Name: mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

Bu araştırma tarafından desteklenmektedir KBRI temel araştırma programı Kore beyin Araştırma Enstitüsü Bakanlığı Bilim ve BIT tarafından finanse (19-BR-01-08), ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) Grant Kore hükümeti tarafından finanse (MSIT) (No. 2019R1A2C1010634). SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL plazmids, Hyun-Woo Rhee (Seul Ulusal Üniversitesi) tarafından temin edildi. TEM verileri KBRı 'deki Brain Research Core tesisleri 'nde elde edildi.

1. SCO1-APEX2 ve HRP-KDEL Plasmid vektör ile desenli ızgara kültürü çanak ve hücre transfeksiyon ile hücre kültürü
<ol><li>Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, 35-mm cam ızgara-altta kültür yemekleri içine yerleştirerek% 5 Co2 ' de 37 °c ' de bulunan bir nemlendirici atmosferde, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (dmem) ile% 10 fetal Sığır serum, 100 U/ml ile tamamlayıcı Penisilin ve 100 U/mL streptomisin.</li>
	<li>Hücrelerin tohumlama sonrası gün, onlar% 50-60% konfluency y...

<ol>
	<li>Krols, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes+as+hubs+for+neurodegeneration.">Mitochondria-associated membranes as hubs for neurodegeneration.</a> Acta Neuropathologica. 131 (4), 505-523 (2016).</li><li>Svendsen, E. J., Pedersen, R., Moen, A., Bjork, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+perspectives+on+restraint+during+medical+procedures+in+paediatric+care:+a+qualitative+interview+study+with+nurses+and+physicians.">Exploring perspectives on restraint during medical procedures in paediatric care: a qualitative interview study with nurses and physicians.</a> International Journal of Qualitative Studies on Health and Well-being. 12 (1), 1363623 (2017).</li><li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 174 (7), 915-921 (2006).</li><li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context.">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> Journal of Microscopy. 259 (2), 80-96 (2015).</li><li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure.">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li><li>Burel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+3D+EM+and+correlative+microscopy+method+using+SEM+array+tomography.">A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography.</a> Development. 145 (12), (2018).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+staining+method+(OTO)+for+enhancing+contrast+of+lipid--containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide--fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide(TCH).">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid--containing membranes and droplets in osmium tetroxide--fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide(TCH).</a> The Journal of Cell Biology. 30 (2), 424-432 (1966).</li><li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APEX+Fingerprinting+Reveals+the+Subcellular+Localization+of+Proteins+of+Interest.">APEX Fingerprinting Reveals the Subcellular Localization of Proteins of Interest.</a> Cell Reports. 15 (8), 1837-1847 (2016).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Schikorski, T., Young, S. M., Hu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horseradish+peroxidase+cDNA+as+a+marker+for+electron+microscopy+in+neurons.">Horseradish peroxidase cDNA as a marker for electron microscopy in neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 165 (2), 210-215 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrakEM2+software+for+neural+circuit+reconstruction.">TrakEM2 software for neural circuit reconstruction.</a> PLOS ONE. 7 (6), 38011 (2012).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Kijanka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+immuno-gold+labeling+protocol+for+nanobody-based+detection+of+HER2+in+breast+cancer+cells+using+immuno-electron+microscopy.">A novel immuno-gold labeling protocol for nanobody-based detection of HER2 in breast cancer cells using immuno-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 199 (1), 1-11 (2017).</li><li>Ariotti, N., Hall, T. E., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+microscopic+detection+of+GFP-labeled+proteins+using+modular+APEX.">Correlative light and electron microscopic detection of GFP-labeled proteins using modular APEX.</a> Methods in Cell Biology. 140, 105-121 (2017).</li><li>Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-volume+en-bloc+staining+for+electron+microscopy-based+connectomics.">Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics.</a> Nature Communications. 6, 7923 (2015).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLOS Biology. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Horstmann, H., Vasileva, M., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photooxidation-Guided+Ultrastructural+Identification+and+Analysis+of+Cells+in+Neuronal+Tissue+Labeled+with+Green+Fluorescent+Protein.">Photooxidation-Guided Ultrastructural Identification and Analysis of Cells in Neuronal Tissue Labeled with Green Fluorescent Protein.</a> PLOS ONE. 8 (5), 64764 (2013).</li><li>Martell, J. D., Deerinck, T. J., Lam, S. S., Ellisman, M. H., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+using+the+genetically+encoded+APEX2+tag+in+cultured+mammalian+cells.">Electron microscopy using the genetically encoded APEX2 tag in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1792-1816 (2017).</li><li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li><li>Shi, Y., Wang, L., Zhang, J., Zhai, Y., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+target+protein+localization+in+3D+using+the+combination+of+FIB-SEM+and+APEX2.">Determining the target protein localization in 3D using the combination of FIB-SEM and APEX2.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 3 (4), 92-99 (2017).</li></ol>

