Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
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Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación básica KBRI a través del Instituto de Investigación Cerebral de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (19-BR-01-08), y la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). Los plásmidos SCO1-APEX2 y HRP-KDEL fueron amablemente proporcionados por Hyun-Woo Rhee (Universidad Nacional de Seúl). Los datos de TEM se adquirieron en Brain Research Core Facilities en KBRI.

1. Cultivo celular con plato de cultivo de rejilla estampado y transfección celular con vector de plásmido SCO1-APEX2 y HRP-KDEL
<ol><li>Semilla 1 x 105 HEK293T células colocándolas en platos de cultivo con fondo de rejilla de vidrio de 35 mm en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO2 a 37 oC en el medio modificado de Eagle (DMEM) de Dulbecco complementado con suero bovino fetal 10%, 100 U/ml penicilina y 100 U/ml de estreptomicina.</li>
	<li>Al día siguiente de la sembración de l...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. 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D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

Determinar la localización celular de proteínas específicas a una resolución de nanómetro utilizando EM es crucial para entender las funciones celulares de las proteínas. Generalmente, hay dos técnicas para estudiar la localización de una proteína diana a través de EM. Una es la técnica de inmunooro, que se ha utilizado en EM desde 1960, y la otra es una técnica que utiliza etiquetas genéticamente codificadasrecientemente 16. Las técnicas tradicionales de inmunooro han empleado part?...

Las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER) son orgánulos celulares ligados a la membrana. Su conexión es necesaria para su función, y las proteínas relacionadas con su red han sido descritas1. La distancia entre las mitocondrias y la ER se ha notificado en aproximadamente 100 nm utilizando la microscopía de luz2; sin embargo, los recientes estudios de microscopía3 de superresolución y microscopía electrónica (EM)4 han revelado que es considerablemente más pequeño, de aproximadamente 10-25 nm. La resolución alcanzada en la microscopía de superresolución es inferior a EM, y el etiquetado específico es necesario. EM es una técnica adecuada para lograr un contraste de alta resolución suficiente para estudios estructurales de las conexiones entre las mitocondrias y la ER. Sin embargo, una desventaja es la información limitada del eje z porque las secciones delgadas deben ser aproximadamente 60 nm o más delgadas para la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM). Para obtener suficientes imágenes del eje z EM, se puede utilizar microscopía electrónica tridimensional (3DEM)5. Sin embargo, esto implica la preparación de cientos de secciones seriales delgadas de células enteras, que es un trabajo muy complicado que sólo unos pocos tecnólogos calificados han dominado. Estas secciones delgadas se recogen en rejillas TEM de un solo orificio recubiertas con película de formvar frágiles. Si la película se rompe en una faja, la toma de imágenes en serie y la reconstrucción del volumen no son posibles. La microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es una técnica popular para 3DEM que utiliza seccionamiento destructivo en bloque dentro de la cámara de vacío del microscopio electrónico de barrido (SEM) con un cuchillo de diamante (Dik-SBEM) o un haz de iones enfocado (FIB-SEM) 6. Sin embargo, debido a que esas técnicas no están disponibles en todas las instalaciones, sugerimos la tomografía de matriz7 utilizando seccionamiento en serie y SEM. En la tomografía de matriz, las secciones en serie cortadas con un ultramicrotomo se transfieren aun cubreobjetos de vidrio en lugar de a una rejilla TEM y se visualizan mediante microscopía de luz y SEM 8. Para mejorar la señal para la toma de imágenes de electrones de retrodispersión (EEB), utilizamosun protocolo de tinción EM en bloque que emplea células fijas de tetróxido de osmio (OsO 4) con tiocarbohidrazida osmiofílica (TCH)9,lo que nos permite obtener imágenes sin post-incorporación de doble tinción.
Además, se utilizó el marcador mitocondrial SCO1 (proteína de ensamblaje del citocromo c oxidasa 1)– ascorbato peroxidasa 2 (APEX2)10 etiqueta molecular para visualizar las mitocondrias a nivel EM. APEX2 es aproximadamente 28 kDa y se deriva de la soja ascorbato peroxidasa11. Fue desarrollado para mostrar la ubicación detallada de proteínas específicas a nivel EM de la misma manera que la proteína etiquetada con proteína fluorescente verde se utiliza en la microscopía ligera. APEX2 convierte 3,3' -diaminobenzidina (DAB) en un polímero osmiofílico insoluble en el sitio de la etiqueta en presencia del peróxido de hidrógeno cofactor (H2O2). APEX2 se puede utilizar como una alternativa al etiquetado tradicional de anticuerpos en EM, con una localización de proteínas a lo largo de toda la célula. En otras palabras, la proteína etiquetada APEX2 se puede visualizar mediante la osmicación específica11 sin etiquetado de inmunooro y permeabilización después de la ultracriosección. La peroxidasa de rábano picante (HRP) es también una etiqueta sensible que cataliza la polimerización dependiente H2O2de DAB en un precipitado localizado, proporcionando contraste EM después del tratamiento con OsO4. La secuencia de péptidos objetivo de ER HRP-KDEL (lys-asp-glu-leu)12 se aplicó para visualizar ER dentro de una célula entera. Para evaluar nuestro protocolo de utilización de etiquetas genéticas y tinción en bloque con osmio reducido y TCH (método rOTO), utilizando el efecto de osmication al mismo tiempo, comparamos el contraste de membrana con y sin el uso de cada etiqueta genética en la tinción rOTO en bloc. Aunque 3DEM con tomografía de matriz y tinción DAB con APEX y HRP se han utilizado, respectivamente, para otros fines, nuestro protocolo es único porque hemos combinado la tomografía de matriz para tinción 3DEM y DAB para mitocondrias y etiquetado ER. Específicamente, mostramos cinco células con y sin genes etiquetados con APEX en la misma sección, lo que ayudó a investigar el efecto de la modificación genética en las células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

