찰을 요구하는 생물학 연구를 능력을 발휘하기 위하여 이용됩니다. 이미지를 다시 보기 전에 로드, 필더 뷰 및 샘플 저장소를 제공합니다. Fx2 Asan은 타깃 구조물의 전자 시험을 증가시키기 위하여 디아빌레이션을 촉매하고 관심있는 특정 표적을 찾아내는 데 사용될 수 있는 경로 단계를 설계했습니다.이 입자는 관상 동맥 및 호스트 세포 사이 상호 작용을 조사하기 위하여 상대성 빛 및 3-D 전자 현미경 기술의 사용을 결합합니다. 이식 후 16~24시간, 섭씨 30~37도의 250마이크로리터로 컬쳐를 부드럽게 세척합니다. 세척을 신선한 고정 용액 1.5 밀리리터로 신속하게 교체하고 문화를 얼음에 30 분 동안 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 세척당 0.1 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼의 1 밀리리터로 31분 세척으로 세포를 헹구는 다. 마지막 세척 후, 얼음 차가운 0 ~4도 20 밀리머 글리신 용액1 밀리리터를 얼음에 10 분 동안 접시에 넣고 1 밀리리터를 얼음에 넣고 1 밀리리터를 씻어 내고, 세척당 1 밀리리터의 신선하고 차가운 0.1 어금니 나트륨 카코디레이트 버퍼로 3 밀리리터를 씻어 넣습니다. 다음으로, 갓 준비된 DAB 용액 500마이크로리터로 셀에 라벨을 붙입니다.그리고 약 5 ~45 분 동안 얼음에 세포를 배양. 밝은 갈색 얼룩이 반전 된 빛 현미경으로 볼 때, 세척 당 10 분 동안 신선한, 차가운 0.1 어금니 나트륨 cacodylate 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세 번 헹구세요. 이어서, 위상 대비 반전 현미경을 사용하여 DAB 염색을 100배 이상으로 시각화하고 관심 영역이 있는 유리의 바닥을 표시한다.전자 현미경 블록 샘플 제제의 경우, 먼저 섭씨 4도에서 1 시간 동안 2 %의 1 밀리리터로 세포를 수정합니다. 고정이 끝나면 세워서 3개의 5분간 세척하고 세척당 신선한 증류수 1밀리리터로 세포를 헹구습니다. 20 분 동안 여과 된 TCH 용액의 1 밀리리터로 세포를 치료하기 전에.인큐베이션이 끝나면, 단지 입증된 대로 증류수에서 세포를 세 번 씻고 2% 감소된 오스뮴 테트산화물에서 30분 배양으로 세포를 고정시한다. 두 번째 고정의 끝에서, 증류수로 세포를 세 번 세척하고 빛으로부터 보호 섭씨 4섭씨에서 하룻밤 수성 1 %uranyl 아세테이트의 1 밀리리터로 문화를 커버. 다음 날 아침, 60도의 1밀리리터로 스테인싱하기 전에 증류수로 셀을 세 번 씻은 후 60도 오븐에서 30분 동안 월튼의 납 아스파트로 사용할 수 있습니다.인큐베이션이 끝나면 증류수로 셀을 세 번 씻으실 수 있습니다. 그리고 20 분 2 밀리리터 에탄올 알리 쿼트의 등급 시리즈에서 문화를 배양. 마지막 100% 에탄올 노출 후, 실온에서 혼합물 매체를 낮은 점도 에탄올에 3-1의 1 밀리리터에서 30분 동안 세포를 배양한다.인큐베이션의 끝에서, 저점도 에탄올의 1 밀리리터로 배지를 실온에서 30분 간 배양하는 혼합물 배지로 교체한다. 다음으로, 저점도 포함 혼합물 배지에 1-3 에탄올의 1밀리터로 배지를 실온에서 30분 간 추가로 교체한다. 이어서, 배지를 100% 낮은 점도 포함 매체의 1밀리리터로 교체하고, 그 다음에 는 60°C에서 24시간 동안 100% 낮은 점도 포함 혼합물에 샘플을 포함시키는 것이다.전송 전자 현미경 분석을 위해, 다음 날, 초미세 토메를 사용하여 90 나노미터 두께의 단면을 얻고 200 킬로볼트에서 투과 전자 현미경 검사법의 밑에 그리드를 관찰하십시오. 시료 준비를 시작하기 전에, 30~60초 동안 이소프로파놀에 부드러운 교반으로 인듐 틴 옥사이드 코팅 유리 커버립을 세척합니다. 