EM kullanarak bir nanometre çözünürlükte belirli proteinlerin hücresel lokalizasyonu belirlenmesi proteinlerin hücresel işlevlerini anlamak için çok önemlidir. Genellikle, EM aracılığıyla bir hedef protein lokalizasyonu incelemek için iki teknikleri vardır. Bir immünogold tekniği, hangi EM 1960 beri kullanılan ve diğer bir teknik son zamanlarda geliştirilen genetik kodlu Etiketler16kullanarak olduğunu. Geleneksel immünogold teknikleri, etiketli protein yerini göstermek iç...

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) membran bağlı hücresel organellerdir. Onların bağlantı fonksiyonları için gerekli olan ve proteinleri ağ ile ilgili1tanımlanmıştır. Mitokondri ve ER arasındaki mesafe yaklaşık 100 Nm ışık mikroskobu kullanarak bildirilmiştir2; Ancak, son süper çözünürlüklü microskopi3 ve elektron mikroskobu (EM)4 çalışmalar yaklaşık 10-25 Nm, önemli ölçüde daha küçük olduğunu ortaya koydu. Süper çözünürlüklü mikroskopide elde edilen çözünürlük EM 'den daha düşüktür ve özel etiketleme gereklidir. EM, mitokondri ve ER arasındaki bağlantıların yapısal çalışmaları için yeterince yüksek çözünürlüklü kontrast elde etmek için uygun bir tekniktir. Ancak, ince bölümler geleneksel iletim elektron mikroskobu (TEM) için yaklaşık 60 Nm veya daha ince olması gerektiğinden, sınırlı z ekseni bilgileri dezavantajı. Yeterli EM z ekseni görüntüleme için üç boyutlu elektron mikroskobu (3DEM)5kullanılabilir. Ancak, bu tüm hücrelerin ince seri bölümlerin yüzlerce hazırlanması içerir, bu çok zor bir iştir sadece birkaç yetenekli teknolojistler hakim var. Bu ince bölümler, kırılgan formvar film kaplı tek delikli TEM ızgaraları üzerinde toplanır. Film bir gird üzerinde kırarsa, seri görüntüleme ve hacim yeniden yapılanma mümkün değildir. Seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu (SBEM) bir elmas bıçak (dik-SBEM) ya da bir odaklı iyon ışın (FıB-SEM) ile Tarama elektron mikroskop (SEM) vakum odası içinde yıkıcı en bloğun bölünmesi kullanan 3DEM için popüler bir tekniktir 6. ancak, bu teknikler tüm tesislerinde mevcut olmadığından, biz dizi tomografi7 seri kesme ve SEM kullanarak öneririz. Dizi tomografi, bir ultralotome kullanılarak kesilmiş seri bölümler bir Tem ızgara yerine bir cam lamel magazini aktarılır ve ışık mikroskobu ve SEM8aracılığıyla görselleştirildi. Backscatter Electron (BSE) görüntülemenin sinyalini geliştirmek için, osmiofilik thiocarbohidazid (TCH)9ile sabit hücreler olan bir en bloklu em boyama protokolüne (OSO4) Çift boyama sonrası katıştırma.
Ayrıca, mitokondriyal Marker SCO1 (sitokrom c oksidaz montaj protein 1) – askorbat peroksidaz 2 (APEX2)10 moleküler etiket em düzeyinde mitokondri görselleştirmek için kullanıldı. APEX2 yaklaşık 28 kDa ve soya askorbat peroksitase11türetilmiştir. Özel proteinlerin EM seviyesinde ayrıntılı yerini, yeşil floresan protein etiketli proteinin ışık mikroskobu içinde kullanıldığı şekilde göstermek için geliştirilmiştir. APEX2, kofaktör hidrojen peroksit (H2O2) varlığında etiketin yerinde çözünebilir bir osmiophic polimer içine 3, 3 '-diaminobenzidine (DAB) dönüştürür. APEX2, tüm hücrenin derinliği boyunca bir protein lokalizasyonu ile EM 'de geleneksel antikor etiketleme alternatifi olarak kullanılabilir. Başka bir deyişle, APEX2-etiketlenmiş protein, Ultra-kriyobölümlemeden sonra immünogeski etiketleme ve geçirgen olmadan spesifik osmikasyon11 ile görselleştirilebilir. Horserpu peroksidaz (HRP) Ayrıca, OsO4ile tedavi EDILDIKTEN sonra em kontrast sağlayan, lokalize bir çökelme Içine DAB H2O2bağımlı polimerizasyonu katalizleyen hassas bir etikettir. ER hedef peptid serisi HRP-KDEL (LYS-ASP-Glu-Leu)12 tüm hücre içinde er görselleştirmek için uygulandı. Genetik etiketlerin kullanılması ve en az osmiyum ve TCH (rOTO yöntemi) ile aynı anda osmikasyon etkisini kullanarak blok boyama ile ilgili protokollerimizi değerlendirmek için, membranı kontrast ile ve rOTO en bloğunda her genetik etiketin kullanmadan karşılaştırdık. Dizi tomografi ve DAB boyama ile APEX ve HRP ile 3DEM, sırasıyla, diğer amaçlar için kullanılmıştır, çünkü biz 3DEM için dizi tomografi ve mitokondri ve ER etiketleme için DAB boyama kombine var bizim protokol benzersizdir. Özellikle, biz hücrelerde genetik modifikasyon etkisini araştırırken destekli aynı bölümde APEX Tagged genleri ile ve olmadan beş hücre gösterdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:869px;" width="868">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16200</td>
