Name: preparation of graphene-supported microwell liquid cells for in situ transmission electron microscopy
Uploaded: 2019-07-15T12:30:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Agradecemos a Tilo Schmutzler por la preparación de la solución HAuCl 4. Además, agradecemos a R. Christian Martens por la lectura de pruebas. Apoyo financiero de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a través del Grupo de Formación de Investigación GRK 1896 "Microscopíain situ con electrones, rayos X y sondas de escaneo" y a través del Cluster of Excellence EXC 315/2 EAM "Ingeniería de Materiales Avanzados" es agradecido reconocido.

1. Fabricación de plantillas de células líquidas basadas en micropozos
<ol><li>Retire los residuos orgánicos y las capas de óxido nativo de una oblea de silicio de 175 m de espesor, única cristalina, dopada en boro (1 – 30) mm, 100 mm de diámetro (100). Aplique un paso de oxidación con H2O2 y TMAH, seguido de una inmersión de HF en 1 – 5% de solución de HF.</li>
	<li>Oxidar térmicamente la oblea en una atmósfera seca de oxígeno a 800 oC para cultivar una capa de óxido con un espesor de 11 nm (Figura2a). 3% El dicloroteno (DCE) se utiliza para unir la contaminación metálica.</li>
	<li>Deposite una capa estequiométrica si3N4 a través de la deposición de vapor químico a baja presión (LPCVD). El espesor de la capa Si3N4 define la profundidad del pozo. Elija un valor adecuado para el experimento planificado (por ejemplo, 500 nm) (Figura2b).</li>
	<li>Definir la geometría del pozo lateral estructurando la parte frontal mediante fotolitografía y grabado de iones reactivos (RIE) (Figura2c). Las dimensiones adecuadas son, por ejemplo, estructuras circulares con radio de 2,5 m dispuestos en matrices hexagonales. Elija la distancia del pozo cuidadosamente (por ejemplo, 5 m), para evitar inestabilidades en la estructura.</li>
	<li>Depositar otros 20 nm de estequiométrica Si3N4 por LPCVD, que forma la membrana inferior de la célula líquida (Figura 2d). Siga el procedimiento descrito anteriormente (véase el paso 1.3).</li>
	<li>Utilice un segundo paso de fotolitografía/RIE para estructurar la parte posterior que más tarde define las dimensiones geométricas del marco LC y sus ventanas TEM (Figura 2e) (Diámetro del fotograma: 3 mm).</li>
	<li>Mediante micromecanizado a granel en 20% KOH a 60 oC, retire el Si en el área predefinida y cree una membrana Si3N4 independiente (Figura2f).</li>
	<li>Retire los iones metálicos residuales en un paso de limpieza final con una solución de 10% HCl y agua desionizada (DI).</li>
</ol>2. Transferencia de grafeno a las rejillas TEM
<ol><li>Humedezca el tejido sobre el que se coloca el poco capa adquirida comercialmente (6 – 8) CVD-grafeno en PMMA. Sumerja el grafeno recubierto de PMMA en un plato de Petri lleno de agua DI (Figura3a). NOTA: El número de capas de grafeno se puede determinar utilizando técnicas factibles32,33.</li>
	<li>Coloque la capa de grafeno en un papel de filtro y córtela en trozos adecuados para cubrir todos los pozos fabricados (por ejemplo, 4 mm2) (Figura3b).</li>
	<li>Vuelva a sumergir las piezas cortadas en el plato Petri (Figura3c).</li>
	<li>Utilice una rejilla TEM recubierta con una capa de soporte de carbono agujero para pescar las piezas producidas fuera del agua DI. Para ello, sumerja cuidadosamente la rejilla en el agua y capture el grafeno flotando en la superficie. Sostenga la rejilla con pinzas anticapilares (Figura3d,e). NOTA: Tenga cuidado de que el sitio de grafeno de la pila de grafeno-PMMA permanezca en la parte superior durante todo el procedimiento. De lo contrario, la posterior eliminación de PMMA despegará la capa de grafeno.</li>
	<li>Deje que las sábanas se sequen durante unas horas.</li>
	<li>Retire la capa de protección de PMMA en un baño de acetona durante 30 minutos y agregue consecutivamente más pasos de limpieza sumergiendo en etanol y agua DI sin secar la muestra en el medio. Utilice un recipiente plano (por ejemplo, un plato de Petri) para simplificar la transferencia de muestras después.</li>
	<li>Seque la muestra después durante 30 minutos en condiciones ambientales.</li>
</ol>3. Preparación de especímenes
<ol><li>Preparar la muestra para su incorporación en el GSMLC. Para ello, preparar una solución de stock de 1 mM resolviendo 196.915 mg de cristales HAuCl43H2O en 0,5 L de agua DI.</li>