Los orgánulos celulares, como las mitocondrias y el retículo endoplasmático (ER), crean una red para realizar una variedad de funciones. Estas estructuras altamente curvadas se pliegan en varias formas para formar una red dinámica dependiendo de las condiciones celulares. La visualización de esta red entre las mitocondrias y la sala de res ha intentado utilizar imágenes de fluorescencia de superresolución y microscopía de luz; sin embargo, la resolución limitada es insuficiente para observar las membranas entre las mitocondrias y urgencia en detalle. La microscopía electrónica de transmisión proporciona un buen contraste de membrana y resolución a escala de nanómetros para la observación de orgánulos celulares; sin embargo, es excepcionalmente lento al evaluar la estructura tridimensional (3D) de los orgánulos altamente curvados. Por lo tanto, observamos la morfología de las mitocondrias y la ER a través de la microscopía electrónica de luz correlativa (CLEM) y las técnicas de microscopía electrónica de volumen utilizando ascorbato peroxidasa 2 mejorado y tinción de peroxidasa de rábano picante. Se aplicó un método de tinción en bloque, seccionamiento en serie ultrafino (tomografía de matriz) y microscopía electrónica de volumen para observar la estructura 3D. En este protocolo, sugerimos una combinación de clem y microscopía electrónica 3D para realizar estudios estructurales detallados de las mitocondrias y la ER.

La figura 1 describe la programación y el flujo de trabajo de este protocolo. El protocolo requiere 7 días; sin embargo, dependiendo del tiempo dedicado a la toma de imágenes SEM, esto puede aumentar. Para la transfección celular, la confluencia de las celdas debe controlarse para no cubrir la parte inferior de toda la placa de rejilla (Figura1A). Una alta densidad celular podría impedir la identificación de la célula de interés durante el microscopio de luz y la observación EM....

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Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Presentamos un protocolo para estudiar la distribución de mitocondrias y retículo endoplasmático en células enteras después de la modificación genética utilizando microscopía electrónica correlativa de luz y volumen incluyendo ascorbato peroxidasa 2 y tinción de peroxidasa de rábano picante, seccionamiento en serie de células con y sin el gen objetivo en la misma sección, y la toma de imágenes en serie a través de microscopía electrónica.