			<td style="width:349px;">Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">19210</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Sodium cacodylate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Osmium tetroxide 4 % aqueous solution</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">16320</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Epon 812</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">14120</td>
			<td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ultra-microtome Leica ARTOS 3D</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">ARTOS 3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Uranyl acetate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">22400</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Lead citrate</td>
			<td style="width:123px;">EMS</td>
			<td style="width:123px;">17900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">35mm Gridded coverslip dish</td>
			<td style="width:123px;">Mattek</td>
			<td style="width:123px;">P35G-1.5-14-CGRD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glow discharger</td>
			<td style="width:123px;">Pelco</td>
			<td style="width:123px;">easiGlow</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Formvar carbon coated Copper Grid</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:123px;">01805-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fugene HD</td>
			<td style="width:123px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Glycine</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:275px;">3,3&#8242; -diaminobenzamidine (DAB)</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">D8001</td>
			<td>Hazardous chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30% Hydrogen peroxide solution</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">107210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">0.22 um syringe filter</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td style="width:123px;">16534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiocarbonyldihydrazide</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">223220</td>
			<td>Use only in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Potassium hydroxide</td>
			<td style="width:123px;">Fluka</td>
			<td style="width:123px;">10193426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">L-aspartic acid</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:123px;">A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">FEI</td>
			<td style="width:123px;">Tecnai G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:275px;">Indium tin oxide (ITO) coated glass coverslips</td>
			<td style="width:123px;">SPI</td>
			<td style="width:123px;">06489-AB</td>
			<td>fragil glass</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:123px;">BP2618-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Diamond knife</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">AT-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Inveted light microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">ECLipse TS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:275px;">Scanning electron microscopy</td>
			<td style="width:123px;">Zeiss</td>
			<td style="width:123px;">Auriga</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy

Mitokondri ve endoplazmik retikulum (er) gibi hücresel organeller, çeşitli fonksiyonları gerçekleştirmek için bir ağ oluşturur. Bu son derece kavisli yapılar, hücresel koşullara bağlı olarak dinamik bir ağ oluşturmak için çeşitli şekillerde katlanmış. Mitokondri ve ER arasında bu ağın görselleştirme süper çözünürlüklü floresan görüntüleme ve ışık mikroskobu kullanılarak denenmiştir; Ancak, sınırlı çözünürlük mitokondri ve ER arasındaki membranları ayrıntılı olarak gözlemlemek için yeterli değildir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi, hücresel organizerin gözlem için iyi membran kontrast ve nanometre ölçekli çözünürlük sağlar; Ancak, son derece eğri organelleri üç boyutlu (3B) yapısını değerlendirirken son derece zaman alıcı. Bu nedenle, mitokondri ve er 'in bağıntılı ışık-elektron mikroskobu (Clem) ve hacim elektron mikroskopi teknikleri ile gelişmiş askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama kullanılarak morfolojisini gözlemledik. 3B yapıyı gözlemlemek için en blok boyama yöntemi, ultra ince seri sekleme (dizi tomografi) ve hacim elektron mikroskobu uygulandı. Bu protokolde, mitokondri ve ER 'in ayrıntılı yapısal çalışmalarını gerçekleştirmek için CLEM ve 3D elektron mikroskobu kombinasyonunu öneriyoruz.

Şekil 1 , bu protokol için zamanlama ve iş akışını açıklar. Protokol 7 gün gerektirir; Ancak, SEM görüntüleme için harcanan zamana bağlı olarak, bu artabilir. Hücre transfeksiyon için, hücrelerin konflukans tüm ızgara plaka alt kapak değil olarak kontrol edilmelidir (Şekil 1a). Yüksek hücreli yoğunluk, ışık mikroskobu ve EM gözlem sırasında ilgi hücresinin tanımlanmasını engelleyebilir. Biz APEX2 ve HRP verimli kültür çanak sayısız kültürlü hü...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy at JoVE.com