	<li>Tome la cantidad deseada de muestra de la solución en stock. En la parte de este, se aplica 0,5 l. Esto se puede hacer utilizando una jeringa o una pipeta Eppendorf.</li>
</ol>4. Carga GSMLC
<ol><li>Enjuague la plantilla de celda líquida fabricada con acetona y etanol.</li>
	<li>Aplicar un ambiente O2/N2 (20%/80%) plasma durante 5 min para mejorar la humectabilidad de la membrana.</li>
	<li>Dispensar 0,5 l de solución de muestras en la plantilla o en la capa de grafeno. Asegurar un procedimiento de trabajo suave para minimizar los cambios en la concentración debido a la evaporación.</li>
	<li>Coloque la cuadrícula TEM en la capa Si3N4 micro-patrón con el grafeno mirando a la plantilla. Presione la cuadrícula TEM recubierta de grafeno en la plantilla. Tenga cuidado de no destruir la membrana inferior Si3N4.</li>
	<li>Eliminar el exceso de solución con un tejido para acelerar el secado celular y así mitigar los cambios de concentración (Figura4a). Después de aprox. 2 – 3 min, la interacción de grafeno-Si3N4 van-der-Waals sella suficientemente la célula líquida (Figura4b). Alternativamente, deje que la célula se seque completamente sin eliminar el exceso de solución. Este último ofrece una mayor tasa de éxito en el procesamiento de células. Sin embargo, se espera que los cambios de concentración basados en evaporación en la solución de muestras sean más graves al utilizar este enfoque. NOTA: El proceso de secado exitoso se puede verificar con un cambio de contraste en la periferia (comparar la figura 4a,b).</li>
	<li>Retire con cuidado la rejilla TEM con una pinza empujando una punta de pinza entre la rejilla y el marco GSMLC. NOTA: Los movimientos de erupción pueden romper la membrana subyacente. Para reducir el daño de la fuerza de cizallamiento, comience desde el sitio de la cuadrícula paralelo al borde de la ventana más pequeño.</li>
	<li>Compruebe si al menos una membrana del GSMLC sigue intacta mediante microscopía óptica (Figura4c). Si todas las membranas estuvieran rotas, LCTEM sería imposible.</li>
</ol>5. TEM Imaging y análisis de vídeo
<ol><li>Cargue la muestra en un (S)TEM directamente después de la preparación utilizando un soporte TEM estándar. NOTA: Como se informa para GLCs19, GSMLCs pueden secarse con el tiempo. Por lo tanto, se debe minimizar el tiempo entre la carga y la creación de imágenes.</li>
	<li>Imagen de la muestra con una técnica de imagen adecuada, dependiendo tanto de la muestra como del microscopio. Aquí, se utiliza un dispositivo (S)TEM operado a una tensión de aceleración de 300 kV. Utilice una dosis baja para minimizar los artefactos inducidos por el haz y un corto tiempo de exposición para evitar el desenfoque relacionado con el movimiento34. En caso de experimentos a largo plazo, bloquee el haz para reducir el daño por radiación. NOTA: Debido a una mejor resolución temporal, TEM debe preferirse sobre STEM para análisis cinéticos34 y reducción de la reducción de la reducción de la reducción de iones35. STEM, sin embargo, es preferido para la investigación de capas líquidas gruesas y elementos de alta Z debido a su mayor resolución espacial en muestras gruesas34,35.</li>
	<li>
Método de segmentación de imágenes
	<ol>
<li>Utilice una plataforma de procesamiento de imágenes adecuada para extraer características de interés. Para el seguimiento y análisis de partículas, utilice el código abierto ImageJ-distribution FIJI36.</li>
		<li>Utilice la función Analizar partículas para obtener información precisa (área proyectada, barycenter) de cada partícula en cada fotograma. NOTA: Esta función requiere imágenes binarias.</li>
		<li>Conecta las partículas entre los fotogramas con la ayuda del plugin TrackMate37. De forma predeterminada, TrackMate está buscando partículas brillantes sobre un fondo oscuro, así que invierta las imágenes (en el caso de BF-TEM) antes de iniciar TrackMate.</li>
		<li>Combine los resultados de TrackMate y Analyze Particles con un script adecuado utilizando el ecosistema de código abierto basado en Python SciPy38,39.</li>
		<li>Utilice FIJI para extraer los contornos precisos de estructuras más complejas como las dendritas. Aquí, Analizar partículas se puede aplicar, también (ver recuadro de la Figura 6a). NOTA: Puede ser factible analizar las características de interés manualmente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