동요의 끝에서, 여분의 알코올을 배출하고 먼지가없는 환경에 커버립을 배치합니다.커버립이 건조하면 플라즈마 코터를 사용하여 1분 동안 커버립을 배출합니다. 그런 다음 커버립을 기판 홀더에 삽입하고 기판 홀더를 칼 보트에 넣습니다. 전자 현미경 검사용 샘플을 얻으려면 내장된 샘플 블록을 초미세토메의 샘플 홀더에 삽입합니다.그리고 트리밍 블록에 홀더를 설정합니다. 면도날을 사용하여 블록의 면이 사다리꼴 또는 직사각형 모양을 획득하도록 대상 위치 주위의 과잉 수지를 다듬습니다. 선행 및 후행 가장자리는 서로 엄격하게 평행해야 합니다.많은 수의 일련 섹션을 획득하는 것은 쉽지 않습니다. 그러나 선행 가장자리와 후행 모서리가 완전히 평행해야 합니다. 다음으로, 초미세토메의 암에 샘플 홀더를 삽입한다.다이아몬드 나이프를 칼 홀더에 놓고 칼보트를 여과된 증류수로 채웁니다. 그런 다음 홀더의 손잡이를 조심스럽게 밀어 캐리어 위치를 조정하여 커버의 가장자리가 칼에 가깝도록 합니다. 샘플을 얻은 후 단면 공정을 멈추고 천천히 튜브의 클램핑 나사를 열고 물 보트를 배출하십시오.리본 수집 프로세스가 완료되면 클램핑 장치의 핸들로 기판을 제거하고 리본을 건조시다. 관심있는 단백질을 표현하는 유전 태그 플라스미드의 사용은 태그 된 단백질에 대한 염색 후 전염 된 표적 세포의 식별을 허용합니다. 코르상대광 전자 현미경 검사는 표지된 세포 배양을 더 시각화하기 위해 사용될 수 있다.예를 들어, SCO1-APEX2에 의해 생성된 어두운 얼룩은 미토콘드리아의 매트릭스 공간이 아닌 미토콘드리아 간 공간에서 독점적으로 관찰된다. SCO1-APEX2 및 HRP-KDEL 플라스미드를 모두 가진 코드 전염된 세포는 미토콘드리아 막 공간과 내시경 망상에서 고밀도 전자 신호를 나타낸다. 그러나, SCO1-APEX2로만 전염되는 세포에서는 뇌성 망상 염색이 관찰되지 않는다.전자 현미경 검사를 스캔하여 직렬 이미징의 경우 넓은 영역에 백스캐터 전자 검출기를 사용하여 전체 어레이 이미지에 대한 개요가 만들어집니다. 다음으로 관심 영역은 첫 번째 섹션에 배치되고 다른 모든 섹션에 전파됩니다. 마지막으로, 5개의 표적 세포를 포함하는 관심 영역은 5나노미터 이미지 픽셀로 심화된다.배율은 골기 장치, 미토콘드리아 및 종말 망상과 같은 상세한 세포 극체 구조를 보여줍니다. 연쇄 화상 진찰은 명확하게 풍요의 망상 -미토콘드리아 접촉이 다른 z-비행기에서 발생한다는 것을 보여줍니다. 특정 ID 수정의 효과를 조사하기 위해 상대성 광 및 전자 현미경 검사를 사용하여 특정 표적 구조를 찾는 방법에 대한 좋은 이해가 있어야합니다.이 염색 기술은 부피 전자 현미경 검사법과 결합된 더 큰 규모의 EM을 위해 특히 eurovirus에서 세포 상호 작용을 조사하는 데 사용될 수 있었습니다. 글루타랄데히드, 또한 엔테에테르시드와 TCH는 매우 독성이 있으므로 보호복을 착용하고 이러한 재료를 사용할 때 연기 후드에서 작동해야합니다.

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Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Confocal 현미경 검사 법 그리고 형광 일생 화상 진 찰 Hyperspectral에 의해 발광 활용된 Oligothiophenes로 물 녹말 체 조직 이미징

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

시간 해결 된 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 빠른 그리드 준비

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...