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Bu hacimli elektron mikroskobu tekniği, 3 boyutlu bir yapının gözlemlemesi gereken biyolojik çalışmaların gerçeklemesi için kullanılır. Görüntü yeniden çekimlerden önce çubuk, saha görünümü ve örnek depolama alanı sunar. Fx2 Asan, hedef yapıların elektron testini artırmak için zayıflamayı katalize eden ve belirli bir ilgi hedefini bulmak için kullanılabilecek yol aşamalarını tasarlamıştır.Bu parçacıklar membranöz organeller ve konak hücreler arasındaki etkileşimleri araştırmak için korbeli ışık ve 3-B elektron mikroskobu tekniğinin kullanımını birleştirir. Transfeksiyondan 16 ila 24 saat sonra, kültürü 30 ila 37 derece santigrat fiksasyon çözeltisi 250 mikrolitre ile nazikçe yıkayın. Yıkamayı 1,5 mililitre taze fiksasyon çözeltisi ile hızlı bir şekilde değiştirin ve kültürü 30 dakika boyunca buza yerleyin.Kuluçka sonunda, üç on dakika yıkama başına buz gibi 0.1 molar sodyum cacodylate tampon bir mililitre yıkama hücreleri durular. Son yıkamadan sonra, buz üzerinde on dakikalık bir kuluçka için tabağa bir mililitre buz-soğuk 0 ila 4 derece 20 milimolar glisin çözeltisi ekleyin ve yıkama başına bir mililitre taze, soğuk 0,1 molar sodyum cacodylate tampon ile üç beş dakikalık yıkar. Ardından, hücreleri 500 mikrolitre taze hazırlanmış DAB çözeltisi ile etiketlayın.Ve hücreleri yaklaşık 5-45 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Ters ışık mikroskobu altında açık kahverengi bir leke görülebildiğinde, hücreleri bir mililitre taze, soğuk 0,1 molar sodyum kacodylate tamponuyla yıkama başına on dakika boyunca üç kez durulayın. Daha sonra, DAB boyamasını 100 kat daha yüksek bir büyütme veya daha yüksekte görselleştirmek ve ilgi alanının bulunduğu camın altını işaretlemek için faz kontrastı ters mikroskobu kullanın.Elektron mikroskop bloğu örnek hazırlanması için, ilk sonra bir mililitre ile hücreleri düzeltmek 2% azaltılmış osmiyum tetroksit bir saat için dört santigrat derece. Fiksasyon sonunda, üç beş dakikalık yıkar ve yıkama başına taze distile su bir mililitre ile hücreleri durulayın. Hücreleri bir mililitre filtrelenmiş TCH çözeltisi ile 20 dakika tedavi etmeden önce.Kuluçka sonunda, sadece gösterildiği gibi distile suda hücreleri üç kez yıkayın ve% 2 azaltılmış osmiyum tetroksit 30 dakikalık kuluçka ile hücreleri düzeltmek. İkinci fiksasyonun sonunda, hücreleri üç kez distile suile yıkayın ve bir mililitre sulu %1 uranyl asetat ile bir gecede ışıktan korunan 4 santigrat derecede kültürünü kapatın. Ertesi sabah, 60 derece santigrat bir mililitre ile boyama önce distile su ile hücreleri üç kez yıkayın 60 derece santigrat fırında 30 dakika walton kurşun aspartat çözeltisi ısıtılır.Kuluçka sonunda, hücreleri üç kez distile suda yıkayın. Ve 20 dakikalık 2 mililitre etanol aliquots bir dereceli serisi kültür kuluçka. Son %100 etanol maruziyetinden sonra, hücreleri oda sıcaklığında düşük viskoziteli katıştırma karışımı ortamına üç ila bir etanolün mililitresinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, oda sıcaklığında başka bir 30 dakika kuluçka için düşük viskoziteli gömme karışımı orta bir mililitre bir etanol ile orta değiştirin. Daha sonra, oda sıcaklığında ek bir 30 dakika için düşük viskoziteli gömme karışımı orta bir-üç etanol bir mililter ile orta değiştirin. Daha sonra, bir mililitre ile değiştirin 100% düşük viskoziteli gömme orta gecede, 60 santigrat derecede 24 saat boyunca% 100 düşük viskozite gömme karışımı örnek gömme ardından.