A diferencia de las células líquidas disponibles en el comercial, los SGSM hechos a medida tienen la ventaja de que se pueden diseñar para caber en soportes TEM fácilmente disponibles y no requieren un costoso soporte TEM de celda líquida dedicado.
La arquitectura GSMLC demostrada aquí combina aspectos de SiLC y GLC que potencialmente podrían conducir a ventajas únicas. Por un lado, los SiLC permiten una determinación precisa de la posición y la forma de la célula, pero requieren membranas Si3N4 relativamente gruesas para reducir los efectos de abultamiento y, en última instancia, reducir la resolución alcanzable. Los GLC, por otro lado, exhiben paredes de membrana excepcionalmente delgadas que consisten en grafeno, pero sufren de tamaños y posiciones de bolsillo aleatorios. Mediante la combinación de estos dos enfoques de membrana a través de GSMLCs, la limitación de resolución causada por los límites celulares35 se puede omitir. Como la estructura del pozo se fabrica directamente en la capa Si3N4, la membrana Si3N4 real se puede construir incluso más pequeña que en los SiLC, simplificando los análisis HRTEM que ya se ha demostrado en GSMLCs6 . Aún así, cabe señalar que HRTEM en general es posible con Los SiLCs, asícomo 48. Además, grandes áreas de visualización se pueden realizar sin abultamiento severo de ventanas debido a las pequeñas áreas de membrana de las cámaras de muestras individuales. De este tipo, el aumento del espesor relacionado con el abultamiento35 se puede descartar en gran medida, como lo muestran los duques y otros49. Esto se muestra en la Figura7, donde se muestra una imagen STEM de campo oscuro anular de ángulo alto (HAADF) representativa de al cargado GSMLC. Esta imagen fue adquirida usando un sistema de doble viga. Dado que el brillo de la imagen adquirido en esta configuración está directamente relacionado con el grosor de la muestra, es claramente visible que los micropozos sellados exhiben sólo pequeños abultamientos negativos. 24 han demostrado que el abultamiento negativo y el secado parcial del pozo visible en la Figura 7 depende del diámetro del pozo. Reducir el diámetro del pozo es, por lo tanto, un enfoque factible para homogeneizar aún más el espesor del líquido.
Debido a la forma de bolsillo de equilibrio de los GLC, el espesor del líquido también depende en gran medida del sitio35. Los SiLC siguen el diseño de dos membranas derivadas de diferentes obleas Si. Al reemplazar la membrana superior Si3N4 por grafeno, se simplifica la fabricación de células líquidas. Esto significa que se puede evitar la posible delaminación de dos Si-wafers unidos durante los siguientes pasos de grabado húmedo y se omite la alineación de dos piezas de obleas durante la carga celular. La superficie plana en un lado de esta arquitectura celular permite métodos de análisis in situ complementarios como el análisis EDXS de la muestra6,que está restringido en las arquitecturas SiLC convencionales por efectos de sombra en bordes Si empinados50 .
El sellado de micropozos prepatrónizados con grafeno tanto en la parte inferior como en la parte superior del pozo se ha demostrado antes de24,25. La aplicación de dos membranas de grafeno puede mejorar la resolución alcanzable. Una doble transferencia de grafeno, sin embargo, complicaría aún más el proceso de preparación; sobre todo porque este ha demostrado ser el paso de preparación más sensible (ver más abajo). Además, se espera que el abultamiento de membrana discutido anteriormente sea aún más crítico en el caso de dos membranas de grafeno, porque el grafeno es mucho más flexible que una capa de Si3N4. En esas arquitecturas, los micropozos se construyeron utilizando fresado secuencial de haz iónico enfocado (FIB). Si bien este enfoque ha demostrado producir resultados de alta calidad, el fresado FIB es una técnica de producción celular complicada y costosa. Sin embargo, el uso de técnicas de patrón de un solo disparo masivamente paralelas que ya son estándar en la industria de semiconductores de hoy en día, como la nanoimpresión o la fotolitografía, tiene la principal ventaja de ser rápido, barato y escalable para la producción en masa.
Cabe señalar que el enfoque aquí presentado no permite la operación del flujo de líquido, lo que es alcanzable por otros dibujos y modelos28. Dado que la carga y el volumen de líquido son comparables para GSMLCys y GLCs, se puede evitar una contaminación de alto vacío debido a la rotura de la membrana19. Esto elimina la necesidad de una comprobación de sello engorrosa. Aunque se han combinado las ventajas de los SiLC y los GLC, las desventajas de ambos enfoques siguen estando presentes en los GSMLC. La fabricación de las células requiere una infraestructura de salas limpias para la tecnología de silicio, que no está necesariamente presente en los laboratorios TEM. Además, la carga de líquidos no es trivial. Requiere un entrenamiento dedicado, similar a las células de grafeno. Sin embargo, esto también es cierto para los sistemas disponibles comercialmente. Aquí, el paso de preparación más sensible es la eliminación de TEM-grid después de la transferencia de grafeno porque es probable que los movimientos de erupción o el nerviosismo rompan la capa Si3N4. Las ventanas de membrana redundantes, sin embargo, mejoran las posibilidades de preservar al menos un área de membrana. Como consecuencia, el rendimiento (cantidad de chips GSMLC operables) logrado por unexperimentador entrenado es de tres de cuatro 6, y por lo tanto supera el alcanzado con células basadas en grafeno (uno a dos de cuatro)19.
Al igual que con los GLC, la encapsulación líquida en GSMLCs se basa en las interacciones van-der-Waals18. En consecuencia, la contaminación de la interfaz podría reducir la tasa de éxito en el procesamiento de GSMLCs19. Además, dependiendo de la constante Hamaker de la fase líquida a encapsulada, las características de humectación durante el procedimiento de carga (y por lo tanto el rendimiento alcanzable) pueden diferir51 y por lo tanto la preparación puede ser complicada. Nuestra experiencia muestra que este es el caso si, por ejemplo, las especies anfifílicas están presentes.
La arquitectura GSMLC permite una configuración flexible de profundidades, lo que permite adaptarse a varios requisitos previos experimentales. Por otra parte, la arquitectura es adecuada para las investigaciones de tomografía electrónica en un amplio rango de ángulo de inclinación de 75o, lo que también permitiría la tomografía de electrones in situ 52. Por lo tanto, la tomografía in situ y post mortem de la muestra en líquido también podría establecerse con GSMLCs.