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Esta técnica de microscopía electrónica de volumen se utiliza para realizar estudios biológicos que requieren la observación de una estructura 3D. Ofreciendo una varilla, una vista de jardinero y un almacenamiento de muestras antes de que se vuelva a tomar la imagen. Fx2 Asan diseñó las etapas de ruta que catalizan la deabilización para aumentar la prueba de electrones de las estructuras objetivo y se puede utilizar para localizar un objetivo específico de interés.Estas partículas combinan el uso de luz correlativa y la técnica de microscopía electrónica 3D para investigar las interacciones entre los orgánulos membranos y las células huésped. 16 a 24 horas después de la transfección, lave suavemente el cultivo con 250 microlitros de 30 a 37 grados de solución de fijación Celsius. Reemplazando rápidamente el lavado con 1,5 mililitros de solución de fijación fresca y colocando el cultivo en hielo durante 30 minutos.Al final de la incubación, enjuague las células con tres lavados de diez minutos en un mililitro de tampón de cacodilato de sodio molar 0,1 molar helado por lavado. Después del último lavado, agregue un mililitro de solución de glicina milimétrica de 0 a 4 grados Celsius 20 para una incubación de diez minutos sobre hielo seguida de tres lavados de cinco minutos con un mililitro de tampón de cacodilato de sodio molar fresco y frío por lavado. A continuación, etiquete las células con 500 microlitros de solución DAB recién preparada.E incubar las células en hielo durante aproximadamente cinco a cuarenta y cinco minutos. Cuando una mancha marrón claro sea visible bajo un microscopio de luz invertido, enjuague las células tres veces con un mililitro de tampón de cacodilato de sodio frío y fresco durante diez minutos por lavado. A continuación, utilice un microscopio invertido de contraste de fase para visualizar la tinción DAB a un aumento de 100 veces o superior y marque la parte inferior del vidrio donde se encuentra la región de interés.Para la preparación de muestras de bloques de microscopio electrónico, primero después de fijar las células con un mililitro de tetróxido de 2% reducido de tetróxido de osmio reducido durante una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la fijación, enjuague las células con tres lavados de cinco minutos y un mililitro de agua destilada fresca por lavado. Antes de tratar las células con un mililitro de solución TCH filtrada durante 20 minutos.Al final de la incubación, lavar las células tres veces en agua destilada como se acaba de demostrar y fijar las células con una incubación de 30 minutos en 2% reducido tetróxido de osmio. Al final de la segunda fijación, lavar las células tres veces con agua destilada y cubrir el cultivo con un mililitro de acetato de 1% de uranilo acuoso durante la noche a 4 grados celsius protegido de la luz. A la mañana siguiente, lave las células tres veces con agua destilada antes de mancharse con un mililitro de 60 grados Celsius calentó la solución de aspartato de plomo de Walton durante 30 minutos en un horno de 60 grados centígrados.Al final de la incubación, lave las células tres veces en agua destilada. E incubar el cultivo en una serie calificada de alícuotas de etanol de 20 minutos y 2 mililitros. Después de la última exposición al 100% del etanol, incubar las células durante 30 minutos en un mililitro de tres a un etanol a baja viscosidad incrustando mezcla media a temperatura ambiente.Al final de la incubación, sustituya el medio por un mililitro de etanol de uno a uno a un medio de mezcla de inserción de baja viscosidad para otra incubación de 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, reemplace el medio por un fresador de uno a tres etanol a medio de mezcla de baja viscosidad durante 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. A continuación, reemplace el medio con un mililitro de medio de incrustación de viscosidad 100% baja durante la noche, seguido de la incrustación de la muestra en una mezcla 100% de baja viscosidad incorporada durante 24 horas a 60 grados centígrados.Para el análisis de microscopía electrónica de transmisión, al día siguiente, utilice un microtoma ultra para obtener secciones de 90 nanómetros de espesor y observar la red bajo microscopía electrónica de transmisión a 200 kilovoltas. Antes de