İletim elektron mikroskobu analizi için, ertesi gün, 90 nanometre kalınlığında kesitler elde etmek ve 200 kilovolt iletim elektron mikroskobu altında ızgara gözlemlemek için ultra mikrotom kullanın. Numune hazırlamaya başlamadan önce, 30 ila 60 saniye boyunca isopropanol nazik ajitasyon ile indium Kalay Oksit kaplı cam kapakları temizleyin. Ajitasyonun sonunda, fazla alkolü boşaltın ve kapakları tozsuz bir ortama yerleştirin.Kapaklar kuruolduğunda, kapakları bir dakika boyunca kızdırmak için bir plazma kaplama kullanın. Daha sonra kapakları alt tabaka tutucuya takın ve substrat tutucuyu bıçaklı tekneye yerleştirin. Taramalı elektron mikroskobu için numune almak için, gömülü numune bloğunu ultramikrotomun numune tutucuya yerleştirin.Ve tutucuyu kesme bloğuna ayarlayın. Bloğun yüzünün yamuk veya dikdörtgen bir şekil kazanması için hedef pozisyonun etrafındaki fazla reçiyiyi kesmek için bir jilet kullanın. Önde gelen ve sondaki kenarlar birbirine kesinlikle paralel olmalıdır.Çok sayıda seri bölüm elde etmek kolay değildir. Ancak, öndeki kenarlara ve sondaki kenarlara tamamen paralel sahip olmak zorundasınız. Daha sonra, numune tutucuyu ultramikrotomun koluna takın.Elmas bıçağı bıçak tutucuya yerleştirin ve bıçak teknesini filtrelenmiş distile suyla doldurun. Daha sonra, kapak kapaklarının kenarının bıçağa yakın olması için taşıyıcı konumunu ayarlamak için tutucunun sapını dikkatlice itin. Numuneyi aldıktan sonra, kesme işlemini durdurun, tüpün bağlama vidasını yavaşça açın ve su teknesini boşaltın.Şerit toplama işlemi tamamlandığında, sıkma cihazının sapıyla alt katmanı çıkarın ve şeridi kurulayın. İlgi proteinleri ifade eden genetik etiketli plazmidlerin kullanımı, etiketlenmiş proteinler için boyama sonra transfected hedef hücrelerin belirlenmesini sağlar. Correlative ışık elektron mikroskobu daha sonra daha fazla etiketli hücre kültürünü görselleştirmek için kullanılabilir.Örneğin, SCO1-APEX2 tarafından üretilen koyu leke mitokondrinin matris uzayında değil, sadece mitokondri intermembran uzayında görülür. Hem SCO1-APEX2 hem de HRP-KDEL plazmidleri ile transfected hücreleri mitokondriyal intermembran uzayda ve endoplazmik retikulumda son derece yoğun bir elektron sinyali ifade eder. Ancak sadece SCO1-APEX2 ile transfected hücrelerde endoplazmik retikulum boyama gözlenmez.Elektron mikroskobu tarayarak seri görüntüleme için, tüm dizi görüntüsünün genel bir özeti geniş bir alan üzerinde bir geri dağılım elektron dedektörü kullanılarak oluşturulur. Daha sonra, ilgi bölgesi ilk bölüme yerleştirilir ve diğer tüm bölümlere yayılır. Son olarak, beş hedef hücre içeren ilgi bölgesi beş nanometre görüntülenmiş piksel ile görüntülenir.Büyütme Golgi aparatı, mitokondri ve enpolasmik retikulum gibi ayrıntılı hücre altı yapıları ortaya çıkarır. Seri görüntüleme, endoplazmik retikulum-mitokondri kontakları farklı z-düzlemlerde meydana geldiğini açıkça ortaya koymaktadır. Belirli bir kimlik değişikliğinin etkilerini araştırmak için korenik ışık ve elektron mikroskobu kullanarak belirli bir hedef yapının nasıl bulunabildiğini iyi anlamalısınız.Hacim elektron mikroskobu ile birlikte bu boyama teknikleri özellikle eurovirüs hücresel etkileşimleri araştırmak için daha büyük ölçekli EM için kullanılabilir. Glutaraldehit unutmayın, ayrıca enteterocide ve TCH çok toksik, bu yüzden koruyucu giysiler giymek ve bu malzemeleri kullanırken bir duman başlık çalışmak için emin olun.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

SCIENTISTS IN ACTION

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Amiloid doku Imaging ile Işıksaçan konjuge Oligothiophenes Hyperspectral tarafından Confocal mikroskobu ve floresan ömür boyu görüntüleme lekeli

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

Analysis of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Tek Molekülgözlem için DNA Origami Nanoyapılar üzerinde Dynein ve Kinesin Motor Toplulukları üretimi

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Zaman Çözümlü Cryo-Elektron Mikroskopisi için Hızlı Şebeke Hazırlığı

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskopisi: Numuneden Yapıya

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...