La ciencia de los materiales modernos, la química y la biología celular requieren una comprensión profunda de los procesos y efectos dinámicos subyacentes a escala submicrones. A pesar del poder de las técnicas avanzadas de microscopía óptica, como la microscopía de fluorescencia de agotamiento de emisiones estimuladas1,las técnicas de imagen directa para acceder a morfologías detalladas requieren microscopía electrónica. En particular, se ha demostrado que la microscopía electrónica de transmisión in situ (escaneo) (S)TEM ilumina información valiosa sobre la dinámica de los procesos encapsulando líquidos en células dedicadas y herméticas al vacío2. Diversos experimentos como investigaciones cuantitativas de la formación de nanoestructuras cinética y termodinámica3,4,5,6, imágenes de muestras biológicas7, 8 , 9 , 10 y estudios de los mecanismos relacionados con el almacenamiento de energía11,12 junto con estudios exhaustivos de la dinámica del proceso de corrosión13 o nanoburbuja física14,15, 16 han desentrañado muchos fenómenos utilizando (S)TEM que no eran accesibles utilizando técnicas de microscopía estándar.
Durante la última década, se han establecido dos enfoques principales para realizar teM de células líquidas in situ (LCTEM). En el primer enfoque, el líquido se encapsula en una cavidad entre dos membranas Si3N4 producidas a través de la tecnología de proceso Si17,mientras que en la segunda, se forman pequeñas bolsas líquidas entre dos láminas de grafeno o óxido de grafeno 10,18. La manipulación tanto de células líquidas a base de silicio (SiLC) como de células líquidas a base de grafeno (GLC) se ha demostrado19,20,21. Aunque ambos enfoques han sufrido mejoras significativas22,23,24,25,todavía carecen de la combinación de las ventajas respectivas. En general, existe un equilibrio entre encapsular la muestra en bolsillos de grafeno a menudo indefinidos con un pequeño volumen de líquido que permite imágenes de alta resolución18,y volúmenes celulares bien definidos que dan como resultado membranas más gruesas y capas líquidas, que proporcionan un entorno más cercano a la situaciónnatural en el líquido a granel26 a expensas de la resolución 2. Además, algunos experimentos dependen de un flujo líquido26,27 que sólo se ha realizado en arquitecturas SiLC y requiere un soporte TEM dedicado28.
Aquí, presentamos la fabricación y manipulación de un enfoque de células líquidas para LCTEM in situ de alto rendimiento a través de células líquidas de micropozo sostenitos compatibles con grafeno (GSMLCs) para análisis TEM. En la Figura 1se presenta un boceto de la GSMLC. Los GLOC han demostrado ser capaces de permitir resultados in situ de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM)6 y también son factibles para la microscopía electrónica de barrido in situ 29. Su marco basado en la tecnología Si permite la producción en masa de células con forma reproducible con espesor líquido a medida y membranas extradelgadas de una sola oblea. La membrana de grafeno que cubre estas célulastambién mitiga las perturbaciones inducidas por haz de electrones 8,30,31 ya que el haz de electrones pasa primero a través de la membrana superior del grafeno. La topografía plana de las células permite métodos de análisis complementarios como la espectroscopia de rayos X de dispersión energética (EDXS)6 sin efectos de sombra derivados de la propia célula líquida, lo que permite una variedad de in situ de alta calidad experimentos de microscopía electrónica de células líquidas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>50488858</td>
			<td>VLSI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>own production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Anti-Capillary tweezers</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>LH72.1</td>
			<td>0203-N5AC-PO Dumoxel alloyed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>85651.360</td>
			<td>VLSI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI Is Just ImageJ</td>
			<td>FIJI.sc</td>
			<td>Version 1.51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids</td>
			<td>Plano GmbH</td>
			<td>S173-8</td>
			<td>R 2/2 Au 300 mesh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAuCl4 &#183; 3 H2O crystal</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>36400.06</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jupyter Notebook</td>
			<td>Project Jupyter</td>
			<td>Version 5.7.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matplotlib-Package</td>
			<td>John Hunter, Darren Dale, Eric Firing, Michael Droettboom and the Matplotlib development team</td>
			<td>Version 3.0.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NumPy-Package</td>
			<td>NumPy developers</td>
			<td>Version 1.15.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pandas-Package</td>
			<td>AQR Capital Management, LLC, Lambda Foundry, Inc. and PyData Development Team</td>
			<td>Version 0.23.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td>Version 3.7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scipy-Package</td>
			<td>SciPy developers</td>
			<td>Version 1.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seaborn-Package</td>
			<td>Michael Waskom</td>
			<td>Version 0.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Si wafer</td>
			<td>Siegert Wafer GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Thin silicon (100) wafer 175 +/-5 &#181;m, 4&#34;, p-type, boron doped (1-30 Ohm cm), double-sided polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single tilt TEM holder</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td>Ensure that cell fits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope</td>
			<td>Philips</td>
			<td>CM 30 (S)TEM</td>
			<td>300 kV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trivial Transfer Graphene</td>
			<td>ACS Material</td>
			<td>TTG60011</td>
			<td>PMMA-covered, 6 -- 8 MLs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of graphene-supported microwell liquid cells for in situ transmission electron microscopy