comenzar la preparación de la muestra, limpie los cubreobjetos de vidrio recubierto de óxido de estaño de indio con agitación suave en isopropanol durante 30 a 60 segundos. Al final de la agitación, drenar el exceso de alcohol y colocar los cubreobjetos en un ambiente libre de polvo.Cuando los cubreobjetos estén secos, utilice una recubridora de plasma para que los cubren los cubreobjetos descarte durante un minuto. A continuación, inserte los cubreobjetos en el soporte del sustrato y coloque el soporte de sustrato en el bote de cuchillo. Para obtener muestras para la microscopía electrónica de barrido, inserte el bloque de muestra incrustado en el soporte de muestra del ultramicrotoma.Y coloca el soporte en el bloque de recorte. Utilice una cuchilla de afeitar para recortar el exceso de resina alrededor de la posición objetivo de modo que la cara del bloque adquiera una forma trapezoidal o rectangular. Los bordes inicial y final deben ser estrictamente paralelos entre sí.No es fácil adquirir un gran número de secciones de serie. Sin embargo, debe tener los bordes delanteros y los bordes finales completamente paralelos. A continuación, inserte el soporte de la muestra en el brazo del ultramicrotoma.Coloque el cuchillo de diamante en el portacuchillas y llene el bote de cuchillos con agua destilada filtrada. A continuación, empuje cuidadosamente la manija del soporte para ajustar la posición del soporte de modo que el borde de los cubreobjetos esté cerca del cuchillo. Después de obtener la muestra, detenga el proceso de seccionamiento, abra lentamente el tornillo de sujeción del tubo y drene el bote de agua.Una vez completado el proceso de recogida de la cinta, retire el sustrato con el mango del dispositivo de sujeción y seque la cinta. El uso de plásmidos genéticamente etiquetados que expresan proteínas de interés, permite la identificación de las células diana trans infectadas después de la tinción de las proteínas etiquetadas. La microscopía electrónica de luz correlativa se puede utilizar para visualizar aún más el cultivo celular etiquetado.Por ejemplo, la mancha oscura generada por SCO1-APEX2 se observa exclusivamente en el espacio intermembrano mitocondrial y no en el espacio de matriz de las mitocondrias. Los plásmidos transfónicos de código con plásmidos SCO1-APEX2 y HRP-KDEL expresan una señal de electrones altamente densa en el espacio intermembrano mitocondrial y el retículo endoplasmático. Sin embargo, no se observa ninguna tinción de retículo endoplasmático en las células que están transfectadas con SCO1-APEX2 solamente.Para imágenes en serie mediante microscopía electrónica de barrido, se crea una visión general de toda la imagen de la matriz utilizando un detector de electrones de retro-retroactiva sobre un área grande. A continuación, la región de interés se coloca en la primera sección y se propaga a todas las demás secciones. Por último, la región de interés que contiene cinco celdas de destino se realiza una imagen de cinco píxeles con imágenes de nanómetro.La ampliación revela estructuras subcelulares detalladas como el aparato Golgi, las mitocondrias y el retículo endpolasmático. Las imágenes en serie revelan claramente que los contactos de retículo-mitocondria endoplasmáticos se producen en diferentes planos z. Usted debe tener una buena comprensión de cómo localizar una estructura objetivo específica utilizando luz correlativa y microscopía electrónica para investigar los efectos de una modificación de identidad específica.Estas técnicas de tinción combinadas con la microscopía electrónica de volumen podrían utilizarse para EM a mayor escala para investigar las interacciones celulares, especialmente en el eurovirus. Recuerde que el glutaraldehído, también el enteterocida y el TCH son muy tóxicos, así que asegúrese de usar ropa protectora y trabajar en una campana de humo cuando utilice estos materiales.

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Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

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Investigación

Bioquímica

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Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

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Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

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