La fabricación y preparación de células líquidas de micropozo sin grafía (GsmLC) para microscopía electrónica in situ se presenta en un protocolo escalonado. La versatilidad de los GSMLC se demuestra en el contexto de un estudio sobre la dinámica de grabado y crecimiento de nanoestructuras de oro a partir de una solución precursora HAuCl 4. Los GSMLC combinan las ventajas de las células líquidas convencionales a base de silicio y grafeno al ofrecer profundidades de pozo reproducibles junto con la fabricación y manipulación de células fáciles de la muestra bajo investigación. Los GSMLC se fabrican en un solo sustrato de silicio que reduce drásticamente la complejidad del proceso de fabricación en comparación con los diseños de células líquidas basadas en dos obleas. Aquí, no se requieren pasos de proceso de unión o alineación. Además, el volumen de líquido cerrado se puede adaptar a los requisitos experimentales respectivos simplemente ajustando el espesor de una capa de nitruro de silicio. Esto permite una reducción significativa del abultamiento de la ventana en el vacío del microscopio electrónico. Por último, se presenta una evaluación cuantitativa de última generación de seguimiento de partículas únicas y formación de dendrita en experimentos de células líquidas utilizando sólo software de código abierto.

Después de la carga de la célula, una transferencia exitosa de grafeno se indica mediante una apariencia sombreada diferente en los pozos bajo un microscopio óptico. Esto es visible, por ejemplo, en la membrana derecha de la Figura 3c. Como se mencionó, es crucial quitar cuidadosamente la rejilla TEM para no romper la capa delgada Si3N4. En el caso de una membrana rota, los residuos lúcidas y curvos son claramente visibles en el microscopio óptico, como se muestra en las dos membranas izquierdas de la Figura 3c. Debido a las múltiples áreas de visualización en el diseño GSMLC utilizado, la célula se puede utilizar siempre y cuando al menos una membrana esté intacta. Las membranas rotas se pueden utilizar para la alineación teM sin exponer la muestra al haz de electrones.
Una encapsulación exitosa de la solución de la muestra se puede verificar durante la microscopía electrónica. La Figura 5 presenta micrografías individuales de Vídeo Suplementario1, donde la disolución de un conjunto de nanopartículas y el crecimiento de una estructura dendrítica se evalúa estadísticamente en un GSMLC. Además del movimiento inducido por la deriva de la imagen, los movimientos de partículas ortogonales individuales menores son visibles, lo que indica que las partículas en solución están presentes. Además, la prevalencia de la disolución de partículas demuestra que existe una reacción química húmeda que no sería posible sin un líquido exitoso que encierra. Otras indicaciones típicas para líquidos cerrados son la formación de burbujas inducida por haces 19 o el movimiento de partículas. La presencia de partículas Au en células con características de grafeno por sí sola no indica de manera concluyente un entorno líquido, ya que las partículas también podrían derivar de la reducción inducida por grafeno de HAuCl440. También se puede realizar una cuantificación de los picos de oxígeno del líquido cerrado mediante espectroscopia de pérdida de energía electrónica (EELS) para verificar un entorno líquido41.
Con el fin de obtener información sobre el crecimiento de partículas y la cinética de disolución, es importante investigar cada partícula individualmente en lugar de analizar el desarrollo de parámetros medios42. También es crucial excluir las partículas en los bordes del marco que sólo son capturadas parcialmente por la cámara porque los cambios de posición relacionados con el efecto de deriva de dichas partículas podrían confundirse como procesos de crecimiento o disolución. Se cree que el grabado es causado por especies oxidativas generadas por la radiolisis inducida por haz de electrones43. Para obtener estadísticas suficientes, se requiere un seguimiento computacional de partículas únicas. Mediante la estimación del exponente de crecimiento de la variación de radio equivalente de partículas individuales a lo largo del tiempo, se puede obtener información de la cinética de reacción subyacente. Para ello, es posible introducir un radio equivalente basado en el área de partículas proyectadas, incluso si no todas las partículas son completamente esféricas6,44. La Figura 5b muestra el seguimiento de radios equivalentes a lo largo del tiempo para seis partículas representativas que se resaltan en la Figura 5a. La Figura 5c muestra la distribución de la base de 73 partículas de disolución del presente estudio. Sólo se consideran las partículas en las que un modelo alométrico explica la disminución del radio a al menos el 50% (coeficiente de determinación ajustado).
Además, una estructura de ndrita emerge rápidamente después de unos 42 s en el mismo pozo representado en la Figura 6a. La formación de dendrita es otro proceso típico, bien documentado en células líquidas45,46. Para cuantificar el crecimiento de la dendrita, se analizan los contornos estructurales (véase el recuadro en la Figura 6a). La evolución del radio de la punta y la velocidad a lo largo del tiempo (véase la figura 6b,c) revela la relación hiperbólica esperada47 (Figura6d). El crecimiento de la dendrita es causado por la supersaturación local de Au-ions debido al grabado de partículas antes mencionado. En la Figura 5a,es claramente visible que las partículas todavía se están disolviendo mientras que el sistema sobresaturado se relaja en el crecimiento de la dendrita. Esto puede ser causado por variaciones de concentración local tanto en los Au-ions como en las especies oxidativas como resultado de la alta viscosidad del líquido en el GSMLC que se ha observado antes de6. Sin embargo, una discusión detallada de este fenómeno está fuera del alcance de este trabajo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig1.jpg"> Figura 1: Boceto de una GSMLC: Esquemas de la estructura de una célula líquida de micropozo compatible con grafeno. Reimpreso a partir de https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6. Los permisos adicionales deben dirigirse a la American Chemical Society (ACS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig2.jpg"> Figura 2: Fabricación de marcos GSMLC. El proceso de fabricación de marcos GSMLC se esboza esquemáticamente. (a) Oxidación de la oblea Si después de la limpieza. (b) LPCVD de Si3N4. (c) Lado frontal Si3N4 patrón por fotolitografía y RIE para definir el volumen celular. (d) Deposición de Si3N4 para formar la ventana de celda inferior. (e) Litografía posterior y RIE. (f) Micromecanizado a granel con KOH para crear una membrana Independiente Si3N4 que contenga microrpozos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig3.jpg"> Figura 3: Transferencia de nivel variable CVD-grafeno con capa de protección PMMA en una teM-cuadrícula. Se muestra la transferencia de pocos capas de GRAFeno CVD en PMMA a la parte superior de una rejilla TEM recubierta de carbono. (a) Inmersión del grafeno CVD de poca capa en PMMA en un plato de Petri lleno de agua DI. (b) La pila de grafeno/PMMA transferida en un papel de filtro se corta en trozos adecuados para cubrir los marcos GSMLC. (c) Reinmersión de una pieza de grafeno cortado/PMMA. (d) Transferencia de la capa de grafeno/PMMA a una rejilla TEM recubierta de carbono (e) Pila de grafeno/PMMA después de una transferencia exitosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig4.jpg"> Figura 4: Eliminación de la rejilla TEM superior. El proceso de secado de un GSMLC cargado se documenta con la ayuda de un microscopio óptico. (a) Una rejilla TEM recubierta de grafeno se coloca en la parte superior de la GSMLC directamente después de la carga. La capa de grafeno es visible como rectángulo turquesa que cubre las tres áreas de visualización. Sus contornos son esbozados aproximadamente por el rectángulo negro. (b) Una membrana casi completamente adherida es visible por el cambio de contraste entre la húmeda (oscura, en comparación con (a)) y el área adherida (turquesa) después de aproximadamente dos minutos. c Se muestra un GSMLC después del despegue de la rejilla TEM, que revela dos membranas rotas (izquierda y media), y una membrana con microrpozos cargados y sellados con éxito (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2.jpg"> Figura 5: Desarrollo representativo de radios de nanopartículas. Se ha rastreado el desarrollo del radio de 183 partículas individuales. (a) Secuencia de imágenes tomada de Vídeo suplementario 1. Se resaltan seis partículas representativas. Los círculos de color corresponden al radio equivalente obtenido. (b) Gráfica logarítmica de los radios de partículas. (c) El histograma de 73 partículas en las que se ha determinado un exponente alométrico negativo mediante una rutina automatizada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig6.jpg"> Figura 6: Dinámica de dendrita: La se analiza el radio de la punta de cinco ramas de dendrita. Las barras de error representan la desviación estándar respectiva. (a) Secuencia de imágenes tomada de Video Suplementario 1 que muestra la dendrita emergente, que es visible después de unos 42 s. El recuadro en la imagen de la derecha muestra los contornos de dendrita en evolución. Aquí, los contornos rosados corresponden a 42.09 s, rojo a 42.7 s, y púrpura a 43.3 s. (b) Desarrollo del radio de la punta (promediado) en el tiempo. (c) La velocidad media de la punta trazada con el tiempo. (d) El radio de punta promediado trazado meatímicamente contra la velocidad media de la punta, revelando una dependencia hiperbólica (curva naranja). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig7.jpg"> Figura 7: Imagen SEM de un GSMLC cargado: Se muestra una imagen SEM representativa adquirida en modo HAADF STEM en un SEM de un GSMLC cargado a baja tensión de aceleración (29 kV). Además de los prominentes micropozos de 5 m de ancho, se ve visiblen dos rejillas circulares de carbono perforadas parcialmente superpuestas (2 m de diámetro) derivadas de la transferencia de grafeno aclarada anteriormente. La primera rejilla de carbono proviene de una transferencia de grafeno sin éxito. Es claramente visible que el sombreado de membrana permanece en su mayoría constante sobre la región del pozo, pero se oscurece ligeramente hacia el centro del pozo. Esto explica un abultamiento débil y negativo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo suplementario 1: Vídeo in situ que muestra los resultados representativos de un estudio TEM de campo brillante de células líquidas de grabado de nanopartículas Au y posterior crecimiento de una estructura de dendrita causada por la supersaturación de la solución de muestra circundante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/Supplementary_Video_1.avi">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Preparación de células líquidas de micropozo compatibles con grafeno para microscopía electrónica de transmisión in situ

Se presenta un protocolo para la preparación de células líquidas de micropozo compatibles con grafeno para microscopía electrónica in situ de nanocristales de oro de la solución precursora HAuCl4. Además, se presenta una rutina de análisis para cuantificar la dinámica observada de grabado y crecimiento.

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...

La microscopía electrónica de células líquidas es una técnica poderosa para investigar nano características en C2 en medios líquidos a alta resolución y proporciona información única y en tiempo real sobre procesos dinámicos a escala nanométrica. La célula líquida micropocillos soportada por el grafeno combina las ventajas de las arquitecturas celulares basadas en la tecnología de grafeno y silicio. Permite la correlación con métodos analíticos, como la espectroscopia EDX, a la vista.La técnica nos permite seguir directamente los procesos de un material en líquidos, mientras ocurren. Esta observación in situ es el núcleo de nuestro grupo de formación en investigación. Microscopía in situ con electrones, rayos X y sondas de escaneo financiadas por la Fundación Alemana de Investigación.Demostrando el procedimiento será Diplom-Chemist, Robert Branscheid, un miembro del personal de mi laboratorio. Para comenzar, transfiera el grafeno a las rejillas TEM, primero humedeciendo el tejido que soporta las seis a ocho capas de grafeno CVD en PMMA. Tenga cuidado de que el agua no se aplique directamente a la membrana PMMA.Sumerja completamente el grafeno recubierto de PMMA en un plato de Petri lleno de agua DI, y luego use papel de filtro para recoger la capa de grafeno. Tenga cuidado de que el lado del grafeno de la pila de PMMA de grafeno se mantenga en la parte superior durante todo el procedimiento. Corte la capa de grafeno en trozos lo suficientemente grandes como para cubrir todos los pozos fabricados.Luego, vuelva a sumergir las piezas cortadas en el plato de Petri. A continuación, utilizando un par de pinzas anti-capilares, recoger una rejilla TEM recubierto con una capa de soporte de carbono agujero. Sumerja cuidadosamente la rejilla en el agua, y coja el grafeno flotando en la superficie.Deje que las sábanas se sequen durante unas horas. A continuación, retire la capa de protección contra PMMA transfiriéndola a un baño de acetona durante 30 minutos. Después del baño de acetona, sumerja inmediatamente la muestra en etanol y agua DI sin secar la muestra entre soluciones.Utilice un recipiente plano para retirar fácilmente la muestra después. Cuando haya terminado, retire la muestra del agua DI y séquela después durante 30 minutos en condiciones ambientales. Cree una plantilla de celda líquida líquida con micropocillos micro-patrones siguiendo el protocolo de texto.Enjuague la plantilla de celda líquida fabricada con acetona, seguida de etanol. A continuación, aplicar un plasma ambiente 20%oxígeno, 80%nitrógeno durante cinco minutos para mejorar la humectabilidad de la membrana. Dispensar 0,5 microlitros de la solución de muestra en la plantilla o en la capa de grafeno.Asegurar un procedimiento de trabajo suave para minimizar los cambios en la concentración debido a la evaporación. A continuación, coloque la cuadrícula TEM en la capa de nitruro de silicio micro-patrón con el grafeno orientado a la plantilla. Presione cuidadosamente la rejilla TEM recubierta de grafeno sobre la plantilla, asegurándose de no destruir la membrana inferior del nitruro de silicio.Retire el exceso de solución con un tejido para acelerar el secado celular y mitigar los cambios de concentración. Después de aproximadamente dos a tres minutos, observe un cambio de contraste mientras las interacciones del nitruro de silicio de grafeno Van der Waals sellan la célula líquida. A continuación, coloque la muestra bajo un microscopio óptico.Utilice un par de pinzas para eliminar cuidadosamente la rejilla TEM empujando la punta entre la rejilla y el marco de celda líquida de micropocillos compatible con grafeno. Para reducir el daño por fuerza, comience desde el sitio de la cuadrícula paralelo al borde más pequeño de la ventana. Asegúrese de que al menos una membrana de las células líquidas de micropocillos soportadas con grafeno siga intacta.Con un soporte TEM estándar, cargue la muestra en el soporte. Inmediatamente después de su preparación, cargue el soporte y la muestra en el microscopio electrónico de transmisión de barrido. I imagen de la muestra adecuadamente con respecto a las características de la muestra y del microscopio.Utilice una dosis baja para minimizar el artefacto preinducido y un breve tiempo de exposición para evitar el desenfoque relacionado con el movimiento. Para experimentos prolongados, bloquee el haz para reducir el daño por radiación. Después de adquirir imágenes, utilice una plataforma de procesamiento de imágenes adecuada para extraer características de interés.Para el seguimiento y análisis de partículas, utilice la distribución de código abierto ImageJ, Fiji. Después de cargar una imagen y convertirla en una imagen binaria, utilice la función analizar partículas para obtener información precisa sobre el área proyectada y el barincentro de la partícula para cada partícula en cada fotograma. Invierta la imagen original para que las partículas aparezcan como puntos brillantes.A continuación, conecte las partículas entre los fotogramas con la ayuda del plugin TrackMate. De forma predeterminada, TrackMate busca partículas brillantes sobre un fondo oscuro. Por último, combine los resultados de TrackMate y analice partículas con un script adecuado, utilizando el ecosistema de código abierto basado en Python, SciPy.Una encapsulación exitosa de la solución de muestra se puede verificar durante la microscopía electrónica. Este video muestra la disolución de un conjunto de nanopartículas, y el crecimiento de una estructura dendrítica. Con el fin de obtener información sobre el crecimiento de partículas y la cinética de disolución, es importante investigar cada partícula individualmente, en lugar de analizar el desarrollo de parámetros promedio.Mediante la estimación del exponente de crecimiento, alfa, de la variación de radio equivalente de partículas individuales a lo largo del tiempo, se puede obtener información de la cinética de reacción subyacente. Aquí se muestra la distribución de alfa, basada en 73 partículas de disolución. Solo se consideran las partículas en las que un modelo alométrico explica la disminución del radio al menos al 50%.Al final del video, emerge una estructura de dendrita. La formación de dendrita es otro proceso típico y bien documentado en células líquidas. Para cuantificar el crecimiento de la dendrita, se analizan los contornos estructurales.La evolución del radio de la punta y la velocidad a lo largo del tiempo revela la relación hiperbólica esperada. El crecimiento de la dendrita es causado por la supersaturación local de iones de oro debido al grabado de partículas antes mencionado. En esta parte del video, es claramente visible que las partículas todavía se están disolviendo, mientras que el sistema sobresaturado se relaja en el crecimiento de la dendrita.Esto puede ser causado por variaciones de concentración local tanto en los iones de oro como en las especies oxidativas. La carga líquida y el suhrf dependen en gran medida de la muestra de interés, ya que la adhesión al grafeno y los tiempos de secado requeridos pueden variar si se aplican diferentes soluciones de muestras. La arquitectura de células líquidas de micropocillos soportadas por el grafeno también permite métodos in situ complementarios como los rendimientos en EDSX.Además, el SEM en modo de transmisión y los experimentos de tomografía se han realizado con éxito. Después del desarrollo de esta técnica, se hizo posible desentrañar el mecanismo de crecimiento de oro, plata, kawsh-en, y otras partículas hasta la resolución atómica. Los resultados son un excelente acuerdo con las mediciones de resonancia plasmática adquiridas por nuestros colegas del departamento de física que también participan en el grupo de formación en investigación.Aunque no se muestra aquí, la producción del bastidor portador emplea especies corrosivas y tóxicas. Tenga cuidado durante el funcionamiento y tome las precauciones necesarias.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Investigación

Química

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

El radiomarcado y cuantificación de los niveles celulares de Fosfoinosítidos por acoplado a cromatografía líquida de alto rendimiento de flujo de centelleo

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

In Situ Monitoring of Diffusion of Guest Molecules in Porous Media Using Electron Paramagnetic Resonance Imaging

Monitoreo in situ de la difusión de las moléculas huéspedes en medios porosos Usando Resonancia paramagnética de electrones

A method is demonstrated to monitor macroscopic translational diffusion using electron paramagnetic resonance (EPR) imaging. A host-guest system with ...

In Situ Characterization of Boehmite Particles in Water Using Liquid SEM

In Situ Characterization of Boehmite Particles in Water Using Liquid SEM

In Situ Caracterización de partículas de bohemita SEM líquido con agua

In situ imaging and elemental analysis of boehmite (AlOOH) particles in water is realized using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Microscopia electrónica de transmisión de líquido de la célula para el rastreo de autoensamblaje de las nanopartículas

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Obtaining 3D Chemical Maps by Energy Filtered Transmission Electron Microscopy Tomography

Obtención de mapas 3D química energía filtrada tomografía de microscopia electrónica de transmisión

Energy filtered transmission electron microscopy tomography (EFTEM tomography) can provide three-dimensional (3D) chemical maps of materials at a ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching

Using Graphene Liquid Cell Transmission Electron Microscopy to Study in Situ Nanocrystal Etching

Usando el líquido celular microscopia electrónica de transmisión para estudiar in Situ el aguafuerte de Nanocrystal

Graphene liquid cell electron microscopy provides the ability to observe nanoscale chemical transformations and dynamics as the reactions are occurring in ...